專利名稱：一種檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)統(tǒng)計，全球每年的流感病例為6億-12億，其中重癥流感為300萬-500萬例， 死亡25萬人-50萬人，重癥流感的病死率可達8% -10%。目前美國每年流感導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過車禍和艾滋病造成的死亡人數(shù)，在我國和發(fā)展中國家已成為嚴重危害人類健康的頭號大敵。我國是流感的高發(fā)區(qū)，流感的流行或局部暴發(fā)基本上每年都有，每年有1億多人遭受流感的困擾，到醫(yī)院就醫(yī)者超過50萬人。流行性感冒，通常稱為“流感”，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有很強的傳染性，主要通過咳嗽和打噴嚏傳播，一般春季和冬季爆發(fā)。分為A型(甲型)流感病毒、B型(乙型)流感病毒和C型(丙型)流感病毒。甲型流感病毒具有極強的變異性，乙型病毒次之，而丙型病毒則非常穩(wěn)定。現(xiàn)階段檢測流感病毒感染的方法主要包括病毒培養(yǎng)法、RT-PCR法以及膠體金免疫層析法。病毒培養(yǎng)是病毒檢測的金標準，但這種檢測方法周期很長，一般要3 7天的時間，靈敏度不高；RT-PCR能夠4-8小時內(nèi)對樣本實現(xiàn)檢測，且靈敏度和特異性很高，但是并不適于在機場、口岸、火車站、醫(yī)院等人口密度大、人流量大、不易讓人群長時間聚集的公共場所；膠體金免疫層析法由于不需要輔助的設(shè)備，方便的儲運及操作簡便非常適合在基層場所使用，但現(xiàn)階段靈敏度不高，容易造成漏檢，尚不能夠區(qū)分病毒感染亞型。最近出現(xiàn)的一種新的彩色膠乳檢測技術(shù)，靈敏度比膠體金要高10-100倍，并且可以通過調(diào)成不同的顏色，可以進一步推廣到實現(xiàn)不同項目的同時檢測。中國專利CN200910087632. 5公開了一種屬于病原體基因快速診斷領(lǐng)域的檢測甲型Hmi流感病毒的專用引物和包括該引物的檢測甲型Hmi流感病毒的試劑盒以及該引物所對應(yīng)的靶序列。本發(fā)明的專用引物所對應(yīng)的靶序列，該試劑盒利用基因反轉(zhuǎn)錄和等溫擴增技術(shù)原理，對甲型Hmi病毒核酸進行快速檢測，檢測結(jié)果可肉眼判定，也可利用電泳進行分析。但是該方法耗時長，費用大，不利于大面積推廣和民用化。中國專利CN20091008M75. 4公開了一種流感病毒rRT_PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法，包括甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型Hmi流感病毒Hl特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性引物和探針等，4種共12條寡核苷酸引物和探針序列，同時公開了待檢樣本處理、rRT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件、結(jié)果分析。該方法的不足也是由于費用昂貴、需要專業(yè)的儀器和操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)。故該方法也不適用于普及和民用化。申請?zhí)枮镃N200910040975公布了一種用于檢測甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒的核酸納米金生物傳感器，是通過玻璃纖維上涂有納米金標記寡核苷酸探針以及在硝酸纖維素膜上固定兩種寡核苷酸探針來檢測目標物。但是檢測時間基本需要在半個小時以上。同樣的，專利號為CN20081002M89. 7的專利公布了一種借助液相芯片檢測流感和H5m亞型禽流感病毒的方法、申請?zhí)枮镃N201110223913. 6的專利公布了甲型/乙型流感病毒核酸雙重熒光PCR檢測試劑盒、申請?zhí)枮镃N201010171355.9的專利公布了人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多檢方法及試劑盒、申請?zhí)枮?01110149333. 7公布了雙重熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及應(yīng)用，這些方法都存在費用高、需要專業(yè)儀器、檢測周期長的問題，不利于流感檢測在家庭、在基層及更廣泛人群中推廣使用。如上所述，基于彩色膠乳檢測技術(shù)，再添加親和素-生物素信號擴大系統(tǒng)，結(jié)合抗體制備技術(shù)，在克服膠體金靈敏度不足的同時也可以實現(xiàn)甲型流感病毒抗體的檢測。該試劑條兼?zhèn)浜啽?、快速、準確的特點，適合基層單位初篩和家庭使用，彌補現(xiàn)階段層析試劑盒靈敏度不高及不能實現(xiàn)分型的缺陷，將能夠最大限度地降低人群聚集感染的風險、在疫情現(xiàn)場減低疾病造成的危害。聯(lián)檢的設(shè)計可以節(jié)省每一次檢測的一次性耗材。這些設(shè)計特點符合國家醫(yī)療保障制度在基層的推廣的政策和環(huán)保的倡議。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的流感病毒檢測費用昂貴、檢測周期長、 用納米膠體金靈敏度稍低的缺陷，而提供一種新的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙
^^ O為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案一種檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條，其特征在于，所述試紙條由樣品墊、含有彩色膠乳顆粒標記物的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成，所述硝酸纖維素膜包括包被有甲型流感病毒抗體的檢測區(qū)和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)，所述彩色膠乳顆粒標記物包括微信號放大系統(tǒng)和彩色膠乳標記兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體。所述的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條，其特征在于平行包被了甲型流感病毒抗體，可以檢測甲型流感病毒抗原。優(yōu)選地，所述彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物的用量為32. 5-60 μ g/cm2 ；所述檢測區(qū)上包被的甲型流感病毒抗體用量為0. 144-0. 28 μ g/mm ；所述彩色膠乳標記兔IgG抗體的用量為20-40 μ g/cm2 ；所述羊抗兔抗體為羊抗兔IgG抗體，所述羊抗兔抗體的用量為0. 18-0. 44 μ g/mm。優(yōu)選地，所述彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物的用量為55-60 μ g/cm2，所述檢測區(qū)上包被的甲型流感病毒抗體用量為0. 20-0. 23 μ g/mm，所述彩色膠乳標記兔IgG抗體的用量為g/cm2，所述羊抗兔抗體的用量為0. 30-0. 36 μ g/ mmD本發(fā)明還提供了上述試紙條的制備方法，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法制備甲型流感病毒抗體以及彩色膠乳標記兔IgG抗體；(2)制備微信號放大系統(tǒng)a、制備彩色膠乳標記親和素
將待標記親和素預(yù)先在0. 001 0. 01mol/L的NaCl溶液中透析過夜，離心，調(diào)節(jié)彩色膠乳液的PH值至7 8，標記親和素以形成彩色膠乳標記親和素；b、按常規(guī)方法制備生物素化甲型流感病毒抗體，所述生物素與甲型流感病毒抗體的質(zhì)量比為1:9;c、完成微信號放大系統(tǒng)將步驟a得到的彩色膠乳標記親和素和步驟b得到的生物素化甲型流感病毒抗體混合，所述彩色膠乳標記親和素與生物素化甲型流感病毒抗體的用量比例為1ml彩色膠乳標記親和素溶液中加入100μ 1生物素化甲型流感病毒抗體，連接得到彩色膠乳-親和素-生物素-甲流感病毒抗體，洗滌，即得微信號放大系統(tǒng)；(3)按稀釋參數(shù)20cm2/ml 40cm2/ml，將步驟⑵的彩色膠乳-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體和彩色膠乳-兔IgG抗體噴灑到玻璃纖維膜上，干燥備用；(4)用包被緩沖液稀釋甲型流感病毒抗體，使其濃度為0. 9mg/ml 1. %ig/ml，按膜液量0. 16 μ 1/mm 0. 2 μ 1/mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥備用；用包被緩沖液稀釋羊抗兔抗體，使其濃度為1. Omg/ml 2. 0mg/ml,按膜液量 0. 18 μ 1/mm 0. 22 μ 1/mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥備用；(5)將樣品墊、步驟( 的玻璃纖維膜、步驟(4)的硝酸纖維素膜、吸水紙按序粘貼于底板上，即得。優(yōu)選地，所述步驟(3)中彩色膠乳-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物的用量為32.5-60yg/cm2，所述步驟中硝酸纖維素膜上包被的甲型流感病毒抗體的用量為0. 144-0. g/mm，所述彩色膠乳標記兔IgG抗體的用量為20-40 μ g/cm2，所述羊抗兔抗體的用量為0. 18-0. 44μ g/mm。優(yōu)選地，所述步驟(3)中彩色膠乳-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物的用量為55-60 μ g/cm2，所述步驟中硝酸纖維素膜上包被的甲型流感病毒抗體用量為 0. 20-0. 23 μ g/mm，所述彩色膠乳標記兔IgG抗體的用量為觀_32 μ g/cm2，所述羊抗兔抗體的用量為 0. 30-0. 36 μ g/mm。為了解決信號擴大不足的問題，本發(fā)明基于固相免疫層析原理，采用彩色膠乳顆粒標記技術(shù)、微信號放大技術(shù)(親和素-生物素體系和雙抗體夾心反應(yīng)體系)檢測人體分泌物中的甲型流感病毒抗原。若樣品中含有甲型流感病毒抗原，經(jīng)玻璃纖維膜上的微信號級聯(lián)系統(tǒng)將信號放大，使甲型流感病毒抗原與彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物結(jié)合，并擴散到硝酸纖維素膜上進一步層析，當遇到包被在硝酸纖維素膜上檢測區(qū)的T線(甲型流感病毒抗體包被線)處的配對抗體時，復(fù)合物則又和包被抗體結(jié)合，被捕獲在包被處，當被捕獲的復(fù)合物達到一定數(shù)量時，則形成肉眼可見的T線，說明樣品中含有甲型流感病毒抗原，若不出現(xiàn)，說明樣品為陰性或含量低于試紙條的最低檢測限。 控制區(qū)(C線)作為試紙條的質(zhì)控標準，陽性和陰性樣品檢測時均會出現(xiàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明在現(xiàn)有檢測試紙條的基礎(chǔ)上，采用了新的彩色膠乳檢測技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的膠體金檢測技術(shù)，并添加了生物素-親和素微信號級聯(lián)放大系統(tǒng)，優(yōu)化了制備參數(shù)，得到了最優(yōu)化的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條因而，在檢測甲型流感病毒抗原的過程中，擴大了目標抗體的信號，增加檢測靈敏度，避免因信號太弱而出現(xiàn)假陰或者漏檢；
(2)本發(fā)明的試紙條具有操作安全(無放射物污染)、簡便(簡單操作一步完成)、 適合單人/份檢測(放免、酶免不適合單人/份或少量樣品檢測)和快速(15分鐘左右即可有結(jié)果)等優(yōu)點，可實現(xiàn)對甲型流感病毒抗原現(xiàn)場和家庭自檢。


圖1為本發(fā)明的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為利用本發(fā)明試紙條檢測甲型流感病毒抗原的陽性結(jié)果示意圖；圖3為利用本發(fā)明試紙條檢測甲型流感病毒抗原的陰性結(jié)果示意圖；附圖標記1.樣品墊；2.玻璃纖維膜；3.硝酸纖維素膜；4.吸水紙；5.甲型流感病毒檢測區(qū)；6.質(zhì)控區(qū)；7.底板。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。實施例1本發(fā)明檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條如圖1所示，為本發(fā)明所述的一種檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條。包括樣品墊1、與所述樣品墊1 一端緊密相連的含有彩色膠乳顆粒標記物的玻璃纖維膜2、與所述玻璃纖維膜2另一端緊密相連的硝酸纖維素膜3、以及與所述纖維素膜3的另一端緊密相連的吸水紙4，所述樣品墊1、玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3和吸水紙4均設(shè)置于底板7 上，所述硝酸纖維素膜3包括包被有甲型流感病毒抗體的檢測區(qū)5和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)6，所述彩色膠乳顆粒標記物包括微信號放大系統(tǒng)和彩色膠乳標記兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體。本發(fā)明的試劑條，所述彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物在玻璃纖維膜2上的用量為58 μ g/cm2 ；彩色膠乳標記兔IgG抗體在玻璃纖維膜2上的用量為30 μ g/cm2 ；甲型流感病毒抗體的原始濃度為3. 00mg/ml，包被到硝酸纖維膜3的檢測區(qū)5的濃度為1. 2mg/ml，包被用量為0. 216 μ g/mm ；羊抗兔IgG抗體包被在控制區(qū)時的用量為 0.33 μ g/mm。實施例2實施例1試紙條的制備方法在本發(fā)明中采用彩色膠乳顆粒標記。彩色膠乳微球是通過微球表面的羧基或者氨基，在EDC、戊二醛等交聯(lián)劑或偶聯(lián)劑的作用下，與蛋白的氨基或羧基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的交聯(lián)物。利用蛋白的抗原性發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，利用微球所具有的顏色起示蹤的作用， 達到反應(yīng)的目的。一種檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條的制備步驟如下1.制備甲型流感病毒抗體利用常規(guī)方法用重組的甲型流感抗原或滅活的甲型流感抗原免疫小鼠，甲型流感抗原免疫的小鼠與骨髓瘤細胞融合后，用ELISA方法鑒別，鑒別出來的雜交瘤在腹水中培養(yǎng)，篩選陽性克隆，分離純化甲型流感病毒抗體。ELISA鑒定甲型流感病毒抗體的活性和效價，純化備用。2、制備微信號放大系統(tǒng)a、制備彩色膠乳標記親和素將待標記親和素(親和素由美國Thermo公司提供)預(yù)先在0.005mol/L pH7. 0的NaCl溶液中4°C透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后4°C 100 OOOg離心lh，去除聚合物；以0. lmol/L的PBS調(diào)節(jié)彩色膠乳液(德國默克(MERCK))的pH 值至7 8，標記親和素以形成彩色膠乳標記親和素；b、制備生物素化甲型流感病毒抗體先用6-氨基己糖與生物素(生物素由美國 Thermo公司提供)連接制得長臂生物素，再使其與甲型流感抗原結(jié)合，所述生物素與甲型流感病毒抗體的質(zhì)量比為1 9，然后在碳二亞胺的作用下將其與N-羥基丁二酰胺進行縮和，生成長臂生物素 N-羥基丁二酰亞胺酯(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl ami do hexanoae, BCNHS)，即為生物素化甲型流感病毒抗體。通過透析除去游離生物素。C、完成微信號放大系統(tǒng)的將步驟a得到的彩色膠乳標記親和素和步驟b得到的生物素化甲型流感病毒抗體直接混合，所述彩色膠乳標記親和素與生物素化甲型流感病毒抗體的用量比例為1ml彩色膠乳標記親和素溶液中加入100 μ 1生物素化甲型流感病毒抗體，連接得到彩色膠乳-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌、離心處理后，即得微信號放大系統(tǒng)。3、彩色膠乳標記兔IgG抗體在ρΗ6. 5 7. 0范圍內(nèi)，兔IgG與彩色膠乳顆粒蛋白(最低用量為8. 0 μ g/ml)標記形成彩色膠乳標記兔IgG抗體(蛋白探針)。4、將彩色膠乳-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體、以及彩色膠乳標記兔IgG 抗體噴灑到玻璃纖維膜2上，稀釋參數(shù)(稀釋參數(shù)是每ml溶液噴灑多少面積的工藝參數(shù)) 為25cm2/ml 35cm2/ml，所述彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物在玻璃纖維膜2上的用量為58 μ g/cm2 ；彩色膠乳標記兔IgG抗體在玻璃纖維膜2上的用量為30 μ g/cm2,并在溫度20 40°C，濕度10% -30%，將玻璃纖維膜2干燥12個小時以上，5、用包被緩沖液(主要成分是0. OlM pH7. 2PBS、5%蔗糖、甲醇、5%甘氨酸、 0. 05% NaN3)稀釋甲型流感病毒抗體，使其濃度為1. Omg/ml，按膜液量0. 18μ 1/mm，將其分別細致均勻的噴到硝酸纖維素膜3上，甲型流感病毒抗體的原始濃度為3. 00mg/ml，包被到硝酸纖維膜3的檢測區(qū)5的濃度為1. 2mg/ml，包被用量為0. 216 μ g/mm，其中硝酸纖維素膜 3孔徑為5. 0 μ m 10. 0 μ m，置于20 40°C，濕度10% 30%條件下烘干處理12個小時以上，備用；用包被緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體，使其濃度為1. 5mg/ml，按膜液量0. 20 μ 1/ mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜3上，置于20 40°C，濕度10% 30%條件下烘干處理12個小時以上，封袋，備用；同時，用包被緩沖液稀釋羊抗兔抗體，使其濃度為1. 5mg/ml，按膜液量0. 33 μ g/ mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥備用；6、將樣品墊1、玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3和吸水紙4依序粘貼于底板7上，即得本發(fā)明所述的試紙條。本發(fā)明所述的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條經(jīng)過包裝可以直接使用， 或者安裝到試劑盒里，配合小滴管，充當試劑卡使用。實施例3利用實施例1中的試紙條檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的方法本實施例利用實施例1的試紙條對分泌液樣本中的甲型流感病毒抗原進行檢測。包括以下步驟
(1)采集樣本使用無菌PP (聚丙烯)桿的聚酯海綿拭子采集樣本。鼻腔分泌物采集方法收集鼻腔分泌物時，將拭子插入鼻腔中分泌物最多處，輕輕轉(zhuǎn)動并向鼻腔內(nèi)部推動拭子，直至鼻甲(離鼻孔約2. Ocm 2. 5cm)受阻處，貼鼻腔壁旋轉(zhuǎn)拭子三次，取出拭子； 咽喉分泌物采集將拭子從口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上顎扁桃的發(fā)紅部位為中心， 適度用力擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，應(yīng)避免觸及舌部，取出拭子；(2)采集唾液樣品后，在樣本提取管內(nèi)垂直加入400 μ 1 (約10滴)樣本提取液，將采樣后的拭子插入樣本提取管中溶液內(nèi)，緊靠試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)約10次，使標本盡可能溶解在溶液中，沿提取管內(nèi)壁擠壓拭子的棉簽頭，使液體盡可能留在管內(nèi)，取出并棄去拭子。標本采集后盡快采用病毒采樣液或本試劑盒提供的樣本提取液進行處理。如不能立即處理，標本應(yīng)立即置于干燥、消毒并嚴格密封的塑料管內(nèi)儲存，2°C 8°C下可保存8小時，-70°c可長期保存；(3)沿鋁箔袋切口部位撕開，取出試條平放，吸取5μ 1樣本垂直滴加于試條箭頭膠所示的加樣區(qū)；由于毛細管作用，樣品將沿著試紙條向玻璃纖維素膜2和硝酸纖維素膜3 移動，待樣品完全通過玻璃纖維素膜2以及硝酸纖維素膜3，結(jié)果開始顯示；(4) 15分鐘后觀察顯示結(jié)果(30分鐘后顯示的結(jié)果無效)，判讀并記錄檢測結(jié)果 (圖2和圖3)，若硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)5出現(xiàn)一條肉眼可見的深色線(Τ線)，即表明樣品中含有大量甲型流感病毒抗原，即說明受檢驗者的肌體已經(jīng)被甲型流感病毒感染(甲型流感病毒陽性，請同時參考圖2、；若硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)5未出現(xiàn)一條肉眼可見的深色線，即表明樣品中未含有大量的流感病毒抗原，說明受檢驗者未被病毒感染(陰性，請同時參考圖幻；當樣品通過硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)5移動至控制區(qū)6時，無論樣品中有沒有甲型流感病毒抗原，控制區(qū)6都會有一條深色線(C線)；若控制區(qū)6無色線出現(xiàn)，說明試紙條已經(jīng)過期或操作有誤；(5)測試結(jié)束后，將使用后的試紙條、樣本提取管和口腔取樣器按生物醫(yī)療廢棄物進行處理。MM注為了表示方便，在下列表格中A代表甲型流感病毒抗原評價試劑與參比試劑比較(免疫層析法)檢測樣本包括在廣東省疾病預(yù)防控制中心481例、廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心300例、廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 (廣州市兒童醫(yī)院)300例、廣州市疾病預(yù)防控制中心300例、中國人民解放軍第302醫(yī)院 345例、廣州市第八人民醫(yī)院202例，合計1928例。
權(quán)利要求
1.一種檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條，其特征在于，所述試紙條由樣品墊、 含有彩色膠乳顆粒標記物的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成，所述硝酸纖維素膜包括包被有甲型流感病毒抗體的檢測區(qū)和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)，所述彩色膠乳顆粒標記物包括微信號放大系統(tǒng)和彩色膠乳標記兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條，其特征在于，所述彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物的用量為32. 5-60 μ g/cm2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條，其特征在于，所述檢測區(qū)包被的甲型流感病毒抗體用量為0. 144-0. ^μ g/mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條，其特征在于，所述彩色膠乳標記兔IgG抗體的用量為20-40 μ g/cm2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條，其特征在于，所述羊抗兔抗體為羊抗兔IgG抗體，所述羊抗兔抗體的用量為0. 18-0. 44μ g/mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條，其特征在于，所述彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物的用量為陽-60 μ g/cm2，所述檢測區(qū)包被的甲型流感病毒抗體用量為0. 20-0. 23 μ g/mm，所述彩色膠乳標記兔IgG抗體的用量為觀-32 μ g/cm2，所述羊抗兔抗體的用量為0. 30-0. 36 μ g/mm。
7.一種制備權(quán)利要求1-6任一項所述的檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法制備甲型流感病毒抗體以及彩色膠乳標記兔IgG抗體；(2)制備微信號放大系統(tǒng)a、制備彩色膠乳標記親和素將待標記親和素預(yù)先在0. 001 0. 01mol/L的NaCl溶液中透析過夜，離心，調(diào)節(jié)彩色膠乳液的PH值至7 8，標記親和素以形成彩色膠乳標記親和素；b、按常規(guī)方法制備生物素化甲型流感病毒抗體，所述生物素與甲型流感病毒抗體的質(zhì)量比為1:9;C、完成微信號放大系統(tǒng)將步驟a得到的彩色膠乳標記親和素和步驟b得到的生物素化甲型流感病毒抗體混合，所述彩色膠乳標記親和素與生物素化甲型流感病毒抗體的用量比例為1ml彩色膠乳標記親和素溶液中加入100μ 1生物素化甲型流感病毒抗體，連接得到彩色膠乳-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體，洗滌，即得微信號放大系統(tǒng)；(3)按稀釋參數(shù)20cm2/ml 40cm2/ml，將步驟O)的彩色膠乳-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體和彩色膠乳-兔IgG抗體噴灑到玻璃纖維膜上，干燥備用；(4)用包被緩沖液稀釋甲型流感病毒抗體，使其濃度為0.9mg/ml 1. %ig/ml，按膜液量0. 16 μ 1/mm 0. 2 μ 1/mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥備用；用包被緩沖液稀釋羊抗兔抗體，使其濃度為1. Omg/ml 2. 0mg/ml，按膜液量0. 18 μ 1/mm 0. 22μ 1/mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥備用；(5)將樣品墊、步驟C3)的玻璃纖維膜、步驟(4)的硝酸纖維素膜、吸水紙按序粘貼于底板上，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條的方法，其特征在于，所述步驟(3)中彩色膠乳-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物的用量為32. 5-60 μ g/cm2，所述步驟中硝酸纖維素膜上包被的甲型流感病毒抗體的用量為 0. 144-0. 28 μ g/mm,所述彩色膠乳標記兔IgG抗體的用量為20-40 μ g/cm2,所述羊抗兔抗體的用量為 0. 18-0. 44 μ g/mm ο
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條的方法， 其特征在于，所述步驟(3)中彩色膠乳-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復(fù)合物的用量為55-60 μ g/cm2，所述步驟中硝酸纖維素膜上包被的甲型流感病毒抗體用量為 0. 20-0. 23 μ g/mm，所述彩色膠乳標記兔IgG抗體的用量為觀_32 μ g/cm2，所述羊抗兔抗體的用量為 0. 30-0. 36 μ g/mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測分泌物中甲型流感病毒抗原的試紙條及其制備方法，該試紙條由樣品墊、含有彩色膠乳顆粒標記物的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成，所述硝酸纖維素膜包括包被有甲型流感病毒抗體的檢測區(qū)和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)，所述彩色膠乳顆粒標記物包括微信號放大系統(tǒng)和彩色膠乳標記兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為彩色膠乳顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體。本發(fā)明在雙抗體夾心檢測體系中，添加了生物素-親和素微信號放大系統(tǒng)，擴大了目標抗體的信號，增加檢測靈敏度，避免因信號太弱而出現(xiàn)假陰或者漏檢。
文檔編號G01N33/558GK102539755SQ20111043061
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者張健, 王繼華, 王雪霞 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)有限公司