專利名稱：一種富集分離內(nèi)源核受體的方法及其專用dna結(jié)合序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中目的蛋白的富集分離方法，特別是涉及一種富集分離內(nèi)源核受體的方法及其專用DNA結(jié)合序列。
背景技術(shù)：
核受體(nuclear receptor, NR)是動物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，在生物體內(nèi)廣泛分布，通過與相應(yīng)配體結(jié)合調(diào)控特定基因的表達(dá)，從而在機(jī)體的生長發(fā)育、新陳代謝、細(xì)胞分化及體內(nèi)許多生理過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，人、小鼠、大鼠體內(nèi)表達(dá)的NR分別是 48、49和47個。結(jié)合并活化NRs的配體包括親脂性底物，如內(nèi)源激素、維生素A、維生素D 和異型生物質(zhì)、內(nèi)分泌阻斷劑等。由于NR調(diào)控大量與疾病相關(guān)的基因，包括高血壓、癌癥、 糖尿病、心血管疾病、膽固醇膽石病以及代謝綜合癥等，因此，NRs也是很重要的藥靶，目前， FDA批準(zhǔn)的藥物有13%以上針對NR。NR對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控乃至其在各種生理病理等生物學(xué)過程中的重要作用主要依賴于其蛋白水平的微妙變化及精細(xì)調(diào)控。因此，在蛋白水平上開展NR的研究顯得非常迫切，但NR在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)豐度極低，而且受多種翻譯后修飾和輔調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，使得對內(nèi)源性NR及其形成的復(fù)合物的分離鑒定非常困難；采用特異性抗體進(jìn)行親和純化看似很有效，然而，一方面抗體成本太高，另一方面，目前僅少量的NR及其輔調(diào)節(jié)蛋白存在抗體， 這大大限制了抗體親和純化方法的應(yīng)用。為此，迫切需要發(fā)展新的技術(shù)方法對NR及其復(fù)合物進(jìn)行分離純化、鑒定、重構(gòu)，以及對其各個組分進(jìn)行功能解析。因此，急需開發(fā)一種高效、 廣譜的NR親合純化試劑，使從組織樣品中分離純化內(nèi)源NR超家族及其輔調(diào)節(jié)蛋白成為可能，為鑒定NR表達(dá)譜、尋找NR的配體或輔調(diào)節(jié)蛋白，以及后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。在分子水平上，核受體通過其保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DNA反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。與核受體結(jié)合的DNA反應(yīng)元件統(tǒng)稱激素反應(yīng)元件(hormone response element, HRE)，在NR識別的所有HRE中，都含有一個由6個保守核苷酸對組成的核心識別模塊，即AGGTCA，該序列也叫“半位點”。HRE中“半位點”的不同排列方式以及“半位點”間核苷酸對的不同長度對核受體識別不同HRE的特異性起關(guān)鍵作用，這也決定了 NR對靶基因的選擇特異性。根據(jù)NR識別的HRE的結(jié)構(gòu)特點，可以將NR分成3類第一類是識別含單一“半位點”HRE的NR，主要包括那些以單體形式發(fā)揮作用的NR，如NGFI-B、RevErb、ROR和 SF-I等；第二類NR識別的HRE含兩個順式串聯(lián)排列(direct repeat, DR)的“半位點”，所有直接重復(fù)的HRE序列中的兩個“半位點”間的距離在1-5個堿基對間變動，這類NR主要包括那些能與RXR形成異二聚體發(fā)揮功能的NR，如VDR、LXR等；第三類NR識別的HRE也由兩個半位點組成，但這兩個半位點以反向重復(fù)(invert repeat, IR)的方式排列，其兩個“半位點”間的距離也在1-5個堿基對間變動，這類核受體通常以同源二聚體的形式發(fā)揮功能， 包括ER、AR、GR等。NR是一種配體活化型轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體生長發(fā)育、新陳代謝、細(xì)胞分化、晝夜節(jié)律及許多生理過程中發(fā)揮重要作用。但是，內(nèi)源NR及其輔調(diào)節(jié)蛋白的檢測還面臨很大的技術(shù)難題，首先，NR及其輔調(diào)節(jié)蛋白在體內(nèi)的表達(dá)水平很低，用常規(guī)的技術(shù)手段難以檢測到；其次，雖然采用抗體和免疫沉淀策略也能實現(xiàn)內(nèi)源NR及其輔調(diào)節(jié)蛋白的分離鑒定，但抗體的成本很高，而且目前可獲得的抗體種類非常有限，這就大大限制了內(nèi)源NR及其輔調(diào)節(jié)蛋白的分離鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種富集分離內(nèi)源核受體的方法及其專用DNA結(jié)合序列。本發(fā)明所提供的DNA結(jié)合序列，是串聯(lián)多個單拷貝激素反應(yīng)元件的DNA序列，每個單拷貝激素反應(yīng)元件包含兩個由不同長度寡核苷酸鏈間隔的保守半位點，各單拷貝激素反應(yīng)元件間由3^bp的接頭序列(Linker)串聯(lián)，各單拷貝激素反應(yīng)元件均基于序列11所示的基礎(chǔ)單元設(shè)計，具體如序列表中序列1-17所示，拷貝數(shù)為3η (η為正整數(shù))。其中，該DNA結(jié)合序列通過分子克隆技術(shù)及體外連接方法獲得，拷貝數(shù)為3、6、9、 12,15 或 18。具體的DNA結(jié)合序列，所述單拷貝激素反應(yīng)元件為序列表中序列1所表示的DR1， 其串聯(lián)3、6、9、12、15拷貝的DNA序列如序列表中序列18-22所示；或者所述單拷貝激素反應(yīng)元件為序列表中序列8表示的頂3，其串聯(lián)3、6、9、12、15拷貝的DNA序列如序列表中序列 23-27所示。以上所述DNA結(jié)合序列在富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物中作為生物素標(biāo)記的 DNA誘餌的應(yīng)用也屬于本發(fā)明。本發(fā)明另一個目的是提供一種富集分離內(nèi)源核受體的方法。本發(fā)明所提供的富集分離內(nèi)源核受體的方法，包括以下步驟1)將所述的DNA結(jié)合序列連接入目標(biāo)載體的多克隆位點中，得到攜帶有串聯(lián)多拷貝激素反應(yīng)元件的重組載體；2)設(shè)計并合成一對生物素標(biāo)記的引物，其正、反向引物可分別與目標(biāo)載體多克隆位點上游、下游200bp處序列互補(bǔ)配對，以步驟1)的重組載體為模板，在所述引物對的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的擴(kuò)增片段，得到生物素標(biāo)記的DNA誘餌；3)將步驟2)獲得的生物素標(biāo)記的DNA誘餌固定到鏈親和素包被的磁珠上；4)內(nèi)源核受體的富集分離先提取細(xì)胞核蛋白，再將步驟3)獲得的固定有DNA誘餌的磁珠與細(xì)胞核蛋白進(jìn)行孵育，洗滌，內(nèi)源核受體及其復(fù)合物被DNA誘餌捕獲到固體磁珠上。其中所述步驟1)中的目標(biāo)載體為 pET24a、pET28a, pUC19、pCMV-Myc、pGEX4T_2、 PGEX4T-1 或 pcDNA3. 1，優(yōu)選為原核表達(dá)載體 pETMa、pET28a, pGEX4T_2 或 pGEX4T_l ；步驟 1)具體操作為a)將所述目標(biāo)載體用限制性內(nèi)切酶(同尾酶)消化產(chǎn)生相同粘性末端的線性化載體，經(jīng)堿性磷酸酶處理去除載體5’端的磷酸基團(tuán)；b)將預(yù)先合成的3-5拷貝激素反應(yīng)元件的寡核苷酸經(jīng)退火、磷酸化處理，產(chǎn)生可用于體外連接的帶粘末端的雙鏈DNA片段； c)將雙鏈DNA片段和步驟a)處理后的目標(biāo)載體依次通過體外連接、轉(zhuǎn)化、重組子鑒定和測序得到含串聯(lián)多拷貝激素反應(yīng)元件的重組載體。
所述步驟2)中上游引物BGPf的核苷酸序列如序列表中序列觀所示，下游引物 BGPr的核苷酸序列如序列表中序列四所示。所述步驟4)中細(xì)胞核蛋白的提取采用Doimce勻漿的方法，先用低鹽溶液破細(xì)胞膜，離心分離得到的細(xì)胞核經(jīng)doimce勻漿及高鹽溶液溶解，高速離心分離出核蛋白，經(jīng) BC150透析恢復(fù)內(nèi)源蛋白及其復(fù)合物的天然屬性。所述方法中還進(jìn)一步包括對步驟4)被DNA誘餌捕獲的內(nèi)源核受體及其復(fù)合物洗脫以從固體磁珠脫離得到蛋白產(chǎn)品的過程；或者對步驟4)被DNA誘餌捕獲的內(nèi)源核受體及其復(fù)合物用胰酶進(jìn)行酶解，取上清干燥得到內(nèi)源核受體及其復(fù)合物的酶解肽段混合物以用于質(zhì)譜鑒定。對核受體及其復(fù)合物的鑒定方法不必僅限于質(zhì)譜技術(shù)，也可采用基于抗體的免疫印跡、ELISA等分子生物學(xué)技術(shù)對特定核受體或輔調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行鑒定。本發(fā)明所提供的DNA結(jié)合序列除了可用于富集分離內(nèi)源核受體以檢測生物機(jī)體、 組織或細(xì)胞內(nèi)所有核受體的表達(dá)譜外，還可用于開發(fā)內(nèi)源核受體的檢測試劑盒或檢測芯片，如將所述DNA結(jié)合序列包被到96孔板上或固體片基表面，與待檢樣品細(xì)胞裂解液孵育， 結(jié)合特定核受體抗體共同包裝使用，可得到內(nèi)源核受體的ELISA檢測試劑盒或檢測芯片。本發(fā)明以上技術(shù)方案提供了富集分離內(nèi)源NR及其復(fù)合物的方法、其專用DNA結(jié)合序列及其應(yīng)用。本發(fā)明采用NR通過與HRE結(jié)合發(fā)揮功能的特性，以及HRE含保守核心識別元件的結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計開發(fā)出多種NR親合純化試劑(含串聯(lián)多拷貝HRE的DNA結(jié)合序列)， 以及一種基于DNA-蛋白相互作用的NR富集分離方法，對富集分離到的核受體及其復(fù)合物可采用高靈敏、高分辨率的新一代雙分壓線性阱和靜電場軌道阱組合質(zhì)譜儀LTQ Orbitrap Velos進(jìn)行鑒定，也可采用基于抗體的免疫印跡、ELISA等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。通過富集分離及適當(dāng)?shù)蔫b定手段對內(nèi)源NR及其復(fù)合物進(jìn)行分析，為從蛋白層面描繪NR活性及其作用方式提供了技術(shù)支持。本發(fā)明提供了一種高效、廣譜的NR富集分離方法，有效解決對內(nèi)源NR及輔調(diào)節(jié)蛋白的檢測難題，該技術(shù)方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究、臨床疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和新藥研發(fā)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為本發(fā)明富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物的方法的流程圖
具體實施例方式實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、用于富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物的專用DNA結(jié)合序列的獲得根據(jù)內(nèi)源核受體(NR)可與激素反應(yīng)元件(hormone response element, HRE)特異結(jié)合，以及HRE通常包含兩個保守半位點(5’-AGGTCA-3’)的特點，本發(fā)明設(shè)計了多種含保守半位點元件的DNA序列，兩個保守半位點在這些DNA序列中或者以直接重復(fù)(direct repeat, DR)或反向重復(fù)(inverted repeat, IR)排列，且兩個半位點由0_6bp堿基組成。這些DNA序列通過體外連接等技術(shù)可形成串聯(lián)多拷貝HRE序列，單一拷貝HRE含兩個保守半位點，各單拷貝HRE間由3^bp的接頭序列(Linker)串聯(lián)；表1示出串聯(lián)3拷貝HRE的 DNA結(jié)合序列，其中序列表中序列1-17所示為各單拷貝HRE，而采用體外連接策略連接后分別可獲得串聯(lián)6、9、12、15或18拷貝激素反應(yīng)元件的DNA結(jié)合序列，這些DNA結(jié)合序列可用于從細(xì)胞、組織、器官核蛋白中富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物。表1激素反應(yīng)元件及其3拷貝串聯(lián)序列
權(quán)利要求
1.一種DNA結(jié)合序列，是串聯(lián)多個單拷貝激素反應(yīng)元件的DNA序列，每個單拷貝激素反應(yīng)元件包含兩個由不同長度寡核苷酸鏈間隔的保守半位點，各單拷貝激素反應(yīng)元件間由 3_5bp的接頭序列(Linker)串聯(lián)，各單拷貝激素反應(yīng)元件均基于序列11所示的基礎(chǔ)單元設(shè)計，具體如序列表中序列1-17所示，拷貝數(shù)為3η (η為正整數(shù))。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合序列，其特征在于該DNA結(jié)合序列通過分子克隆技術(shù)及體外連接方法獲得，拷貝數(shù)為3、6、9、12、15或18。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA結(jié)合序列，其特征在于所述單拷貝激素反應(yīng)元件為序列表中序列1所表示的DR1，其串聯(lián)3、6、9、12、15拷貝的DNA序列如序列表中序列18-22 所示；或者所述單拷貝激素反應(yīng)元件為序列表中序列8表示的頂3，其串聯(lián)3、6、9、12、15拷貝的DNA序列如序列表中序列23-27所示。
4.權(quán)利要求1或2或3所示DNA結(jié)合序列在富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物中作為生物素標(biāo)記的DNA誘餌的應(yīng)用。
5.一種富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物的方法，包括以下步驟1)將權(quán)利要求1或2或3所述的DNA結(jié)合序列連接入目標(biāo)載體的多克隆位點中，得到攜帶有串聯(lián)多拷貝激素反應(yīng)元件的重組載體；2)設(shè)計并合成一對生物素標(biāo)記的引物，其正、反向引物可分別與目標(biāo)載體多克隆位點上游、下游200bp處序列互補(bǔ)配對，以步驟1)的重組載體為模板，在所述引物對的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的擴(kuò)增片段，得到生物素標(biāo)記的 DNA誘餌；3)將步驟幻獲得的生物素標(biāo)記的DNA誘餌固定到鏈親和素包被的磁珠上；4)內(nèi)源核受體的富集分離先提取細(xì)胞核蛋白，再將步驟3)獲得的固定有DNA誘餌的磁珠與細(xì)胞核蛋白進(jìn)行孵育，洗滌，內(nèi)源核受體及其復(fù)合物被DNA誘餌捕獲到固體磁珠上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物的方法，其特征在于所述步驟 1)中的目標(biāo)載體為 pET24a、pET28a、pUC19、pCMV_Myc、pGEX4T_2、pGEX4T_l 或 pcDNA3. 1，優(yōu)選為原核表達(dá)載體pETMa、pET28a, pGEX4T_2或pGEX4T_l ；步驟1)具體操作為a)將所述目標(biāo)載體用限制性內(nèi)切酶(同尾酶)消化產(chǎn)生相同粘性末端的線性化載體， 經(jīng)堿性磷酸酶處理去除載體5’端的磷酸基團(tuán)；b)將預(yù)先合成的3 5拷貝激素反應(yīng)元件的寡核苷酸經(jīng)退火、磷酸化處理，產(chǎn)生可用于體外連接的帶粘末端的雙鏈DNA片段；c)將雙鏈DNA片段和步驟a)處理后的目標(biāo)載體依次通過體外連接、轉(zhuǎn)化、重組子鑒定和測序得到含串聯(lián)多拷貝激素反應(yīng)元件的重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物的方法，其特征在于 所述步驟2)中上游引物BGPf的核苷酸序列如序列表中序列觀所示，下游引物BGPr的核苷酸序列如序列表中序列四所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一所述的富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物的方法，其特征在于所述步驟4)中細(xì)胞核蛋白的提取采用Doimce勻漿的方法，先用低鹽溶液破細(xì)胞膜，離心分離得到的細(xì)胞核經(jīng)doimce勻漿及高鹽溶液溶解，高速離心分離出核蛋白，經(jīng)BC150透析恢復(fù)內(nèi)源蛋白及其復(fù)合物的天然屬性。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項所述的富集分離內(nèi)源核受體及其復(fù)合物的方法，其特征在于所述方法中還進(jìn)一步包括對步驟4)被DNA誘餌捕獲的內(nèi)源核受體及其復(fù)合物洗脫以從固體磁珠脫離得到蛋白產(chǎn)品的過程；或者對步驟4)被DNA誘餌捕獲的內(nèi)源核受體及其復(fù)合物用胰酶進(jìn)行酶解，取上清干燥得到內(nèi)源核受體及其復(fù)合物的酶解肽段混合物以用于質(zhì)譜鑒定。
10. 一種內(nèi)源核受體的檢測芯片或ELISA檢測試劑盒，其特征在于，將權(quán)利要求1至4 任一項所述的DNA結(jié)合序列加入包被到96孔板上或固體片基表面形成檢測芯片；所述試劑盒包括權(quán)利要求1至4任一項所述的DNA結(jié)合序列，與特定核受體抗體共同包裝得到。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種富集分離內(nèi)源核受體的方法及其專用DNA結(jié)合序列。該序列是是串聯(lián)多個單拷貝激素反應(yīng)元件的DNA序列，每個單拷貝激素反應(yīng)元件包含兩個由不同長度寡核苷酸鏈間隔的保守半位點，各單拷貝激素反應(yīng)元件間由3-5bp的接頭序列(Linker)串聯(lián)，各單拷貝激素反應(yīng)元件均基于序列11所示的基礎(chǔ)單元設(shè)計，具體如序列表中序列1-17所示，拷貝數(shù)為3n(n為正整數(shù))。本發(fā)明提供了一種高效、廣譜的核受體富集分離方法，有效解決對內(nèi)源NR及輔調(diào)節(jié)蛋白的檢測難題，該技術(shù)方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究、臨床疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和新藥研發(fā)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/68GK102559680SQ20111045767
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者丁琛, 劉萬霖, 劉明偉, 劉瓊明, 宋雷, 秦鈞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 美國貝勒醫(yī)學(xué)院