專利名稱：一種喹諾酮類藥物的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測喹諾酮類藥物的化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，用于檢測動物組織(豬肉、雞肉、豬肝、雞肝)、水產品(魚、蝦等)、蜂蜜中的喹諾酮類藥物含量或殘留量。屬于免疫學檢測領域。
背景技術：
喹諾酮類抗菌藥(4-quinolones),又稱卩比酮酸類或卩比唳酮酸類,是一類較新的合成抗菌藥，該類藥物的開發(fā)可以追溯到1962年,Lesher從合成抗痕藥氯喹中分離出一種副產品-萘啶酸，喹諾酮類歷經(jīng)40多年的發(fā)展，共開發(fā)出了四代喹諾酮類藥物，共計50多種藥物。喹諾酮類抗菌藥以細菌的脫氧核糖核酸(DNA)為靶位，通過選擇性的抑制細菌 DNA促旋酶與拓撲異構酶IV而造成染色體的不可逆損害，而使細菌細胞不再分裂，主要作用于革蘭陰性菌的抗菌藥物，對革蘭陽性菌的作用較弱(某些品種對金黃色葡萄球菌有較好的抗菌作用)。喹諾酮抗菌藥按發(fā)明先后及其抗菌性能的不同，分為一、二、三、四代，第一代喹諾酮類抗菌藥的品種有萘唳酸(Nalidixic acid)和卩比咯酸(Piromidic acid)等，第二代喹諾酮類抗菌藥的品種有新惡酸(Cinoxacin)和甲氧惡喹酸(Miloxacin)等，第三代喹諾酮類抗菌藥的品種有諾氟沙星(Norfloxaicin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、培氟沙星(PerfIoxacin)、依諾沙星(Enoxacin)和環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)等，第四代喹諾酮類抗菌藥的品種有加替沙星(Gatifloxacin)與莫昔沙星(Moxifloxacin)等。喹諾酮類藥物可用于治療呼吸道感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染、消化系統(tǒng)感染及其他類的各種感染，還可用于抗腫瘤和抗病毒作用，但該類藥物對人體也存在很大的不良反應，如胃腸道反應、中樞反應、可誘發(fā)癲癰、影響軟骨發(fā)育、易產生結晶尿及易導致肝損傷等。喹諾酮類藥物殘留分析通常包括選用適當?shù)娜軇┨崛?，進一步利用液液萃取法、固相萃取法等進行凈化、濃縮，最后用高效液相色譜法(High performance liquidchromatography, HPLC)、高效毛細管電泳法(Capillary electrophorctic, CE)、液相色譜質譜聯(lián)用技術(Liquid chromatography-mas spectrometry,LC-MS)等方法進行檢測，有時還使用氣相色譜法(Gas chromatography, GC),高效薄層色譜法(High pefformancthinlayerchromatogram, HPTLC),微生物法(Microbiological assay, MA)、免疫分析法(Immunoassay, IA)等測定。目前的檢測方法主要是儀器分析的方法，而酶聯(lián)免疫分析方法，只能檢測一種或者幾種藥物，對于種類較多的喹諾酮類藥物還遠遠不能達到同時檢測多殘留的要求。酶聯(lián)免疫試劑盒因為操作簡單，省時，是各個國家檢測獸藥殘留的首選方法。化學發(fā)光免疫檢測方法具有特異性強、穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高、試劑穩(wěn)定且有效期長(6 18個月)等優(yōu)點，其檢測限比酶聯(lián)免疫法和理化檢測方法高幾個數(shù)量級。化學發(fā)光底物液是化學發(fā)光酶免疫檢測方法的關鍵試劑，配制出低成本且性能良好，適合國產儀器使用的的發(fā)光底物液，可降低化學發(fā)光方法的使用成本，有利于在基層的普及。建立穩(wěn)定的化學發(fā)光酶免疫分析方法，也是進行商品化學發(fā)光試劑盒的研制的基礎。建立喹諾酮類藥物多殘留化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測方法對于于嚴把食品安全的檢驗環(huán)節(jié)有重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種喹諾酮類藥物的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應用靈活、方便的特點。一種喹諾酮類藥物的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內的試劑；其特征在于，所述酶標板的各孔包被有以喹諾酮類藥物與卵清蛋白偶聯(lián)制成的包被抗原；所述試劑包括喹諾酮類藥物的單克隆抗體、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠的抗體、喹諾酮類藥物系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發(fā)光液。所述酶標板優(yōu)選乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學發(fā)光酶標板。所述酶標板的各孔包被有以喹諾酮類藥物與卵清蛋白偶聯(lián)制成的包被抗原；其中所述包被抗原濃度優(yōu)選20. O μ g/mL。所述喹諾酮類藥物系列標準溶液從喹諾酮類純品中稀釋得到，稀釋液為含有10%甲醇的O. 05m mol/L, pH = 7. 4的PBS,喹諾酮類標準品濃度分別是0ng/mL,0.1ng/mL,O. 3ng/mL,0. 9ng/mL, 2. 7ng/mL和8.1ng/mL,所述百分比為體積百分比。所述酶標羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液，其工作濃度優(yōu)選為I 2000。所述喹諾酮類藥物抗體是由諾氟沙星衍生物與牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的單克隆抗體，其工作濃度優(yōu)選為1: 32000。
所述化學發(fā)光液A液為魯米諾含量為O. 01M、對甲苯酚含量為O. OOlM pH = 8. 8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液，B液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2HP042. 82g,0. 75%的過氧化氫脲O. 64mL的溶液。所述魯米諾為化學發(fā)光底物，對甲苯酚為發(fā)光增強劑。所述濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaH2PO4 · 2H20 5. 74g、Na2HPO4 · 12H20 32. 6g的水溶液；所述濃縮洗滌溶液是含有體積分數(shù)O. 05 %吐溫-20的pH = 7. 4，O. lmol/L磷酸鹽緩沖液。所述包被溶液是每升水中含1. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉的溶液(CB)，pH =9. 5。所述封閉溶液是每升洗漆溶液中含IOg卵清蛋白(OVA, ovalbumin,也稱雞卵清白蛋白或雞卵白蛋白，由385個氨基酸殘基組成，分子量約45kDa)且加入質量為5%。NaN3的溶液，所述百分比為質量百分比。本發(fā)明溶液的配制本發(fā)明試劑盒中涉及的喹諾酮類藥物標準溶液、酶標羊抗鼠抗體溶液、喹諾酮類藥物抗體溶液、化學發(fā)光溶液及洗滌溶液及其配方對本發(fā)明試劑盒檢測的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是
1、喹諾酮類藥物標準溶液以常規(guī)方法將喹諾酮類藥物純品用含有10%甲醇的O. 05mmol/L, pH = 7. 4 的 PBS 配制成濃度分別為 0ng/mL,0.1ng/mL, O. 3ng/mL, O. 9ng/mL,2. 7ng/mL和8.1ng/mL的喹諾酮類藥物標準溶液，所述百分比為體積百分比。2、酶標羊抗鼠抗體溶液酶標羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用時用洗滌溶液配制成1: 2000的工作濃度。3、喹諾酮類藥物抗體溶液喹諾酮類藥物抗體是用人工免疫抗原免疫動物制得的單克隆抗體，將所得喹諾酮類藥物抗體用洗滌溶液稀釋成1: 32000的工作濃度。4、化學發(fā)光溶液A液為魯米諾含量為O. 01M、對甲苯酚含量為O. OOlM pH = 8. 8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液，B液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2H P042. 82g,0. 75%的過氧化氫脲O. 64mL的溶液。5、濃縮磷酸鹽緩沖液=NaH2PO4 · 2H20 5. 74g,Na2HPO4 · 12H20 32. 6g 溶于 IL 的去離
子水中。6、濃縮洗滌溶液按體積分數(shù)O. 05%將吐溫-20添加至pH = 7. 4，O. lmol/L磷酸鹽緩沖液中。7、包被溶液1. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉溶于IL水中，調節(jié)pH = 9. 5。8、封閉溶液配制10g OVA溶于IL洗滌溶液中，再加入重量比為5%。的NaN3。本發(fā)明酶標板的包被本發(fā)明中包被酶標板采用將喹諾酮類藥物-OVA偶聯(lián)物置于設定的包被溶液中，以設定的濃度，在37 °C恒溫箱中反應包被。本發(fā)明采用的是pH = 9. 5的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。本發(fā)明中微孔板中所包被的喹諾酮類藥物-OVA在堿性環(huán)境下可以很好的結合在微孔板塑料表面上，可以經(jīng)受多次洗板，采用的包被抗原濃度為20. O μ g/mL。包被好的微孔板可以用封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優(yōu)選0VA，需加入NaN3防止變質。喹諾酮類藥物抗體溶液和酶標羊抗鼠抗體溶液的制備本發(fā)明中喹諾酮類藥物抗體溶液、酶標羊抗鼠抗體溶液濃度是決定本發(fā)明中喹諾酮類藥物酶聯(lián)免疫測試試劑盒測定范圍及靈敏度的重要因素。本發(fā)明中涉及的喹諾酮類藥物抗體溶液可以用洗滌溶液稀釋成1: 32000的工作濃度。本發(fā)明中涉及的酶標羊抗鼠抗體溶液優(yōu)選用洗滌溶液配制的濃度為1: 2000。按照上述喹諾酮類藥物抗體溶液濃度和酶標羊抗鼠抗體溶液濃度制備的試劑盒可以達到很好的線性范圍(標準線范圍可以達到Ong/mL 8.1ng/mL)和很好的靈敏度(O.1ng/mL)?；瘜W發(fā)光溶液的配制本發(fā)明采用辣根過氧化酶標記底物發(fā)光系統(tǒng)，主要是魯米諾-過氧化氫系統(tǒng)。所述化學發(fā)光液A液為魯米諾含量為O. 01M、對甲苯酚含量為O. OOlM pH = 8. 8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液，B液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2HP042. 82g,0. 75%的過氧化氫脲O. 64mL的溶液。所述魯米諾為化學發(fā)光底物，對甲苯酚為發(fā)光增強劑。本發(fā)明的原理是將抗體-抗原反應的高度特異性與酶催化的高度靈敏性結合起來，利用酶催化底物的化學發(fā)光反應檢測產物濃度。
本發(fā)明的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準確的特點，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個數(shù)量級。有望在動物性食品(如水產品、動物組織、蜂蜜)中的喹諾酮類藥物殘留檢測中發(fā)揮重要作用。


圖1為諾氟沙星衍生物合成反應式。圖2為本發(fā)明化學發(fā)光反應式。圖3為本發(fā)明喹諾酮類藥物抗體的工作曲線。
具體實施例方式實施例1 :衍生物、免疫原、包被原及單克隆抗體的制備 (I)諾氟沙星衍生物合成A，將諾氟沙星Immol，溶于15mL三氯甲烷中，加入DCC2mmol，DMAP催化量，氨基丙酸叔丁酯1. 5mmol，室溫攪拌5h，TLC監(jiān)測原料消失，過濾，將液相水洗，無水NaS204干燥，柱層析純化(洗脫劑，乙酸乙酯/石油醚，1/5)。B，將上述產物溶于冰醋酸中，室溫攪拌2h，TLC監(jiān)測原料消失，減壓脫溶劑，將得到的粘稠物溶于Imol/LNaOH溶液，調節(jié)pH3 5，乙酸乙酯萃取，干燥，柱層析純化(洗脫齊U，乙酸乙酯/石油醚，1/1)，得喹諾酮類半抗原。(2)免疫原的合成A，A液制備取15mg諾氟沙星半抗原，溶解于ImL DMF中，取15EDC用O. 2ml水充分溶解后于加入溶解有半抗原的DMF中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液A。B，BSA偶聯(lián)稱取BSA40mg，使之充分溶解在3mL PBS (PH 7. 2)中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，C，透析用O. Olmol/IPBS 4度透析3d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質。分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩７Q取半抗原20mg和OVA 30mg,按上述步驟反應,包被抗原，供包被用。(3)喹諾酮類藥物單克隆抗體的制備A，動物免疫用上述制備出的免疫原(QNS-BSA)按100 μ g/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6 8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以免疫復合物100 μ g/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。B，細胞融合按常規(guī)方法進行，取免疫小鼠的脾細胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)混合，然后在45秒內緩慢加入預熱的融合劑(PEG4000)進行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時候進行全換液。C，雜交瘤細胞的篩選細胞融合后，待細胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初選采用間接ELISA方法，以包被抗原(預先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽性血清稀釋度)包被酶標板，加入被測孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD進行顯色反應。篩選出的陽性孔再用間接競爭ELISA方法篩選，先將細胞上清與100 μ g/mL的諾氟沙星等體積混合，37°C水浴作用30min，再加入到包被好的酶標板中。同時用PBS取代諾氟沙星作對照，其余步驟同上。若經(jīng)諾氟沙星阻斷后的OD45(lnm值下降到對照孔的50%以下，則判為陽性，經(jīng)2 3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進行亞克隆化。D，單克隆抗體制備將2 3次亞克隆建株后的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，收集上清液用間接ELISA測定效價，凍存；并取8 10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟O. 5mL/只，7 10日后腹腔注射雜交瘤細胞I 2X IO6/只，7 10日后抽取小鼠腹水，離心取上清，測定效價，并凍存?zhèn)溆?。實施? =ELISA檢測方法的建立(I)抗體與包被抗原濃度的優(yōu)選(方陣)縱向用每種包被抗原按80. O μ g/mL, 40. O μ g/mL, 20. 0 μ g/mL, 10. 0 μ g/mL, 5.0 μ g/mL, 2. 5 μ g/mL,1. 25 μ g/mL,0. 625 μ g/mL 的系列稀釋度包被酶標板，100 μ L/ 孔，置于37°C恒溫箱2h后,拍干；以150 μ L/孔封閉溶液封閉，37°C恒溫箱放置2小時,洗板一次，拍干；加入50 μ L/孔一系列稀釋的抗體(I 1000至I 512000)，再加入50 μ L/孔的1: 2000的辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG抗體，室溫(20 25°C )孵育15min，洗板五次，最后一次拍干；加入100 μ L/孔的化學發(fā)光液，測定發(fā)光強度值。以發(fā)光強度值隨包被抗原的濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋度為最佳濃度進行特異性測定。(2)抗體靈敏度的測定根據(jù)上述對抗體及包被抗原濃度的優(yōu)選實驗，申請人選擇并確定抗體濃度為I 32000，包被抗原濃度為20. O μ g/mL進行抗體的靈敏度的測定A，包被用O. 05M pH = 9. 6的碳酸鹽包被溶液將包被抗原配成20. O μ g/mL的溶液，每個聚苯乙烯板的反應孔中加100μ L，37°C恒溫箱2h。棄去孔內溶液，拍干。B,封閉用封閉溶液封閉上述已包被的酶標板，150 μ L/孔，37°C恒溫箱2h然后洗板一次，拍干。C，加樣加不同濃度的喹諾酮類藥物溶液50 μ L/孔，再加入50 μ L/孔以稀釋的喹諾酮類單克隆抗體((I 32000)與用洗滌溶液配制成的酶標羊抗鼠抗體工作液(I 2000)按體積比10 I比例配置的酶-抗體溶液于以上述已封閉的反應孔中，室溫(20 25°C )避光孵育15min，然后洗板五次，最后一次拍干。D,發(fā)光于各反應孔中加入臨時配制的化學發(fā)光溶液100 μ L/孔,反應3min后用化學發(fā)光免疫分析儀檢測。E，檢測結果以抑制率計算相對發(fā)光強度) = RLU/RLU0, RLU是標準品或者樣品溶液測定的發(fā)光強度值，RLU0是空白(濃度為O的標準溶液)的發(fā)光強度值。計算50%抑制率時藥物的濃度即為該抗體的靈敏度。實施例3 :檢測喹諾酮類藥物的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒(I)檢測喹諾酮類藥物的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的組成A,包被有包被原(QNS-OVA)的固相載體(酶標板)；B,喹諾酮類藥物標準溶液0ng/mL, O.1ng/mL, O. 3ng/mL, O. 9ng/mL, 2. 7ng/mL 和8.1ng/mL。
C，酶標羊抗鼠抗體溶液酶標羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液，裝入，使用時用洗滌溶液配制成1: 2000的工作濃度。D，喹諾酮類藥物抗體溶液用人工免疫抗原(QNS-BSA)免疫動物制備所得的單克隆抗體，將所得喹諾酮類藥物抗體用洗滌溶液稀釋成1: 32000工作濃度。E，發(fā)光溶液A液為魯米諾含量為O. 01M、對甲苯酚含量為O. OOlM pH = 8. 8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液，B液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2HP042. 82g,0. 75%的過氧化氫脲O. 64mL的溶液。F，濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaH2PO4 · 2H20 5. 74g,Na2HPO4 · 12H20 32. 6g的水溶液G，濃縮洗滌溶液含有體積分數(shù)O. 05%吐溫-20的pH = 7. 4,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。(2)酶標板的制備 用包被液將包被抗原稀釋成20. O μ g/mL,每孔加入100 μ L，37°C恒溫箱放置2h，傾去包被液，拍干，然后每孔加入封閉液15(^匕371恒溫箱放置211，傾去孔內液體，洗滌液洗滌一次，拍干，用錫箔紙真空密封保存。實施例4 :檢測喹諾酮類藥物的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的應用(I)試劑的配制A，洗滌溶液將試劑盒中提供的濃縮洗滌液用去離子水按1: 19倍稀釋后使用。B，磷酸鹽緩沖液將試劑盒中提供的濃縮磷酸鹽緩沖液用去離子水按1:1倍稀釋后使用。C，化學發(fā)光溶液使用前將A液與B液按體積比1:1混勻。(2)樣品前處理A，動物組織(豬肉、雞肉)—用均質器均質組織樣本；-稱取2. 0±0. 05g均質物至50mL聚苯乙烯離心管中；——加入O. 6mL O.1M鹽酸溶液，再加入5. 4mL無水乙腈中混合均勻；振蕩3min，3000g以上，室溫(20 25°C )離心IOmin ；—取上層有機相ImL至IOmL干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；——加入ImL正己烷，用渦旋儀渦動30s，再加入ImL磷酸鹽緩沖液渦動20s，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；—除去上層正己烷，取下層50μ L用于分析。B，水產品(魚肉、蝦肉)-取2. 0±0. 05g均質樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加入ImL O.1M鹽酸溶液，
再加入5mL乙腈,立即用振蕩3min ；3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；—取ImL上清液于IOmL玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；——加入ImL正己烷用渦旋儀渦動30s，再加入ImL磷酸鹽緩沖液，渦動20s，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；—除去上層有機相，取下層50μ L用于分析。C，肝臟(豬肝、雞肝)-取2. 0±0. 05g均質樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加入6mL 3% NaCL,再加
入2mL甲醇，渦動30s，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；
——取上層清液200 μ L與600 μ L磷酸鹽緩沖液混勻；——取50 μ L用于分析。D，蜂蜜-稱取蜂蜜樣本1. 0±0. 05g至IOmL聚苯乙烯離心管中；-加入ImL去離子水,渦動混勻5min,使其充分溶解；——取100 μ L與900 μ L磷酸鹽緩沖液稀釋，渦動混勻Imin ；——取50 μ L用于分析。(3)檢測步驟A，加樣向酶標板微孔中加入喹諾酮類藥物系列標準濃度溶液或樣品溶液50 μ L，然后每孔加入酶標羊抗鼠抗體溶液50 μ L，再加入喹諾酮類藥物抗體溶液50 μ L，室溫(20 25°C )恒溫孵育15min ；B，洗滌傾出孔中液體，每孔加入洗滌溶液250 μ L，洗滌5次，拍干；C，加發(fā)光溶液每孔加入發(fā)光溶液1001^，反應311^11 ；D，檢測用化學發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強度。(4)結果判斷所獲得的標準品和樣品發(fā)光強度值的平均值除以第一個標準(O標準)的發(fā)光強度值再乘以100，以抑制率為縱坐標，喹諾酮類藥物濃度的對數(shù)為橫坐標作標準曲線，每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。相對發(fā)光強度) = RLU/RLU0, RLU是標準品或者樣品溶液測定的發(fā)光強度值，RLU0是空白(濃度為O的標準溶液)的發(fā)光強度值。實施例5 :試劑盒特異性試驗以環(huán)丙沙星作為標準，設環(huán)丙沙星的交叉反應率為100%，用于抗體交叉反應性研究的藥物均為與環(huán)丙沙星結構或者功能相似的喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、依諾沙星、惡喹酸、氟甲喹、麻保沙星、氨氟沙星、雙氟沙星、沙拉沙星。按試劑盒程序操作，但加入的競爭物分別為不同的喹諾酮類類似物，制作抑制曲線，根據(jù)線性方程計算各競爭物50%抑制濃度(IC5tl)。交叉反應率(％CR)即為抗體對環(huán)丙沙星的IC5tl與抗體對氟喹諾酮類競爭物的IC5tl之比的百分數(shù)，按下式進行計算
權利要求
1.一種喹諾酮類藥物的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內的試劑；其特征在于，所述酶標板的各孔包被有以諾氟沙星衍生物與卵清蛋白偶聯(lián)制成的包被抗原；所述試劑包括喹諾酮類單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體、喹諾酮類系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發(fā)光液。
2.根據(jù)權利要求1所述喹諾酮類的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述酶標板為乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學發(fā)光酶標板。
3.根據(jù)權利要求1所述喹諾酮類的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述 包被抗原濃度為20 μ g/mL。
4.根據(jù)權利要求1所述喹諾酮類的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述喹諾酮類單克隆抗體的工作濃度為1: 32000。
5.根據(jù)權利要求1所述喹諾酮類的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述喹諾酮類的單克隆抗體是由諾氟沙星衍生物與牛血清蛋白偶合制成的偶聯(lián)物作為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得。
6.根據(jù)權利要求1所述喹諾酮類的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述喹諾酮類系列標準溶液濃度分別為0ng/mL,0. lng/mL,0. 3ng/mL,0. 9ng/mL, 2. 7ng/mL和8.lng/mL0
7.根據(jù)權利要求1所述喹諾酮類的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaH2PO4 · 2H20 5. 74g、Na2HPO4 · 12H20 32. 6g的水溶液。
8.根據(jù)權利要求1所述喹諾酮類的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌溶液是含有體積分數(shù)O. 05%吐溫-20的pH = 7. 4,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液.
9.根據(jù)權利要求1所述喹諾酮類的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述化學發(fā)光液A液為魯米諾含量為O. 01M、對甲苯酚含量為O. OOlM pH = 8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2HP042. 82g，0. 75%的過氧化氫脲O.64mL的溶液，所述百分比為質量百分比。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種喹諾酮類藥物的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內的試劑；其特征在于，所述酶標板的各孔包被有包被抗原即諾氟沙星衍生物與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述試劑包括喹諾酮類藥物的單克隆抗體、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠的抗體、喹諾酮類藥物系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發(fā)光液；本發(fā)明的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有高靈敏度、簡便快速、準確度高、檢測藥物種類多的特點，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，操作時間大幅度減少?？捎米鳈z測動物組織(豬肉、雞肉、豬肝、雞肝)、水產品(魚肉、蝦肉)和蜂蜜中12種喹諾酮類藥物殘留檢測。
文檔編號G01N33/577GK103018453SQ20111027914
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權日2011年9月20日
發(fā)明者萬宇平, 羅貴昆, 楊秀賢, 韓銳, 扶勝, 馮月君, 文雪靜, 孫倩倩 申請人:北京勤邦生物技術有限公司