專利名稱：甲型h1n1流感血凝素抗原及其在抗體檢測試劑中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲型Hmi流感血凝素抗原，還涉及該抗原在制備檢測甲型Hmi流感血凝素抗體檢測中的用途。
背景技術(shù)：
2009年爆發(fā)的新型甲型Hmi流感引起了全球關(guān)注(Dawood FS, Jain S，F(xiàn)inelli L, et al. Emergenceof a novel swine-origin inf1 uenza A (HlNl) virus in humans. N Engl J Med 2009 ；360 =2605-15.)，甲型H1N1/2009流感病毒屬于正黏病毒科，含有8個單股負鏈RNA片段，分別編碼因PB2，PBl，PA, HA, NP, NA, NS和MP等蛋白。其中RNA片段4 (HA 基因)編碼病毒重要的膜蛋白血凝素(HA)，研究顯示，HA含有細胞受體結(jié)合位點、介導(dǎo)病毒和細胞融合，是宿主特異性的主要決定因素，同時，HA抗原能誘導(dǎo)感染機體產(chǎn)生保護性中和抗體，因此，HA抗體的檢測在流感病毒的研究中具有重要作用(Itoh Y，Shinya K，KisoM, et al. In vitro and in vivo characterization of new swine-origin HlNl infl uenza viruses. Nature 2009 ；460 :1021-25.)。由于HA抗體具有重要的保護作用，在疾病的轉(zhuǎn)歸、疫苗保護效果的評價、既往感染的流行病學(xué)調(diào)查中具有重要作用，因此HA抗體的檢測具有重要的意義。由于缺少新型甲型Hmi流感特異性的HA抗原，目前，對HA抗體的檢測主要采用的是血凝抑制實驗、微孔中和測試等(Garten RJ, Davis CT, Russell CA, Shu B. Antigenic and Genetic Characteristics of Swine-Origin 2009 A(HlNl) Influenza VirusesCirculating in Humans Science. 2009 ；325 (5937) :197-201.)血凝檢測主要是根據(jù)流感病毒的HA抗原能引起紅細胞發(fā)生凝集作用這一原理進行的，而加入HA的抗血清后，抗原和抗體發(fā)生特異性結(jié)合，病毒則失去對紅細胞的凝集作用，即血凝抑制試驗。由此可見，血凝抑制檢測無法區(qū)分IgG、IgM、IgA抗體，因此血凝抑制試驗多用于對病毒的鑒定和疫苗保護效果的評價，在疾病的臨床轉(zhuǎn)歸中意義不大。除此以外血凝試驗和血凝抑制試驗均需要病毒的培養(yǎng)，由于甲型Hmi流感具有很強的傳染性，因此上述試驗均需要在具有一定生物安全等級的試驗室中才能展開，限制其在血清流行病學(xué)調(diào)查的應(yīng)用。新型甲型Hmi流感HA共有566個氨基酸筑成，其中1_17為信號肽，18-344編碼 HAl亞基，346-566編碼HA2亞基，第345的精氨酸在形成HA分子的過程中被水解掉。HA 分子在病毒囊膜上以同源三聚體的形式存在，HAl位于組成抗原的頭部，具有與宿主細胞受體結(jié)合的特性，至少含有5個抗原結(jié)構(gòu)域，其抗體具有中和活性，是疫苗研究和特異型別診斷研究的靶點。HA2的N末端參與病毒和細胞融合的過程，屬于高保守區(qū)，不同亞型之間具有明顯的交叉性，抗體中和效果不明顯。HA含有4-7個糖基化位點，其中大部分位于HA1， HA糖基化對宿主的限制性和毒力強弱有密切關(guān)系。盡管糖基化能給HA的抗原性帶來一定的變化，但該變化能導(dǎo)致不同型別HA抗體之間的交叉性，這意味著非糖基化的抗原具有更好的特異性，特別是近年的研究顯示，大腸桿菌表達得HA復(fù)性后能夠保持抗原的立體構(gòu)
3象，這些研究提示我們原核表達系統(tǒng)在特異性HA抗原篩選中具有一定的優(yōu)勢(Evaluation of hemagglutinin subtype 1 swine influenzaviruses from the United Statesl. Evaluation of hemagglutinin subtype 1 swine influenza virusesfrom the United States. Vet Microbiol. 2006 ；118(3-4) :212-22)。HA抗原具有極高的變異性，為了逃避宿主的免疫壓力，HA通過點突變形成抗原漂移(antigenicdrift)，產(chǎn)生新的病毒株。新毒株除了能突破原有的宿主特異性，更重要的是使宿主針對先前流行株的抗體不能再中和新出現(xiàn)的毒株，造成新病毒株在人群中的大量傳播。2009年發(fā)生的新型甲型Hmi流感病毒是北美豬流感、禽流感和歐亞豬流感的復(fù)合毒株。顯著特點是在人群中的傳播迅速，表現(xiàn)出對人體的高度適應(yīng)性。采用血凝試驗對此次型甲型Hmi流感HA抗原的特異性進行鑒定，用古典豬Hl病毒、曾經(jīng)感染人的豬Hl病毒、2009 A(HlNl)病毒、季節(jié)性Hl和H3病毒免疫的雪貂抗血清該對18個墨西哥甲型Hmi流感分離株和38個美國流感分離株的抗原性進行鑒定。結(jié)果顯示，不同地區(qū)發(fā)現(xiàn)的甲型Hmi流感病毒具有相同的抗原性，與古典豬Hl病毒、曾經(jīng)感染人的豬Hl病毒的抗原性相近，但與季節(jié)型流感病毒的雪貂抗血清并不交叉(Miller Ε, Hoschler K， Hardelid P,Stanford Ε, Andrews N, Zambon Μ. Incidenceof 2009 pandemic inf1 uenza A HlNl infection in England :a cross-sectional serological study. Lancet 2010 ； S0140-6736 (09) 62126-7)。這些試驗從血清學(xué)角度證明新型甲型Hmi-HA抗原具有一定的特異性，而特異性抗原區(qū)間的篩選和鑒定工作至今無人研究。對新型甲型Hmi流感HA的序列變異分析顯示與2006、2007年美國俄亥俄州 A/swine/HlNl病毒相差35 37個氨基酸，與我國的2008年以及2007年報道的甲型流感病毒(HlNl)的血凝素(HA)的氨基酸序列分別為70% 77%和71% 90%。而我們得研究顯示，與我國的浙江豬流感病毒學(xué)序列相比，HA抗原共共發(fā)生了 122處變異，并對這些變異引發(fā)的HA抗原性的改變進行了大量的預(yù)測。這些早期的對表位預(yù)測的生物信息學(xué)研究， 為我們從蛋白水平驗證HA抗原的免疫學(xué)特性打下了良好的基礎(chǔ)，也為我們篩選特異性的 HA抗原提供很好的技術(shù)支持。盡管甲型Hmi流感為新變異的病毒，但仍有少數(shù)人含有針對HA的交叉抗體，美國CDC的去年九月的血清流行病學(xué)研究顯示，在1980年前出生的人群中有4%的人存在針對此次甲型Hmi流感HA交叉抗體，而英國學(xué)者采用疾病流行前的血清(2008年年底)進行的流行病學(xué)調(diào)查顯示，大約有3%的15歲以下兒童和23%的成人及65歲以上老人具有交叉的HA抗體，這些流行病學(xué)的資料提示，在研制新的甲型Hmi流感抗體診斷試劑中，試劑的特異性要充分考慮選擇人群中的HA抗體交叉的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)(Cross-reactiveantibody responses to the 2009 pandemic HlNl inf 1 uenza virus. N Engl J Med 2009 ；361 1945-52)，我國關(guān)于甲型Hmi流感的血清流行病學(xué)調(diào)查主要用于疫苗評價，國家疾控預(yù)防中心于2009年6-9月期間采用血凝試驗，組織10家單位對國產(chǎn)疫苗的效果進行評價的結(jié)果顯示我國疫苗接種者HA抗體陽性的比率為85%。這些數(shù)據(jù)為本發(fā)明中 HA抗體診斷試劑的評價提供了很好的數(shù)據(jù)支持(Liang XF，Wang HQ, Wang JZ. Safety and immunogenicity of 2009 pandemic influenza A HlNl vaccines in China amulticentre, double-blind, randomised, placebo-controlled trial. Lancet. 2010 ； 375(9708) :56-66)。

發(fā)明內(nèi)容
為了滿足新型甲型Hmi流感HA抗體檢測安全性的需求，本發(fā)明通過對HA抗原表位的生物信息學(xué)研究，對4種具有高抗原活性的HA抗原進行了克隆表達，并利用Hmi疫苗接種者血清檢驗4種抗原的特異性和靈敏度，建立以間接酶聯(lián)免疫技術(shù)為主的新型甲型 Hmi流感HA抗體檢測試劑，并以此為基礎(chǔ)進行對HA抗體的(IgG、IgM、IgA)類型進行鑒定。本發(fā)明的目的是提供甲型Hmi流感HA抗原。本發(fā)明公開的甲型Hmi流感HA抗原，其氨基酸序列分別如序列表中下列序列所示(1)序列表中序列1，(2)序列表中序列2，(3)序列表中序列3，(4)序列表中序列4，(5)序列表中序列5，本發(fā)明還公開了上述甲型Hmi流感HA抗原在制備甲型Hmi流感HA抗體檢測試劑中的用途。本發(fā)明提供了一種鑒定的甲型Hmi流感HA抗體類型的酶聯(lián)免疫技術(shù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點1.發(fā)明是建立在間接免疫酶聯(lián)檢測的原理上目前，甲型Hmi流感HA抗體的檢測多以血凝試驗檢測為主，通過檢測待測血清能否抑制由甲型Hmi流感病毒引發(fā)的紅細胞的凝集作用，確定甲型Hmi流感HA抗體的存在。本發(fā)明在HA特異性抗原的克隆表達基礎(chǔ)上，在間接免疫酶聯(lián)檢測的基礎(chǔ)上建立甲型 Hmi流感HA抗體檢測技術(shù)，可有效的避開檢測過程中使用具有強傳染能力的甲型Hmi流感病毒，降低了整個實驗的危險性。使本發(fā)明具有簡單易操作、重復(fù)性好等特點而得到推廣和應(yīng)用。2.發(fā)明是建立在生物信息學(xué)與基因重組技術(shù)的基礎(chǔ)上甲型Hmi流感是一種新發(fā)突發(fā)傳染病，目前，未見有關(guān)此次甲型Hmi流感HA抗原性分析的報道，本研究在對HA抗原表位進行生物信息學(xué)預(yù)測的基礎(chǔ)上，分別選取可能具有較高抗原性5種HA抗原，并利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，對其進行克隆表達，并利用流行前獻血者血清和疫苗接種21天血清篩選其中的高特異性、高靈敏度的HA抗原，為甲型Hmi流感HA抗體檢測技術(shù)提供良好的科研基礎(chǔ)。3.本發(fā)明具有一定的臨床意義。本發(fā)明在對甲型Hmi流感HA抗體檢測的基礎(chǔ)上，進一步對HA抗體的IgG、IgM、 IgA類型進行鑒定?，F(xiàn)代免疫學(xué)認為IgM的產(chǎn)生一般與疾病的急性感染有關(guān)，而IgG抗體的產(chǎn)生則意味著患者或疫苗接種者獲得了對該疾病的保護。因此IgG、IgM、IgA類型的鑒定具有一定的臨床檢測意義，能彌補血凝抑制試驗中抗體類型無法鑒定的缺憾。為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明人利用生物信息學(xué)軟件分析甲型Hmi流感HA序列的抗原性，共選擇4種區(qū)段的HA抗原，其氨基酸序列分別如序列表中序列1-序列4所示?；蚬こ瘫磉_后，純化上述HA抗原，分別包被酶聯(lián)板，使用流行前獻血者血清和疫苗接種21天血清對上述5種抗原的活性進行鑒定，并根據(jù)反應(yīng)情況，選擇其中高特異性和高靈敏度的抗原，大量純化制備，并以此為基礎(chǔ)實現(xiàn)對甲型Hmi流感HA抗體的ELISA檢測。采用IgG、IgM、IgA特異性的辣根酶標二抗實現(xiàn)對甲型Hmi流感HA抗體類型的鑒定。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的利用生物信息學(xué)軟件，預(yù)測甲型Hmi流感HA抗原表位，并設(shè)定不同的區(qū)間進行分別重組表達，然后使用ELISA對上述4種抗原的活性進行鑒定，并從中選擇1條甲型Hmi 流感HA抗原用于甲型Hmi流感HA抗體檢測試劑的制備。本發(fā)明為了有利于甲型Hmi流感HA基因在E. COli中獲得高效的表達，選擇大腸桿菌的偏性密碼子設(shè)計并合成HA基因；為了便于基因克隆到表達載體，在連接臂的兩端引入Β ο I和)(ba I兩個酶切位點，以適合表達載體pBVILl(參見中國專利ZL00100695. 9: 表達載體PBVILl及其構(gòu)建方法和用途)。雙酶切后插入載體pBVILl中，構(gòu)建相應(yīng)的表達質(zhì)粒。測序法證明各基因片段已獲正確地插入。甲型Hmi流感HA抗原表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli HBlOl后，通過熱誘導(dǎo)培養(yǎng)，取全菌液進行SDS-PAGE鑒定，證明各表達質(zhì)粒均已獲得了高效的表達，再經(jīng)離子交換柱及凝膠過濾純化，均可獲得電泳純的甲型Hmi流感HA抗原純品。用ELISA檢測上述抗原與甲型 HlNl流感HA疫苗接種者血清之間的反應(yīng)性，選出其中可用于對甲型Hmi流感HA抗體檢測的HA抗原。采用上述HA抗原包被酶聯(lián)板，采用間接酶聯(lián)免疫法建立HCV變異檢測技術(shù)，并對試劑的靈敏度和特異性進行檢測。實驗結(jié)果證明，本發(fā)明所提供的甲型Hmi流行前組中有4例HA-IgG為陽性，102 例陰性，陽性率為3. 77% ；疫苗組中78例HA-IgG為陽性，19例陰性，陽性率為80. 41%，與國家CDC的統(tǒng)計結(jié)果較為相近。顯示甲型Hmi病毒HA-IgG抗體檢測試劑具有較高的特異性和靈敏度，在甲型Hmi病毒疫苗療效評價具有一定的應(yīng)用價值。


附圖1純化后的5種甲型Hmi流感HA抗原的SDS-PAGE
具體實施例方式實施例1候選抗原表位的選擇我們通過生物信息學(xué)軟件對甲型Hmi流感HA序列進行抗原性進行預(yù)測，結(jié)果如圖1所示，含有5個主要的抗原區(qū)段，其序列分別如序列表中序列1-序列5所示。實施例2 5種甲型Hmi流感HA抗原的克隆與表達1. 5種甲型Hmi流感HA抗原表達質(zhì)粒的構(gòu)建1. 1 5種甲型Hmi流感HA抗原基因的合成
根據(jù)上述5種甲型Hmi流感HA抗原的氨基酸序列，采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子委托上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成上述序列的基因。1.2 5種甲型Hmi流感HA抗原表達質(zhì)粒的構(gòu)建1. 2. 1 PCR產(chǎn)物及表達載體pBVILl雙酶切取以上合成基因產(chǎn)物及pBVILl表達載體各30 μ 1分別放于E印pendorf離心管中，各加入 10Xbuffer (H) 4 μ 1、Xba I (lOu/μ 1)禾口)(ho I (12u/μ 1)各 1 μ 1，加滅菌蒸餾水至40 μ 1，置37 °C水浴酶切過夜。酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳純化和回收PCR產(chǎn)物及載體pBVILl經(jīng)雙酶切后，用 1.2%瓊脂糖凝膠進行純化，具體方法按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法進行。 純化基因再用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量膠回收試劑盒回收即在紫外燈下分別切下含質(zhì)粒和目的基因的瓊脂糖，放于E印pendorf離心管中，各加入Sl液，置55°C水浴 10分鐘使膠溶解，加入等量異丙醇，混勻，55°C溫浴1分鐘，然后分別移入吸附柱后，按試劑盒說明書進行純化。1. 2. 2 連接于滅菌E印pendorf離心管中加入上述酶切后的載體及目的基因各1 μ 1、10XT4 DNA Ligase buffer 1 μ 1、Τ4 DNA Ligase (12u/ul) 1 μ 1，加滅菌蒸溜水至 10μ 1，置 16°C過夜。1. 2. 3 轉(zhuǎn)化在超凈工作臺中，用無菌吸頭取100μ1感受態(tài)細胞(感受態(tài)細胞按《分子克隆》 (科學(xué)出版社，第二版)的方法進行)懸液于Eppendorf中，加入上述連接物5 μ 1，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分。立即轉(zhuǎn)移到42°C水浴中放置2分鐘，每管加入0.5ml LB培養(yǎng)基(不加抗生素)，30°C水浴搖床培養(yǎng)60分鐘后，各取0. 2ml分別涂于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上(含抗生素)，室溫晾干后，置37°C恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。挑選數(shù)個菌落，分別接種于LB中(5ml/ 管)，培養(yǎng)過夜，次日各取0. Iml轉(zhuǎn)移到LB中Qml/管)，32°C培養(yǎng)3小時，42°C水浴搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，收菌，用SDS-PAGE鑒定，選擇目的基因獲得高表達菌株，并測序鑒定。2.抗原的表達與純化2. 1表達菌株的培養(yǎng)取-70°C保存的表達菌株20 μ 1接種于LB培養(yǎng)基中(100ml LB/500ml三角瓶)， 30°C空氣搖床培養(yǎng)過夜，次日按5%的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基(同上)，30°C空氣搖床培養(yǎng)約 3小時，當0D600值達到0. 7時，立即將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到42°C水浴搖床中，誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時。將菌液合并，6000rpm離心20分鐘，棄上清，收集沉淀部分。2. 2提取包涵體將沉淀稱濕重，用10倍體積的20mmol/L pH8. OTE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶 (lmg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。8°C，1，2000rpm,離心20分鐘，棄上清，沉淀用lmol/L NaCl (用TE 配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8. 0 TE配制)溶解，加1 % β -巰基乙醇。再于20°C，1，2000rpm，離心10分鐘，去沉淀取上清。2. 3 純化將上述溶解的包涵體溶液過Q-kpharose FF陰離子交換柱，用平衡液(pH8. 0，
720mmol/L TE含6mol/L脲，0. 1 % β -巰基乙醇)清洗后，用不同濃度的NaCl (用平衡液配制)洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，收集0. 05mol/L NaCl洗脫峰。再過kphardex G-50凝膠過濾柱，收集第一洗脫峰。各種純化重組表位抗原均用SDS-PAGE鑒定。3. 5種甲型Hmi流感HA抗原活性鑒定將純化的候選抗原用pH7. 2的磷酸鹽緩沖液稀釋到2. 0 μ g/ml，包被ELISA測定板，經(jīng)封閉后，對本室保存的內(nèi)質(zhì)控血清(含國內(nèi)10份甲型Hmi流感疫苗接種者血清和10 份流行前健康獻血者血清)進行了測定。結(jié)果如表1所示?？乖?具有很高的特異性和靈敏度表1不同甲型Hmi流感HA抗原活性檢測
權(quán)利要求
1.甲型Hmi流感HA抗原，其特征在于氨基酸序列分別為序列表中所示的5種序列(1)序列表中序列1，(2)序列表中序列2，(3)序列表中序列3，(4)序列表中序列4，(5)序列表中序列5。
2.按照權(quán)利要求1中所述的抗原，在制備甲型Hmi流感血凝素抗體檢測試劑中的用途。
3.按照權(quán)利要求2中所述的試劑含有IgG、IgM、IgA抗體檢測試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲型H1N1流感血凝素(HA)抗原，還公開了該抗原在制備甲型H1N1流感血凝素抗體檢測試劑中的用途。本發(fā)明采用生物信息學(xué)技術(shù)對現(xiàn)有甲型H1N1流感HA序列進行分析，篩選出5個抗原區(qū)段進行克隆表達，并通過甲型H1N1流感疫苗者血清檢測上述HA抗原的反應(yīng)情況，建立間接酶聯(lián)免疫法檢測甲型H1N1流感血凝素抗體，并進一步對抗體類型進行鑒定，本發(fā)明不接觸甲型H1N1流感病毒，安全性強，可用于人群甲型H1N1流感流行病學(xué)和疫苗保護效果的驗證。
文檔編號C07K14/11GK102234317SQ20101016474
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者何競, 修冰水, 馮曉燕, 宋曉國, 張賀秋, 房濤, 朱翠俠, 王國華, 陳坤 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所