專利名稱：檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的elisa試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及檢測喹諾酮類藥物殘留量的試劑盒，特別是檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒，ELISA (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)是酶聯(lián)免疫吸附劑測定的簡稱，是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種酶免技術。
背景技術：
喹諾酮類抗菌藥(4-quinolones),又稱批酮酸類或批唳酮酸類，是一類較新的合成抗菌藥，該類藥物的開發(fā)可以追溯到1962年,Lesher從合成抗痕藥氯喹中分離出一種副產(chǎn)品-萘啶酸，喹諾酮類歷經(jīng)40多年的發(fā)展，共開發(fā)出了四代喹諾酮類藥物，共計50多種藥物。喹諾酮類抗菌藥以細菌的脫氧核糖核酸(DNA)為靶位，通過選擇性的抑制細菌DNA促旋酶與拓撲異構酶IV而造成染色體的不可逆損害，而使細菌細胞不再分裂，主要作用于革蘭陰性菌的抗菌藥物，對革蘭陽性菌的作用較弱(某些品種對金黃色葡萄球菌有較好的抗菌作用)。已成為獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一，被大量用于治療、預防和促生長，由于其耐藥性和潛在的致癌性引起廣泛的關注。在組織中，恩諾沙星的標示殘留物為恩諾沙星和環(huán)丙沙星，其中以肝臟組織和腎臟組織中的殘留物濃度最高，其次是肌肉和脂肪附著的皮膚組織，恩諾沙星其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星(CIF)仍具有生物活性。氧氟沙星(OFL)其主要以原形藥物的形式存在于組織中；培氟沙星(PEF)在體內代謝率接近100%，而其代謝產(chǎn)物是諾氟沙星(N0R)。本試劑盒是應用ELISA技術研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品，與高效液相等儀器分析技術相比具有快速、簡便、準確和靈敏度高等特點，能最大限度地減少操作誤差和工作強度。

實用新型內容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的喹諾酮類藥物殘留量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術含量不高，可進行一次連續(xù)多個樣品中喹諾酮類藥物殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。本實用新型的技術方案是一種檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔中預包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的喹諾酮類藥物和微孔中預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗喹諾酮類藥物抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留喹諾酮類藥物的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中喹諾酮類藥物的殘留量。本實用新型所提供的一種檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的ELISA試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、14瓶試劑，其特征在于酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔中預包被喹諾酮類藥物偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別為7瓶
3喹諾酮類藥物標準品溶液、酶標二抗、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液。還包括一張蓋板膜和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質檢報告，盒體是硬紙盒；96孔試劑板為聚苯乙烯酶標板，放于真空鋁鉬袋內；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液和高濃度標準品溶液均用黑色帽的白色PE塑料瓶，酶標二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復溶液用藍色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位共15個，由塑料泡沫制成。酶標板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，每個反應孔預包被喹諾酮類藥物偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液7瓶，Iml/瓶；酶標二抗I瓶，7ml ;抗體工作液I瓶，7ml ;顯色液A液I瓶，7ml ;顯色液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml ;濃縮洗滌液I瓶，40ml ;濃縮復溶液I瓶，50ml。經(jīng)實驗表明本試劑盒具有很聞的靈敏度水廣品樣本的最低檢測限為l.Oyg/kg,回收率為80%±20%，相對于其他喹諾酮類藥物檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，且所需儀器同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用于水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留量的檢測。

[0012]圖[0013]圖[0014]圖[0015]圖[0016]圖[0017]圖[0018]圖
I為本實用新型酶標板的側面縱剖面圖2為本實用新型酶標板的側面橫剖面圖3為本實用新型酶標板的俯視4為本實用新型蓋板膜平面5為本實用新型試劑瓶縱剖面平面6為本實用新型固定泡沫模具的俯視7為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側視圖。
(長為 8. 55cm)(長為 12. 8cm)
具體實施方式
一、試劑盒組裝酶標反應微孔條(2)預包被喹諾酮類藥物偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標板的外框支撐架(I)上，酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標板置水浴或恒溫箱內反應時封蓋酶標反應微孔條(2);透明帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍色帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝50ml濃縮復溶液；白色帽￠)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液，紅色帽￠)的黑色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液B液，黃色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色塑料試劑瓶
(8)用于封裝7ml酶標二抗，綠色帽的白色塑料試劑瓶(8)用于封裝7ml喹諾酮類藥物抗體工作液，黑色帽的白色塑料試劑瓶(9)用于封裝Iml/瓶的標準品溶液；泡沫塑料模具(10)
4有15個瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18)，50ml濃縮復溶液(11)，7ml顯色液A液瓶位(14)，7ml顯色液B液瓶位(13)，7ml終止液瓶位(12)，7ml喹諾酮類藥物抗體工作液瓶位(16)，7ml酶標二抗瓶位(15)，7瓶Iml/瓶各種濃度的標準品溶液瓶位(17)，盒體為(19)是硬紙盒。二、樣本的前處理I.配液配液I :O. IM氫氧化鈉溶液稱取2. Og氫氧化鈉，加500ml去離子水溶解混勻配液2 復溶工作液用去離子水將5X濃縮復溶液按1:4體積比進行稀釋(I份5X濃縮復溶液+4份去離子水)用于樣本的復溶，復溶工作液在4°C環(huán)境下可保存一個月配液3 洗滌工作液用去離子水將20X濃縮洗滌液按1:19體積比進行稀釋(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個月2.樣本處理步驟(I)取2. 0±0· 05g均質樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入Iml O. IM氫氧化鈉溶液，再加入7ml乙腈，用振蕩器充分振蕩5min ；3000g以上，室溫(20 25°C /68 77 °F)離心 IOmin ；(2)取2ml上清液于IOml玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；(3)加入Iml正已烷用渦旋儀渦動30s，再加入Iml復溶工作液，渦動30s，3000g以上，室溫(20 25°C /68 77 °F)離心5min ；(4)除去上層有機相，取下層50μ I用于分析。三、使用試劑盒的操作步驟I、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(2(T25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于疒8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、加標準品/樣本/酶標二抗和抗體工作液加標準品/樣本50 μ I到對應的微孔中，直接加入酶標二抗50μ I/孔，再加入抗體工作液50μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應30min。6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液250 μ I/孔，充分洗滌4^5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、顯色加入底物液A液50μ I/孔，再加底物液B液50μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應15min。8、測定加入終止液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數(shù)據(jù))，測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。[0043]四、結果判定結果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與喹諾酮類藥物的含量成負相關。I、用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本I的吸光度值為O. 258，樣本2的吸光度值為O. 956，標準液吸光度值分別是0ppb為I. 988 ;
O.2ppb 為 I. 454 ；0. 6ppb 為 O. 842 ；1. 8ppb 為 O. 454 ；5. 4ppb 為 O. 182 ；16. 2ppb 為 O. 078。則樣本I的濃度范圍是I. 8ppb^5. 4ppb，再乘以其對應的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中喹酮類藥物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.2pplT0.6ppb再乘以其對應的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中喹酮類藥物殘留的濃度范圍。2、定量判定(I)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光率(％)=B/B0X 100%B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值Btl — Oppb標準溶液的平均吸光度值(2)標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以標準品濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物實際濃度。五、注意事項I、室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(2(T25’ C)會導致所有標準的OD值偏低。2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。3、試劑混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。4、反應終止液為2mol/L硫酸,避免接觸皮膚。5、儲存條件保存試劑盒于2 8°C，不要冷凍；將不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。6、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。7、顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。O標準的吸光度值小于0.5(A450nm<0. 5)時，表示試劑可能變質。8、加A, B液后一般顯色15min即可,若顏色較淺,可延長顯色時間到20min (或更長)，但不得超過25min。反之，則減短反應時間。9、該試劑盒最佳反應溫度為25°C，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
權利要求1.一種檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的ELISA試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、14瓶試劑，其特征在于酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔中預包被喹諾酮類藥物偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別為7瓶喹諾酮類藥物標準品溶液、酶標二抗、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液。
2.根據(jù)權利要求I所述的ELISA試劑盒，其特征在于還包括一張蓋板膜和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質檢報告，盒體是硬紙盒；96孔試劑板為聚苯乙烯酶標板，放于真空鋁鉬袋內；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液和高濃度標準品溶液均用黑色帽的白色PE塑料瓶，酶標二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復溶液用藍色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位共15個，由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權利要求I所述的ELISA試劑盒，其特征在于酶標板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，每個反應孔預包被喹諾酮類藥物偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液7瓶，Iml/瓶；酶標二抗I瓶，7ml ;抗體工作液I瓶，7ml ;顯色液A液I瓶，7ml ;顯色液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml ;濃縮洗滌液I瓶，40ml ;濃縮復溶液I瓶，50ml。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標板、酶標二抗、喹諾酮類藥物抗體工作液、喹諾酮類藥物6個濃度的標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、高濃度標準品、蓋板膜、自封袋、說明書和質檢報告。采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔中預包被偶聯(lián)抗原，樣本中含有的喹諾酮類藥物將和微孔中預包被的偶聯(lián)抗原競爭結合抗喹諾酮類藥物抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中喹諾酮類藥物的殘留量。與儀器分析技術相比具有使用方便、高靈敏度等特點，可在水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的殘留量檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/543GK202735340SQ20122011157
公開日2013年2月13日 申請日期2012年3月22日 優(yōu)先權日2012年3月22日
發(fā)明者萬宇平, 陶光燦, 馮靜, 王禮貴, 顧蓉蓉, 楊昌松, 韓京朋, 石潔 申請人:北京勤邦生物技術有限公司