專利名稱：獨立式生物檢測裝置、方法和應(yīng)用的制作方法
獨立式生物檢測裝置、方法和應(yīng)用交叉引用的相關(guān)申請本申請要求下列美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)2010年5月19日遞交的申請No. 61/346, 202 ;2010 年 6 月 17 日遞交的申請 No. 61/355，773 ;2010 年 10 月 21 日遞交的申請No. 61/405, 339 ；2010年2月23日遞交的申請No. 61/307, 186 ；2010年2月23日遞交的申請 No. 61/307，121 ;2010 年 10 月 14 日遞交的申請 No. 61/393，237 ;2010 年 8 月 17日遞交的申請No. 61/374，302 ;以及2010年8月12日遞交的美國申請No. 12/855058，該申請為2005年10月3日遞交的美國申請No. 11/242,694的繼續(xù)申請，其為2004年10月13日遞交的美國申請No. 10/964, 216的部分繼續(xù)申請；2007年I月5日遞交的美國申請No. 11/650,006，其要求2006年I月19日遞交的美國臨時申請No. 60/760，552的優(yōu)先權(quán)；2008年10月10日遞交的美國申請No. 12/249，872，其要求2007年10月12日遞交的美國臨時申請No. 60/979, 515的優(yōu)先權(quán)；所有上述申請的內(nèi)容以引用的方式全文并入于此。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明實施方案總體上涉及微流體學領(lǐng)域，更具體地涉及獨立式、基于微流體的生物檢測裝置及其相應(yīng)的方法和應(yīng)用。
2.
背景技術(shù)：
生化檢測通常用于研究、臨床、環(huán)境和工業(yè)設(shè)置以測定或定量某些基因序列、抗原、疾病和病原體的存在或數(shù)量。所述檢測通常用于確定存在于宿主生物體或樣本中的生物體包括寄生蟲、真菌、細菌和病毒。在某些條件下檢測可提供定量測量，其可用于計算感染或疾病的程度并隨著時間監(jiān)測疾病狀態(tài)。通常，生化檢測測定由研究、臨床、環(huán)境和工業(yè)來源的樣品提取的抗原(免疫檢測)或核酸(基于核酸的檢測或分子檢測)。分子生物學包括基于核酸的檢測，其可被寬泛地定義為生物學的一個分支，該分支研究大分子如核酸和蛋白質(zhì)的信息、結(jié)構(gòu)和功能以及它們在細胞復制和遺傳信息傳遞及核酸調(diào)控方面的作用，從而使其能夠被測序、突變和進一步調(diào)控生物體內(nèi)的基因組以研究該突變的生物學效果。生物化學和分子生物學的常規(guī)實踐需要物理方法資源，其規(guī)模通常與被研究對象的大小成反比。例如，與制備和純化生物樣品化學相關(guān)的裝置和方法，如核酸片段前瞻性分析無疑需要帶有無菌設(shè)施的全面的生物實驗。而且，通常需要類似規(guī)模的單獨環(huán)境的設(shè)施來進行已知的核酸擴增程序，如用于擴增所述核酸片段的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)?！拔⒘黧w學”通常涉及處理少量流體的系統(tǒng)、器件和方法。微流體系統(tǒng)能夠整合操縱流體的多種操作。這樣的流體可包括化學制品或生物樣品。這些系統(tǒng)也有很多應(yīng)用領(lǐng)域，如生物學檢測(用于如醫(yī)療診斷、藥物發(fā)現(xiàn)和藥物遞送)、生化傳感器或生命科學研究，通常還有環(huán)境分析、工業(yè)過程監(jiān)測和食品安全檢測。微流體器件的一種類型為微流體芯片。微流體芯片可包括微尺度特征或(“微特征”)，如通道、閥門、泵、反應(yīng)器和/或槽以儲存流體、在所述芯片的各種不同位置來回遞送流體，和/或反應(yīng)試劑。然而，現(xiàn)有微流體系統(tǒng)缺乏適當機制來使得除了通過上述流動方式以外還能可控地操縱多種流體，因此，限制了這些系統(tǒng)在各種化學或生物學檢測中的實際應(yīng)用。這是因為現(xiàn)實中的檢測通常需要重復操縱用于各種分析目的的不同試劑。另外，許多現(xiàn)有的微流體器件限于一種特定用途，不經(jīng)完全重新設(shè)計不容易適于或適用其他應(yīng)用。這些器件缺乏模塊性，因此無法共用能使一項設(shè)計實現(xiàn)多種功能的通用器件部件。由于每項用途需要不同系統(tǒng)的產(chǎn)品，這種缺乏靈活性導致產(chǎn)品成本增加。而且，許多現(xiàn)有的微流體系統(tǒng)缺乏任何能夠易于測定該檢測中所產(chǎn)生的分析物相互作用或存在的簡單的終點法檢測措施。以實例的方式，檢測后通常用目測樣品顏色變化來評估檢測結(jié)果。因此人們需要改進的分析生物或化學樣品的微流體系統(tǒng)，尤其是測定和分析源自這類樣品，如DNA、RNA、氨基酸和蛋白質(zhì)的生物活性大分子。期望該系統(tǒng)能夠規(guī)模生產(chǎn)、低·成本且最好易于使用。期望該系統(tǒng)易于操作且許多或基本上所有流體處理步驟可自動化。期望該系統(tǒng)可用戶化和模塊化，從而該系統(tǒng)可容易和快速地重新配置以適于需要測定大分子的各種應(yīng)用。也期望該系統(tǒng)能提供簡單而有意義的檢測結(jié)果。當進行基于核酸的檢測時，樣品制備是首要而最關(guān)鍵的步驟以釋放和穩(wěn)定可能存在于樣品中的靶核酸。樣品制備也可用于消除核酸酶活性和去除或滅活靶核酸的核酸擴增或測定的潛在抑制劑。樣品制備方法可以不同且部分取決于所處理樣品的特性。各種細胞裂解方法為本領(lǐng)域所熟知且設(shè)計為用于從懸浮于原始樣品中的細胞或病毒中特異性分離核酸。細胞裂解之后，需要對樣品中釋放的核酸進行純化以將擴增反應(yīng)的潛在抑制劑從核酸中去除。通常純化是一件繁重而重復性操作的任務(wù)，其耗費大量試劑、重要設(shè)備和勞力，且通常該步驟與下游擴增反應(yīng)失敗最為相關(guān)。純化之后，通常期望用任何本領(lǐng)域已知的一些核酸擴增方法來擴增特定的核酸序列。具體地，核酸擴增酶法擴增核酸擴增物(多個拷貝)，其含有與擴增中的核酸序列同源的序列。本領(lǐng)域使用的核酸擴增方法的實例包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、鏈替代擴增(SDA)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)的擴增(TAA)、冷PCR和非酶法擴增技術(shù)(NEAT)。當存在于樣品中的靶序列的量很少時，核酸擴增尤其有益。通過擴增所述靶序列并測定合成的擴增物，可大大提高檢測的靈敏度，因為檢測之初只需少量靶序列以更好地保證對目標生物體或病毒樣品的核酸測定。靶核酸序列的測定需要使用核酸探針，其具有基本上與靶序列或其擴增物互補的核苷酸堿基序列。在選擇性的檢測條件下，所述探針將以使從業(yè)者能夠測定樣品中靶序列存在的方式與靶序列或其擴增物雜交。有效的探針被設(shè)計為防止與可能干擾檢測靶序列存在的任何核酸序列進行非特異性雜交。探針和/或擴增物可包括能夠被檢測的標記，其中所述標記為，例如，放射性標記、熒光染料、生物素、酶、電化學或化學發(fā)光化合物。當手動操作時，與基于核酸的檢測相關(guān)的復雜性和大量處理步驟會造成從業(yè)者-錯誤、暴露于病原體和檢測之間交叉污染和其他的可能性。遵照操作手冊格式，從業(yè)者必須安全而便利地并置測試樣品、試劑、廢棄的容器、檢測用容器、吸管尖頭、抽吸器、分配器，同時要特別小心不能弄混物品架、測試樣品、測試用容器和相關(guān)尖頭，或碰翻任何管、尖頭、容器或儀器。另外，從業(yè)者必須小心地手持非固定儀器以要求精確操作的方式實施抽吸和分配步驟，以避免檢測容器、氣溶膠形成或磁性粒子的抽吸、或用于目標捕獲檢測的其他基板之間的不必要的接觸。人們需要一種自動化分析器，其可解決很多與手動操作方法相關(guān)的進行基于核酸檢測的擔憂。特別是，通過使基于核酸的檢測的各種操作步驟自動化能夠?qū)崿F(xiàn)很大的優(yōu)勢，包括大大減少用戶錯誤、病原體暴露、污染和泄漏的風險?；诤怂岬臋z測步驟的自動化也將減少從業(yè)者的訓練量且基本上排除由于大量手動操作應(yīng)用的物理傷害來源。發(fā)明概述通過提供獨立式基于微流體的生物檢測裝置、其相應(yīng)的方法和應(yīng)用，本發(fā)明的實施方案和細節(jié)滿足了上述需求。根據(jù)一個非限制的示例性實施方案，獨立式全自動生物檢測裝置包括機殼；設(shè)置于所述機殼中的液分平臺，其包括可控-活動試劑分配系統(tǒng)；設(shè)置于所述機殼中的試劑 供給部件；氣分平臺，其可拆卸地設(shè)置于機殼中與液分平臺共用的空間內(nèi)，可拆卸地連接至流體傳輸層和多個槽，其中待引入的所述流體傳輸層、所述槽和測試樣品設(shè)置于所述機殼中與液分平臺分開的空間內(nèi)；氣動供給系統(tǒng)，其在機殼中與液分平臺分開的空間內(nèi)可拆卸地連接至氣分平臺；以及設(shè)置于所述機殼中的控制系統(tǒng)，其連接至至少一個所述液分平臺和所述氣動供給系統(tǒng)。根據(jù)一個非限制的方面，所述液分平臺還包括移動控制系統(tǒng)，其可操作地連接至所述試劑分配系統(tǒng)，其中所述試劑分配系統(tǒng)包括具有終端分配頭的試劑分配部件；以及連接至試劑分配系統(tǒng)的照相機，其視場至少包括槽內(nèi)目標物的選定區(qū)。根據(jù)一個非限制的方面，所述氣分平臺與具有至少一種檢測能力的微流體系統(tǒng)連接。所述微流體系統(tǒng)還可包括多層式、一體化、聚合材料的、非彈性微流體部件,所述微流體部件具有包括多個氣動薄膜微特征的給定配置。所述氣分平臺下側(cè)可具有一個或多個僅氣動的(即，無“液流的”)端口，且設(shè)置于其中的一個或多個僅氣動的通道流體連接至在流體傳輸層的一個或多個閥門和所述一個或多個僅氣動的端口 ；其中所述一個或多個氣動端口具有固定配置，且所述一個或多個僅氣動的通道具有給定配置，其特定地匹配于在流體傳輸層的一個或多個氣動薄膜的給定配置。所述氣動供給系統(tǒng)還可包括讓氣動信號從其中通過的一個或多個口管，其流體連接至所述一個或多個僅氣動的端口 ；其中所述一個或多個口管具有固定配置，其特定地匹配于所述氣分平臺的一個或多個僅氣動的端口的固定配置并可拆卸地連接至所述氣分平臺。各多層式一體化微流體部件還可包括聚合材料的、非彈性基板，其中設(shè)置有一個或多個流體通道，各所述流體通道具有入口端和出口端；至少一個試劑槽，其能夠容納試劑材料；至少一個雙向薄膜泵，包括至少三個基于非彈性膜的薄膜閥結(jié)構(gòu)；以及閥門，其設(shè)置為流體連接至至少一個試劑槽和至少一個入口端，其中所述閥門適于可控地引導材料從至少一個試劑槽經(jīng)由至少一個連接至所述閥門的所述通道流向一個或多個槽，進一步地，其中各多層式一體化微流體部件由非彈性聚合材料構(gòu)成。各基板還可包括一個或多個分析槽，各分析槽內(nèi)設(shè)置有分析系統(tǒng)。所述分析系統(tǒng)可為下述之一比色的、熒光比色的、化學發(fā)光的、電化學的、電泳的、橫流的、蛋白質(zhì)微陣列、核酸微陣列、熒光的分析系統(tǒng)。所述的裝置還可包括具有一個或多個周邊含凹口的緊固環(huán)結(jié)構(gòu)，其中所述分析膜可操作地置于所述緊固環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)。所述緊固環(huán)結(jié)構(gòu)可包括兩個各自具有一個或多個周邊含凹口的相對的環(huán)結(jié)構(gòu)，進一步地，其中所述分析膜設(shè)置于所述兩個相對的環(huán)結(jié)構(gòu)中間。所述裝置還包括一個或多個設(shè)置于不同位置的加熱器，以在分析過程中有效地加熱所述測試樣品或其部分。加熱器可設(shè)置在可磁吸接合的槽附近。所述裝置還可包括管安裝層，其附連于包括一個或多個管的所述基板的底面，各管具有流體連接至分別的流體通道的近端和從基板上垂直向下伸出的遠端；以及分別的一個或多個擴增/反應(yīng)室，在其頂部區(qū)域附連有所述管安裝層從而各管的遠端設(shè)置為基本上靠近其底部區(qū)域。所述裝置還可包括可操作地設(shè)置于槽或通道下的磁性組件，其中所述磁性組件還包括磁鐵、磁鐵支架、活塞桿和氣動活塞組件(或者，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)。加熱器組件可操作地連接至所述磁性組件。本發(fā)明的另一個非限制的示例性實施方案涉及用于分離、擴增和分析可能存在于流體測試樣品中的靶核酸序列的自動化方法。該方法包括以下步驟提供操作微流體系統(tǒng)的氣分平臺，所述微流體系統(tǒng)中設(shè)置有流體傳輸層和流體通道，以及與所述氣分平臺連接的槽；將所述流體測試樣品引入至所述流體通道；從流體連接至流體傳輸層的至少一個分立的槽向所述通道提供至少一種試劑；在流體傳輸層、槽或擴增反應(yīng)器的區(qū)域內(nèi)混合所述流體測試樣品和所述至少一種試劑；將所述流體測試樣品輸送至可操作地連通至流體傳輸 層的溫控擴增/反應(yīng)反應(yīng)器；在足以使靶核酸序列得以擴增的條件下，于所述擴增/反應(yīng)反應(yīng)器中孵化所述流體測試樣品；將所述流體測試樣品輸送至分析槽；以及分析來自測試樣品的擴增的靶核酸序列，其中所述測試樣品從流體傳輸層中的起始位置被輸送至分析槽，并與任何其他樣品和所述氣分平臺及分配系統(tǒng)相隔離。在一個方面，所述輸送和混合步驟通過經(jīng)由至少一個由所述氣分平臺操作的多薄膜閥的泵來泵送所述流體測試樣品和一定量至少一種試劑通過所述流體傳輸層來完成。根據(jù)一個方面，所述分析步驟還可包括在微流體系統(tǒng)中的微陣列分析槽內(nèi)進行微陣列分析。所述自動化方法還可包括在微陣列分析槽內(nèi)提供微陣列分析膜；使流體在微陣列分析膜表面上流動；沿著微陣列分析膜外圍通過流體出口路線基本上去除所述流體。所述自動化方法還可包括在微陣列分析槽內(nèi)提供微陣列分析膜；并使流體在微陣列分析膜表面上向后和向前交替流動。所述自動化方法還可包括向微陣列分析膜提供熱量。在另一個非限制的實施方案中，所述用于分離、擴增和分析可能存在于流體測試樣品中的靶核酸序列的自動化方法，所述靶核酸序列與目標疾病或病癥、傳染因子、病原體、癌癥易患傾向，或?qū)δ繕怂幬铩⑺幬锝M合物、化學制品或化合物的敏感傾向相關(guān)。在另一個非限制的實施方案中，所述用于分離、擴增和分析可能存在于流體測試樣品中的靶核酸序列的自動化方法，所述靶核酸序列包括SNP。在另一個非限制的實施方案中，所述用于分離、擴增和分析可能存在于流體測試樣品中的靶核酸序列的自動化方法，所述疾病或病癥為HPV或敗血癥。在另一個非限制的實施方案中，所述用于分離、擴增和分析可能存在于流體測試樣品中的靶核酸序列的自動化方法，所述靶核酸序列與華法林敏感傾向或?qū)θA法林治療反應(yīng)的抗凝傾向相關(guān)。在另一個非限制的實施方案中，所述用于分離、擴增和分析可能存在于流體測試樣品中的靶核酸序列的自動化方法，所述分析步驟包括測定所述擴增的靶核酸序列和靶核酸序列探針之間的相互作用。
在另一個非限制的實施方案中，所述用于分離、擴增和分析可能存在于流體測試樣品中的靶核酸序列的自動化方法，所述分析步驟包括測定下列情形的存在或傾向所述目標疾病或病癥，所述傳染因子，所述病原體，癌癥，或?qū)λ瞿繕怂幬?、藥物組合物、化學制品或化合物敏感。在另一個非限制的實施方案中，所述用于分離、擴增和分析可能存在于流體測試樣品中的靶核酸序列的自動化方法，根據(jù)權(quán)利要求26所述的自動化方法，其中所述分析步驟包括測定擴增的靶核酸序列的量或水平，其中所述方法還包括將所述靶核酸序列的量或水平與預選的量或水平進行比較。根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述量或水平與預選的量或水平的差異表示有下列情形存在或傾向目標疾病或病癥，傳染因子，病原體，癌癥，或?qū)δ繕怂幬?、藥物組合物、化學制品或化合物敏感。本發(fā)明這些以及附加特征和優(yōu)點將在下述詳細說明中陳述，并通過這些描述而對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說非常明顯，或通過按照該詳細描述、說明書附圖和所附的權(quán)利要求書實施本發(fā)明而被理解。·應(yīng)理解，前述總體描述和下述詳細描述僅為本發(fā)明實施方案的示例且旨在提供對要求保護的本發(fā)明特性和特征理解的概觀和框架。所附附圖也包括于其中以提供對要求保護的本發(fā)明各種實施方案和方面的進一步理解，且并入其中構(gòu)成該申請文件的一部分。
圖I所示為本發(fā)明一個示例實施方案的獨立式生物檢測裝置的透視圖；圖2所示為圖I所示的獨立式生物檢測裝置的正視圖；圖3所示為圖I所示的獨立式生物檢測裝置的俯視圖；圖4所示為圖I所示的獨立式生物檢測裝置的透視圖；圖5所示為本發(fā)明一個示例性方面的“6乘4”布置的槽的俯視圖；圖6所示為本發(fā)明一個示例性方面的“6乘4”布置的槽的透視圖，所述槽連接至流體傳輸層并安裝在所述氣分平臺上；圖7所示為本發(fā)明一個示例性方面的橫截面俯視圖，其為“6乘4”布置的所述氣分平臺的頂部墊圈層和與擴增反應(yīng)器結(jié)合的加熱器；圖8A-C所示分別為本發(fā)明一個示例性方面的頂視透視圖、俯視圖和仰視透視圖，其為“6乘4”布置的所述獨立式生物檢測裝置氣分平臺的底部；圖9所示為本發(fā)明一個示例性方面的分層的橫截面俯視圖，其為“4檢測單元”布置的槽、流體通道和擴增反應(yīng)器，它們?yōu)榱黧w傳輸層和槽層的組合；圖10A-K所示為本發(fā)明一個示例性方面的橫截面俯視圖，其為使用通道、反應(yīng)器和槽的示例性處理階段，當由所述氣分平臺操作時它們位于組合的流體傳輸層和槽層中；圖11所示為本發(fā)明一個示例性方面的透視圖，其為包括槽層的“4檢測單元”部件、包括膜層的流體傳輸層和擴增反應(yīng)器；圖12所示為本發(fā)明一個示例性方面的橫截面?zhèn)纫晥D，其為圖11所示的“4檢測單元”部件；圖13A所示為本發(fā)明一個示例性方面的分解圖，其為包括槽層的示例性“4檢測單元”部件、流體層、膜層、包括小細管的擴增反應(yīng)器，所述小細管流管用于加注和排空擴增反應(yīng)器、用于分析槽的穿孔環(huán)和膜系統(tǒng)、二氧化硅過濾膜和穿孔的保持環(huán)；圖13B所示為本發(fā)明一個示例性方面的示例性的具有流動通道的穿孔環(huán)、分析膜和膜支撐結(jié)構(gòu)；圖14A所示為本發(fā)明一個示例性方面的一個替代性實施方案的透視圖，其為“4檢測單元”部件分析區(qū)的槽層，所述部件包括分析槽的覆蓋的有通風口部件，其未使用穿孔環(huán)組件來支持分析膜；圖14B所示為本發(fā)明一個示例性方面的近觀透視圖，其為覆蓋的有通風口的分析槽特征，包括分析膜模型和用于保持分析膜的分部特征；圖14C所示為本發(fā)明一個示例性方面的橫截面俯視圖，其為所述氣分平臺頂部墊圈層的4檢測單元布置、與擴增反應(yīng)器結(jié)合的加熱器和結(jié)合于分析槽下表面的加熱器；圖14D所示為所述氣分平臺上層的內(nèi)部氣動通道，其顯示從氣動供給系統(tǒng)導入至所述氣分平臺底層的氣動信號是如何進一步分開并遞送至所述氣分平臺表面上的特定墊圈層空隙；圖15A所示為本發(fā)明一個示例性方面的分解透視圖，其為氣分平臺的單個檢測單元，結(jié)合有氣動的磁鐵和多功能加熱器以及任選的位于流體層和氣分平臺之間界面的薄膜層；圖15B所示為本發(fā)明一個示例性方面的分解透視圖，其為圖15A所示的單個檢測單元，包括流體傳輸層的薄膜層和所述氣分平臺上的墊圈層； 圖16所示為本發(fā)明一個示例性方面的分層的橫截面俯視圖，其為所述槽、流體通道和擴增反應(yīng)器的“單個檢測單元”布置，它們是流體傳輸層和槽層的組合；圖17A-0所示為本發(fā)明一個示例性方面的分層的頂視圖，其為使用通道、反應(yīng)器和槽的示例性處理階段，當由所述氣分平臺操作時它們位于組合的流體傳輸層和槽層中；圖18所示為本發(fā)明一個示例性方面的橫截面?zhèn)纫晥D，其為單個檢測單元的所述氣分平臺和微流體系統(tǒng)，顯示了組合有包括非加熱的磁性組件氣動磁鐵和多個加熱的反應(yīng)位點的功能特征；圖19所示為本發(fā)明一個示例性方面的橫截面?zhèn)纫晥D，其為單個檢測單元的所述氣分平臺和微流體系統(tǒng)，包括組合有氣動、加熱的磁性組件和多個加熱的反應(yīng)位點的功能特征；圖20所示為本發(fā)明一個示例性方面的分層的橫截面俯視圖，其為所述槽、流體通道和擴增反應(yīng)器的“雙檢測單元”布置，它們是流體傳輸層和槽層的組合；圖21A-K所示為本發(fā)明一個示例性方面的分層的頂視圖，其為使用通道、反應(yīng)器和槽的示例性處理階段，當由所述氣分平臺操作時它們位于組合的流體傳輸層和槽層中；圖22所示為本發(fā)明一個示例性方面的雙檢測單元布置的分解圖，其顯示所述槽層、流體層、薄膜層和擴增反應(yīng)器，包括用于加注和排空擴增反應(yīng)器的細流管；圖23為本發(fā)明一個非限制的說明性方法的多功能加熱器的分解圖；圖24為根據(jù)本發(fā)明的一個非限制的說明性方法，其示意性說明固定用于在CARD上處理的組織樣品的過程；圖25為根據(jù)本發(fā)明的一個非限制的說明性方法，其示意性說明CARD上樣品細胞裂解過程；圖26A-B:引物延長方法。含有3’檢測核苷酸的端氨基捕獲探針共價連接至濾膜。擴增之后，所述擴增物變性，且互補鏈對探針退火。如果在探針的3’核苷酸和所述擴增物(A)之間完全匹配，就會發(fā)生合并生物素化核苷酸的DNA合成。如果在探針的3’核苷酸和所述擴增物(A)之間不匹配，就不會發(fā)生DNA合成，從而不會合并生物素。進一步的詳情參見實施例2 ；圖27 :華法林SNP檢測的在CARD上的實施方案中來自引物延伸部件的代表性圖像。變性擴增物與固相捕獲探針雜交之后檢測到有色的沉淀，在DNA聚合酶存在下合并生物素化的dUTP和未標記的dCTP、dATP和dGTP，最后與HRP-鏈霉共軛體(streptavidinylated HRP)和底物一起孵化。圖例按鍵(key)顯示了捕獲探針祀向的等位基因。成像之后，用在WT點樣上檢測到的像素數(shù)目除以在突變體點樣上檢測到的像素數(shù)目。WT像素/突變體像素>1顯示為純合子WT ；WT像素/突變體像素=1顯示為雜合子；而WT像素/突變體像素〈I顯示為純合子突變體。在該過濾膜上顯示所得到的基因型為VKORCl-雜合子；CYP2C9*2-純合子 WT ;和 CYP2C9*3_ 純合子 WT ；圖28 :使用華法林SNP檢測結(jié)合在CARD上的實施方案中的引物延伸獲得的7個個體基因型的結(jié)果。7個個體口腔粘膜拭子(buccalswab)樣品在檢測膜上的結(jié)果顯示于該圖的上部。該圖的下部顯示從這些檢測膜中讀出的基因型。另外，所有基因型通過雙向測序進行驗證。這些基因型在20個測試的個體中被表現(xiàn)出來。更為稀少的基因型組合預計 不在該小樣品組中；圖29 :使用華法林SNP檢測結(jié)合在CARD上的實施方案中的RDB獲得的個體基因型的結(jié)果。4個個體口腔粘膜拭子(buccal swab)樣品在檢測膜上的結(jié)果顯示于該圖的上部。所述檢測膜下部的表顯示從這些檢測膜中讀出的基因型。該圖底部的檢測膜鍵顯示了在每個4微陣列中的點樣系統(tǒng)。圖30，表I :捕獲探針序列，SEQ ID NOS :1_20。詳情參見實施例4 ；圖31，表2:帶有特異性型LI序列的正向和反向引物，SEQ IDNOS:23-460詳情參見實施例4 ；圖32，表3A :用于擴增所述HPV LI基因的正向引物，SEQ IDNOS: 50-770詳情參見實施例4 ；圖33，表3B :用于擴增所述HPV LI基因的生物素化的反向引物，SEQ IDN0S: 78-105。詳情參見實施例4 ；圖34 :用LI引物混合物(primer mix)確認HPV擴增。將含有質(zhì)粒的全長HPV，類型6、I、16、18和52，以及含有質(zhì)粒的部分HPV類型35和LI引物混合物一起用于擴增。在16ng C33A核酸背景下基于1000個拷貝的質(zhì)粒DNA進行40個循環(huán)的PCR擴增。M= IOObpDNA。詳情參見實施例4 ；圖35A-D :PCR擴增梯度稀釋的HPV克隆。A)用于分離2倍增長量擴增的含質(zhì)粒全長HPV 16和HPV-18產(chǎn)物的凝膠的代表性圖像；泳道如下標記物(IOObp DNA梯狀條帶)、0、122、244、488、977、1，953,3, 906,7, 813,15, 625,31, 250,62, 500,125, 000 個拷貝的 HPV質(zhì)粒。下部圖像A為代表性凝膠圖像，所示為與上部圖像中所示的等量樣品中的球蛋白擴增產(chǎn)物的分離。具體地，其為上述所示HPV 16圖像的伴侶凝膠。B)含質(zhì)粒全長(6、11、16、18、52)或部分(35)HPV的PCR產(chǎn)物分離的凝膠圖像分析。C)來自臨床樣品的HPV LI克隆的PCR產(chǎn)物分離的凝膠圖像分析。D)圖A所示的各曲線中的伴侶球蛋白凝膠圖像分析。這些條形圖表示在不同數(shù)目的輸入HPV分子存在下球蛋白擴增的平均值和標準偏差。詳情參見實施例4 ；圖36 :在梯度稀釋的C33A純化核酸中PCR擴增β -球蛋白。上圖用于分離在2倍增長量C33A純化核酸中的β-球蛋白擴增產(chǎn)物的凝膠代表性圖像。M=標記物(IOObpDNA梯狀條帶)、對應(yīng)于總輸入核酸0、0. 025、0. 5、1、2、4、8和16ng。下圖進行30(N=4)、35(N=3)或40(N=2)個循環(huán)的PCR擴增后的分離產(chǎn)物的凝膠圖像分析。數(shù)據(jù)點為平均值+/-標準偏差。詳情參見實施例4 ；圖37A-B A.在I. 6ng/ μ I基因組核酸背景下10個拷貝/ μ I的HPV擴增結(jié)果。上部圖像所示為HPV擴增物的凝膠圖像，底部圖像所示為對應(yīng)的球蛋白擴增物。B. HPV和球蛋白擴增物的各組合的RDB結(jié)果。詳情參見實施例4 ；圖38 :純化自臨床樣品的核酸。紅色條，基于在260nm處的吸光度的DNA產(chǎn)量ng/ul (左Y-軸)。藍色曲線對分離β -球蛋白PCR擴增產(chǎn)物的凝膠進行圖像分析獲得的像素強度(右Y-軸)。不考慮濃度對I μ I純化核酸進行30個循環(huán)的擴增。還顯示了兩個數(shù)據(jù)組的線性趨勢線。詳情參見實施例4 ； 圖39A-C :臨床樣品基因組當量的估計。用來自選定的臨床樣品的稀釋的純化核酸進行球蛋白擴增。Α)用無RNA的C33A DNARNA-DNA制作標準曲線。B)和C)基于A中的嵌入圖所示的線性方程進行圖像分析以計算等量的“基因組”(后面的條形)。也顯示了基于在260nm處吸光度的實際輸入核酸(前面的條形)。詳情參見實施例4 ；圖40，表4 :臨床樣品的PCR和RDB結(jié)果概述。如表中所示，表明PCR后HPV擴增條帶的75%(88/117)的樣品和45%(40/88)的HPV擴增物陽性被RDB上的HPV-特異性探針捕獲。詳情參見實施例4 ；圖41A-B A :使用Digene系統(tǒng)，相對于實施例4描述的實施方案獲得的HPV結(jié)果進行HPV高風險樣品陽性比較；B :使用Digene系統(tǒng)，實施例4描述的實施方案檢測到6個高風險的樣品表現(xiàn)為陰性，表明了實施例4實施方案在該檢測的靈敏度和特異性方面的優(yōu)勢。詳情參見實施例4;圖42:HPV 16L1的基因序列(SEQ ID NO: 106)，其含有用于擴增的對應(yīng)于各種靶區(qū)域的突出序列(SEQ ID N0S: 107-112)。詳情參見實施例4 ;圖43A-C A HPV像素強度隨相應(yīng)的球蛋白像素強度增加的標圖結(jié)果；B HPV與球蛋白的像素比例標圖相對從低到高的風險HPV類型；C HPV與球蛋白的像素比例標圖相對從低到高的風險HPV類型。所述“Digene”系列標繪了可市購的Digene檢測與本檢測相比較結(jié)果的數(shù)據(jù)。所述嵌入圖顯示了被標示和合并到主圖中的Digene檢測結(jié)果(不同刻度的Y-軸)。詳情參見實施例4 ；圖44所示為使用實施例5描述的橫流層析檢測，基于CARD測定稀少靶標的結(jié)果。檢測到隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)熱激產(chǎn)生的mRNA。IMS=磁珠免疫分離。HS=熱激；以及圖45所示為使用圖20所示的CARD配置，根據(jù)圖21_22中所示的方法，成功地對DNA進行了純化、洗脫和擴增。發(fā)明詳述下面將詳細參照本發(fā)明的示例性實施方案，描述其實施例，并進一步在附圖中進行說明。盡可能在附圖中使用同樣的數(shù)字標號表示同樣或類似部件。圖1-4，說明了本發(fā)明一個實施方案的獨立式全自動生物檢測裝置10。該裝置包括機殼11 ;設(shè)置于所述機殼中的液分平臺12，其包括可控的可移動試劑分配系統(tǒng)13 ;設(shè)置于所述機殼中的試劑供給部件14，其可容納供給一種或多種試劑，并可操作地連接至與所述分配系統(tǒng)；氣分平臺15，可拆卸地設(shè)置于機殼11中與液分平臺12共用的空間內(nèi)，其操作影響流體傳輸層16中的流體輸送和在所述氣分平臺15對面附連至流體傳輸層16的多個槽17，其中，待引入其中的所述流體傳輸層16、槽17和測試樣品設(shè)置于與液分平臺12分開的空間內(nèi)；氣動供給系統(tǒng)18，其作用是提供經(jīng)所述氣分平臺15傳送的氣動信號(正和負(真空)壓)以實現(xiàn)在流體傳輸層16及其多個槽17中的測試樣品和試劑的傳輸，其設(shè)置于所述氣分平臺15上并可操作地連接至在機殼11中與液分平臺12分開的空間內(nèi)的氣動供給系統(tǒng)18 ;以及設(shè)置于所述機殼中11中的控制系統(tǒng)19，其用于控制液分平臺12、加熱系統(tǒng)(29、48和48a)、冷卻系統(tǒng)(通過從加熱器處的氣動供給系統(tǒng)18引導一股被或未被主動冷卻的壓縮空氣或從風扇處供給氣流來實施)和氣動供給系統(tǒng)18。對于圖1-4、5、6、9、10-13、16和20，獨立式生物檢測裝置10設(shè)計為僅需所述檢測裝置10的操作員將目標生物樣品引入至槽層17上多個端口 33n中的特定的樣品輸入端口33，槽層17覆蓋了流體傳輸層16 (附連有薄膜層30)，其一起由所述氣分平臺15操縱，然后啟動控制系統(tǒng)19的起始順序，從而所述樣品被完全自動化地處理檢測直至該檢測的終點。 如圖中所描述，有24個以“6乘4”模式布置的分別的示例性檢測單元，整個處理順序中每個樣品在其檢測單元內(nèi)且與所有其他樣品和所述生物檢測裝置分開。盡管所述示例性實施方案中描述了 24個檢測單元，其下限為一個檢測單元，沒有具體的上限。在操作中，一旦待分析的樣品被引入至槽層17的樣品輸入槽33，樣品就自動地從樣品輸入槽被吸入到流體傳輸層16，或者試劑通過流體傳輸層16從分開的槽傳輸至樣品輸入槽33。然后，無需操作員的干預，分析樣品需要的所有步驟將在槽層17和/或流體傳輸層16中進行，包括在設(shè)置于流體層16的合適反應(yīng)器(例如31，圖11、12)中進行擴增或通過所述系統(tǒng)的細流管44連通至流體層16。在完成自動地分析樣品需要的所有一系列處理步驟中，所述系統(tǒng)保持所述樣品與試劑分配系統(tǒng)13、所述氣分平臺15和氣動供給系統(tǒng)18相隔離。這一隔離的特征消除了交叉污染的問題，該問題不可避免地會增加成本并減少目前在用的其他系統(tǒng)的可靠性，這些系統(tǒng)執(zhí)行類似任務(wù)但需要在一個裝置內(nèi)將處理中的樣品從一個站點移送至另一個站點，或需要所述分配系統(tǒng)來使得在微流體系統(tǒng)內(nèi)流動。所述裝置10包括機殼11，其設(shè)計為在操作中包圍該系統(tǒng)的內(nèi)部，從而該全自動處理能夠在無操作員干擾下進行至完成。機殼11還包圍控制系統(tǒng)19、液分平臺12、試劑供給部件14，以及操縱所述氣分平臺15的氣動供給系統(tǒng)18。圖1-4還描述了試劑分配系統(tǒng)13。所述試劑分配系統(tǒng)附連至所述X-Y-Z移動控制系統(tǒng)且連同液分平臺12。分配系統(tǒng)13由分配針頭23、大存儲環(huán)25、小存儲環(huán)26、用于每個存儲環(huán)25和26的電磁閥24及照相機27組成。分配針頭23由具有不同的各自選定內(nèi)徑的雙孔管或長度為L的長針結(jié)構(gòu)組成。所述小管(孔)通過專用電磁閥24附連至小存儲環(huán)26，所述大管(孔)通過專用電磁閥24附連至大存儲環(huán)25。不同大小的目的是為了便于精確計量由試劑分配系統(tǒng)13遞送的試劑。所述針管的孔口越小，計量小劑量試劑就越容易。作為示例，一個試劑分配針頭具有內(nèi)徑匕，其中O. 003 ^ b! ^ O. 018英寸，另一個試劑分配針頭具有內(nèi)徑b2，其中0.015 ^ b2 ^ O. 030英寸。用于獨立式生物分析系統(tǒng)10的照相機27可具有多種功能。一個功能可為校正分配系統(tǒng)13的分配針頭23對于試劑供給部件14和附連至流體傳輸層16的槽層17的位置，從而試劑供給部件14中的試劑能分配至槽層17中恰當?shù)牟劾?。另一個功能是向控制系統(tǒng)19提供樣品和/或分析信息。當操作員向特定檢測單元的槽層17的樣品輸入端口 33提供樣品時，照相機27從光源如條形碼或本領(lǐng)域其他可分辨的光學標記系統(tǒng)記錄樣品信息。來自樣品的信息會通知控制系統(tǒng)19正確上樣，然后其將與分析結(jié)果合并在一起。接著，經(jīng)確認和正確上樣的樣品由獨立式生物檢測裝置10處理，最終結(jié)果也由同樣的照相機27記錄。最后通過控制系統(tǒng)的操作員界面可將該信息傳遞給操作員。大和小控制環(huán)25、26是管的線圈，其通過電磁閥24附連至其特定的雙管分配針頭23。當一項檢測需要特定試劑時，X-Y-Z移動控制系統(tǒng)就將分配針頭23移動至試劑供給部件14中的特定試劑。針頭插入至試劑的容器，通過小或大存儲環(huán)25、26和打開的電磁閥24提供負壓。所需量的特定試劑就從試劑容器中抽出。然后，χ-γ-ζ移動控制系統(tǒng)就將分配系統(tǒng)13傳送至需要試劑的槽的位置。然后，將正壓提供給大或小存儲環(huán)并打開恰當?shù)碾姶砰y以將計量好用量的試劑分配至槽中。然后，分配系統(tǒng)13可重新定位至需要同樣試劑的另一個槽，重復該分配過程直到為所有需要特定試劑的槽供給完畢。然后，通過用合適的沖洗液不斷沖洗分配針頭23和存儲環(huán)25或26的管來清潔分配針頭23和存儲環(huán)25或26。再準備將分配系統(tǒng)13用于輸送和提供檢測需要的另一種試劑。 通過控制系統(tǒng)19主動控制提供給存儲環(huán)25、26的正壓或負壓，并在排出或分配試劑時對分配系統(tǒng)13的電磁閥24的打開和關(guān)閉時間計時，完成對試劑的恰當計量。設(shè)置自動清潔的單個分配針頭23具有優(yōu)勢，因為試劑分配的可選擇方法通常需要使用吸量管和大量一次性吸管針頭。所述獨立式生物檢測裝置10使用從槽層17的試劑輸入槽中分離樣品的流體傳輸層16，從而避免在可選擇系統(tǒng)中發(fā)生的交叉污染的可能。因此，使用單個分配針頭系統(tǒng)23，就無需吸量管系統(tǒng)?；蛘?，可將所述分配系統(tǒng)可構(gòu)建為吸量管系統(tǒng)并以類似方式操作，盡管是結(jié)合一次性吸管針頭而不是在試劑應(yīng)用之間對分配針頭進行清潔。當使用吸管系統(tǒng)時，也可通過設(shè)置的吸管和吸管針頭自動將樣品分配至樣品輸入端口 33以避免交叉污染。如圖5-14的不同圖示，由兩個子單元15a和15b構(gòu)成所述氣分平臺15，其中子單元15a接受由氣動供給系統(tǒng)18提供的氣動供給，并通過其集成的氣動通道32分開這些信號以將這些氣動信號遞送至流體傳輸層下側(cè)薄膜的子單元15b的氣動通道，所述氣分平臺15連接至多個微流體系統(tǒng)(組合的16、16a和17，本文稱為檢測單元或商業(yè)上稱為CARD、 (化學和試劑器件))，各CARD具有單個或多個檢測能力。各CARD還包括多層式、一體化、聚合材料的、非彈性微流體芯片(微流體傳輸層)16，其具有包括多個氣動信號-致動的薄膜閥的給定配置微特征。所述系統(tǒng)還包括單獨的可替換氣分平臺，其包括流經(jīng)的多個氣動端口和設(shè)置于其中的流體連接至多個薄膜閥和多個氣動端口的多個氣動通道。所述多個氣動端口和氣動通道具有給定配置，其特異性對應(yīng)于流體傳輸層16上多個薄膜閥的給定配置。所述流體傳輸層16可拆卸地連接至所述氣分平臺15。所述氣動供給系統(tǒng)18還包括多個氣動連接器，其將氣動信號提供給流體連接至多個氣動端口的所述氣分平臺15。所述多個氣動連接器的配置對應(yīng)于所述氣分平臺15的多個氣動端口的配置。所述氣分平臺15可拆卸地連接至氣動供給系統(tǒng)18。各多層式、一體化的流體傳輸層16還包括其中設(shè)置有多個流體通道39的聚合材料的、非彈性基板16a，各流體通道39具有入口端和出口端以及至少一個雙向薄膜泵，所述薄膜泵包括至少3個基于非彈性膜的閥結(jié)構(gòu)，其由單獨的非彈性聚合薄膜層30構(gòu)成。在各種方面，各流體傳輸層16可包括整體的或組件的槽層17，其包括至少一個可容納樣品的樣品輸入槽33和至少可容納試劑材料的試劑槽(34)。槽層17及其附連的流體傳輸層16 (包括傳輸層基板16a)可拆卸地設(shè)置于所述氣分平臺15上，從而在分析完成后所述組合槽層17和流體傳輸層16可被移開并重新放置一個未使用的或清潔后待用的、不同的組合槽層17和流體傳輸層16。所述氣分平臺15也可拆卸地設(shè)置于機殼內(nèi)的氣動供給系統(tǒng)18上。所述氣分平臺15也可替換為另一個氣分平臺15，其對應(yīng)于設(shè)計用于可選擇的檢測或任何特定檢測的更多或更少數(shù)目檢測單元的組合槽層17和流體傳輸層16布置。如圖7、14(、15么、158、18和19所描述，所述氣分平臺15可包括多功能和/或特定功能的加熱器(29、48和48a)，其用于加熱擴增/反應(yīng)反應(yīng)器31和/或其他槽或通道。在如圖23的分解圖所描述的非限制性方面，所述多功能加熱器2301可為層壓形式的銅/鋁結(jié)構(gòu)2303，所述銅/鋁結(jié)構(gòu)2303安裝在彈簧支承的電觸頭2305上，電觸頭2305為電阻器2307提供電接觸，電阻器2307產(chǎn)生熱且將其傳送給層壓加熱體。所述觸頭還提供與溫度傳·感器件2309的連接以用于調(diào)控所述加熱器。所述彈簧支承的電觸頭還提供加熱器表面和待加熱物體之間的均勻接觸。所述層壓加熱器裝置可為市購的金屬核心(層壓的銅/鋁；例如，熱導的PCB基板,萊爾德科技(Laird Technologies),切斯特菲爾德(Chesterfield),MO)板。所述金屬核心板提供優(yōu)異的熱導性，并進一步為設(shè)置于所述電路布局中的溫度傳感器部件提供良好的溫度均勻性。微流體系統(tǒng)的一個挑戰(zhàn)是能夠精確測量加熱區(qū)域的溫度。所述彈簧單高踐觸頭(例如，彈簧探針(Spring Contact Probes),互聯(lián)器件公司(Interconnect Devices Incorporated),堪薩斯城，KS)提供電的或機械的接觸面。流體傳輸層16與所述氣動端口和加熱器29、48和48a互相連接。當設(shè)置于流體層16上的薄膜泵由氣動供給系統(tǒng)18提供給所述氣分平臺15的正和負的氣動壓操作時，所述樣品和/或試劑被抽吸至流體傳輸層16中并傳輸至所進行的各種處理步驟和分析步驟，包括設(shè)置于所述氣分平臺15上的槽層17、擴增反應(yīng)器31和其他部件，如加熱器29、48和48a以及磁鐵49。通過該過程所述樣品和在流體傳輸層16、槽層17或擴增反應(yīng)器31中進行的任何中間反應(yīng)都在其特定檢測單元中與其他檢測單元分隔開。這種分隔防止樣品與或來自任何其他檢測單元、試劑分配系統(tǒng)13、所述氣分平臺15或氣動供給系統(tǒng)18的交叉污染，從而提供更大的分析可靠性并減少操作成本，因為該系統(tǒng)的清潔需求大大減少了。氣動供給系統(tǒng)18的作用是提供經(jīng)過所述氣分平臺15的氣動信號(正壓和負壓)，從而在流體傳輸層16內(nèi)實現(xiàn)所述測試樣品和試劑的傳輸。其與液分平臺12協(xié)同操作，從而當通過分配系統(tǒng)13從試劑供給部件14向在槽層17上的特定或普通槽遞送試劑時，能夠正確實施所述處理過程。所述氣分平臺15還可整合一些區(qū)域，其中可提供加熱、冷卻(通過從加熱器處的氣動供給系統(tǒng)18引導一股被或未被主動冷卻的壓縮空氣或從風扇處供給氣流來實施)或磁力以有助于反應(yīng)進行。氣動供給系統(tǒng)18設(shè)置為在機殼11中與液分平臺12分開的空間內(nèi)可操作地連接至氣分平臺15，以及用于控制液分平臺12的控制系統(tǒng)19，氣動供給系統(tǒng)18和所述氣分平臺15實施的在流體傳輸層16、槽層17或擴增反應(yīng)器31中發(fā)生的任何加熱、冷卻(通過從加熱器處的氣動供給系統(tǒng)18引導一股被或未被主動冷卻的壓縮空氣或從風扇處供給氣流來實施)或磁力。
圖4為獨立式生物檢測裝置10的透視圖，其清晰顯示了位于所述氣分平臺15下面的氣動供給系統(tǒng)18的位置。氣動供給系統(tǒng)18位于機殼11的下部內(nèi)。氣分平臺15可拆卸地附連至氣動供給系統(tǒng)18，從而用于需要不同的流體傳輸層16設(shè)計的分析，有助于容易地重新配置獨立式生物檢測單元10。氣動供給系統(tǒng)18由許多子部件構(gòu)成，其設(shè)計用于通過所述氣分平臺15在控制系統(tǒng)19的指令下存儲、計量和按路線輸送氣動壓力，以操作位于檢測單元的流體傳輸層16上的薄膜。通過正壓和負壓調(diào)節(jié)器20將正壓和負壓提供給正壓和負壓存儲槽21。從正壓和負壓存儲槽21對正壓和負壓依次計量并經(jīng)由氣動供給電磁閥22 (由氣動供給電磁閥22至所述氣分平臺15下底面的管未清晰顯示(通過氣動供給系統(tǒng)18和所述氣分平臺15之間為無管的固態(tài)界面，所述配置也可構(gòu)建為無管件式))供給至所述氣分平臺15的通道。壓力計量以及電磁閥的打開和關(guān)閉由控制系統(tǒng)19控制，并將計量的氣動力供給至所述氣分平臺15，從而操作位于流體傳輸層16的薄膜泵。圖5描述了一個陣列的6個CARD，描繪了 “6乘4”布置的槽，各4檢測單元CARD可拆卸地設(shè)置于所述氣分平臺15。在操作中，槽層17由薄膜覆蓋(未示出)以保護其內(nèi)容物免受臨近檢測單元中處理的樣品交叉污染的可能，并防止槽17的內(nèi)容物污染液分平臺12、所述氣分平臺15、氣動供給系統(tǒng)18、控制系統(tǒng)19或機殼11。 圖6進一步描述了可拆卸地附連至所述氣分平臺15上的流體傳輸層16的一個“6乘4” CARD布置。圖7為流體傳輸層16和氣分平臺15之間的界面的頂視圖。墊圈28附連至所述氣分平臺15的頂部，并設(shè)計用于隔離施加給流體傳輸層16的薄膜層30 (圖15B)的氣動力。各墊圈空間內(nèi)的末端為從氣動供給系統(tǒng)18經(jīng)由所述氣分平臺15的通道。當流體傳輸層16被置于墊圈28頂部時，通過從氣動供給系統(tǒng)18經(jīng)由所述氣分平臺15施加正壓和/或負壓并由控制系統(tǒng)19控制，流體傳輸層16的薄膜層30的未粘合部分能夠彎曲進入墊圈空間或從墊圈空間出來?？刂葡到y(tǒng)19能夠連續(xù)施加正壓或負壓至選定位置，所述位置設(shè)立有如共同任用(commonly assigned)的專利US 7，832，429所描述的薄膜泵送系統(tǒng)。通過使用這樣的驅(qū)動泵送，氣分平臺供給系統(tǒng)18和氣分平臺15保持與通過流體傳輸層16輸送的流體分開，其可消除檢測單元之間的交叉污染，以及氣動供給系統(tǒng)18和氣分平臺15的污染。如上所述，當CARD被放置在所述氣分平臺15上時，加熱器29可位于擴增反應(yīng)器31安裝于其中的所述氣分平臺15內(nèi)。在處理樣品期間的合適時間，向擴增反應(yīng)器31注入合適的試劑和從槽層17的不同槽經(jīng)流體傳輸層16輸送的處理樣品。然后，通過來自控制系統(tǒng)19的指令以可控的方式將擴增反應(yīng)器的內(nèi)容物加熱和冷卻(通過從加熱器處的氣動供給系統(tǒng)18引導一股被或未被主動冷卻的壓縮空氣或從風扇處供給氣流來實施)。圖8A描述了獨立式生物檢測裝置10氣分平臺15的“6乘4”布置15a層的透視圖。氣動信號經(jīng)由其輸送至所述氣分平臺15的較高層15b的孔口，以及加熱器安放的凹口。圖SB描述了獨立式生物檢測裝置10氣分平臺15a的“6乘4”布置的頂視分層圖。氣動信號從氣動供給系統(tǒng)18經(jīng)由所述氣分平臺15底部的孔口而流經(jīng)其輸送的通道32，以及圖8A描述的層上的孔口。圖SC描述了獨立式生物檢測裝置10氣分平臺15的“6乘4”布置的仰視透視圖。圖4描述的氣動電磁閥22和存儲槽21供給氣動壓或真空至位于所述氣分平臺15底部的孔口。存儲槽21供給計量的正壓和負壓至圖SB所示的氣動通道32，其構(gòu)建于所述氣分平臺15內(nèi)。當控制系統(tǒng)19打開氣動供給電磁閥22，氣動通道32被供給計量的負壓或正壓，基于該壓力存儲槽21通過控制系統(tǒng)19以打開或關(guān)閉狀態(tài)附連至特定氣動供給電磁閥22。通過控制系統(tǒng)19的調(diào)控下調(diào)整存儲槽21壓力，調(diào)控氣動供給電磁閥22的打開，或二者的結(jié)合來實施壓力計量。將壓力供給至通道，然后，通過所述氣分平臺15的墊圈界面28操縱流體傳輸層16。圖9描述了 “4檢測單元” CARD的分層頂視圖，其具有流體傳輸層16的流體通道39和擴增反應(yīng)器31。該圖顯示了在CARD的單獨檢測部分的制備和純化區(qū)內(nèi)的樣品輸入槽33、普通制備和純化試劑槽34、廢料槽35和二氧化硅過濾槽36，其包括二氧化硅過濾膜保持環(huán)36a，保持環(huán)36a將支承二氧化硅過濾膜36b (未清晰顯示)。還顯示了洗脫槽37 (左和右)、擴增預混合液槽38 (左和右)和擴增反應(yīng)器31 (左和右)，其附連于流體傳輸層16底部并通過細流管44連接。還顯示了普通試劑輸入槽40、分析槽41和廢料槽42以及穿孔環(huán)系統(tǒng)43，其用于支撐4檢測單元CARD單個檢測單元的分析部分的分析膜43 (未清晰顯示)O圖IOA至IOK概述了一種用所述器件處理和分析樣品的非限制性示例方法。此處 提供了單個檢測單元的描述，對于可并行或連續(xù)處理提供給獨立式生物檢測裝置10樣品的檢測單元數(shù)目沒有特定的上限。個體樣品處理對順序是基于控制系統(tǒng)19對于氣動供給系統(tǒng)18和所述氣分平臺15的特定布置，以及試劑供給部件14供給的和分配系統(tǒng)13遞送的特定試劑的控制能力。具體地，一個特定檢測可能需要設(shè)計槽層17及其匹配的與氣分平臺15連接的流體傳輸層16。當所有的匹配部件被組合到一起后，該方法通?？砂慈缦逻M行。在圖IOA中，樣品被注入至樣品輸入槽33，分配系統(tǒng)13提供細胞裂解試劑至普通槽34。然后，按照檢測的要求，所述細胞裂解試劑被泵送至樣品輸入槽33，并如同時待審申請S/N 12/249，872所述的在進行或不進行輕度振蕩下孵化而“抖動(fluffing) ”(即，反復驅(qū)動靠近槽的薄膜以交替抽吸，然后向槽內(nèi)注入流體以產(chǎn)生湍流和混合)。當樣品在樣品輸入槽33中孵化時，由分配系統(tǒng)13將有機醇(例如乙醇)分配至普通槽34并將其泵送至樣品輸入槽33，進一步增加樣品輸入槽33中的容積；繼續(xù)孵化該增大的混合物。完成所述孵化階段后，將樣品輸入槽33的內(nèi)容物泵送至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上并流過二氧化硅過濾膜36b，內(nèi)容物被泵送至廢料槽35。按照圖10B，有機醇(例如乙醇)被分配至普通槽34，將其泵送至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上，流過所述二氧化硅過濾膜，再被泵送至廢料槽35。沖洗緩沖液被分配至普通槽34，將其泵送至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上，流過二氧化硅過濾膜36b，再被泵送至廢料槽35。同樣或另一種沖洗緩沖液被分配至普通槽34，將其泵送至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上，流過二氧化硅過濾膜36b，再被泵送至廢料槽35。在圖IOC中，洗脫緩沖液被分配至普通槽34并直接泵送至廢料槽35以清除裂解產(chǎn)物殘留物的通道、有機醇和洗滌緩沖液。新鮮的洗脫緩沖液被分配至普通槽34，將其泵送至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上以清潔所述槽，然后其從二氧化硅過濾膜36b的頂部被泵送至廢料槽35。在圖IOD中，洗脫緩沖液被分配至洗脫槽37(右)并向上泵送流過槽36中二氧化硅過濾膜36b的底部。在圖IOE中，擴增預混合液(master mix)被分配至擴增預混合液槽38 (左和右)。二氧化硅過濾槽36中的起始容積被泵送至洗脫槽37 (右)，然后，單獨泵的材料從二氧化硅過濾槽36被泵送至擴增預混合液槽38 (右)。擴增預混合液槽38 (右)的內(nèi)容物被空出到擴增反應(yīng)器31(右)中。在左邊重復同樣的步驟。然后，按照該方法的特定檢測方案，在控制系統(tǒng)19的控制下使擴增反應(yīng)器31 (左和右)的內(nèi)容物熱循環(huán)。接著，熱循環(huán)后，按照圖10F，預雜交緩沖液被分配至通用試劑槽40，將其泵送至擴增反應(yīng)器31 (右)，然后重復提供預雜交緩沖液給擴增反應(yīng)器31 (左)。然后，升高擴增反應(yīng)器中的溫度以對早期熱循環(huán)產(chǎn)生的擴增物進行變性。在圖IOG中，在擴增物變性時，為了在分析膜47上制備微陣列以正確地與早期熱循環(huán)產(chǎn)生的擴增物雜交，將同樣的或另一種預雜交緩沖液分配至通用試劑槽40并將其泵送至懸浮于分析槽41中的分析膜47頂部(未清晰顯示)，再將其泵送至廢料槽42 ;將洗滌緩沖液分配至通用試劑槽40，將其泵送至分析槽41中的分析膜47上，再將其泵送至廢料槽·42(重復多次)。在圖IOH中，將同樣的或另一種預雜交緩沖液分配至通用試劑槽40并繼續(xù)進入到擴增反應(yīng)器31 (左和右)中和分析槽41的分析膜47的頂部上。在圖101中，擴增反應(yīng)器31 (左和右)的內(nèi)容物被泵送至分析槽41的分析膜47的頂部上并循環(huán)多次，其在擴增物和附連至分析膜47的目標物之間提供了足夠的接觸。當進行了滿意的雜交后，所述內(nèi)容物被泵送至廢料槽42。洗滌緩沖液被分配至通用試劑槽40，將其泵送至懸浮于分析槽41中的分析膜47頂部上，再泵送至廢料槽42 (重復多次)。接著，按照圖10J，將合適的擴增物可視化試劑(如，辣根過氧化物酶("HRP"))分配至通用試劑槽40并將其泵送至懸浮于分析槽41中的分析膜47頂部上，循環(huán)至反應(yīng)滿意地完成；然后將內(nèi)容物泵送至廢料槽42。將洗滌緩沖液分配至通用試劑槽40并將其泵送至懸浮于分析槽41中的分析膜47頂部上，再泵送至廢料槽42 (重復多次)。按照圖10K，將顯色劑反應(yīng)物(如，四甲基聯(lián)苯胺〃TMB")分配至通用試劑槽40并將其泵送至懸浮于分析槽41中的分析膜47頂部上；如上所述循環(huán)至試劑(如，TMB和HRP)完全反應(yīng)，再將內(nèi)容物泵送至廢料槽42。將洗滌緩沖液分配至通用試劑槽40并將其泵送至懸浮于分析槽41中的分析膜47頂部上，再泵送至廢料槽42 (重復多次)。最后，將照相機27定位于分配系統(tǒng)13，在懸浮于分析槽41中的分析膜47上方，記錄該圖像。然后，通過控制系統(tǒng)19處理所述圖像資料并將結(jié)果傳遞給操作員。圖11描述了 CARD的“4檢測單元”布置的透視圖，其包括槽層17、包括薄膜(非彈性體膜或薄膜)層30的流體傳輸層16和一個擴增反應(yīng)器31及其附屬系統(tǒng)45、46，以及用于支承分析槽41中分析膜47的穿孔的緊固環(huán)43 —部分。更具體地，各示例性“四方形”CARD具有4個微陣列分析槽41 (圖9、11)，其包括可拆卸地設(shè)置于其中的微陣列分析膜47。一種示例性分析膜47由尼龍、硝化纖維、PVDF或任何本領(lǐng)域已知的其他合適材料制成。分析槽41具有在所述槽底部的支持平臺或沿其底部內(nèi)周延伸的框架或肩狀結(jié)構(gòu)。穿孔的、分段的或有凹口的緊固環(huán)可用于固定分析室中的膜。圖13B所示為一個示例性的具有通道1708的穿孔緊固環(huán)43，通道1708用于從分析槽內(nèi)輸送流體經(jīng)膜周邊至槽的底部，再到槽的機部。在一個方面，兩個緊固環(huán)43可用于將膜夾持于其間，或如圖所示一個略小于所述膜但不小于所述穿孔環(huán)43內(nèi)徑尺寸的支撐平臺可用于支持所述膜。圖12描述了“檢測單元”的側(cè)視圖，其包括槽層17、包括限制通道39的薄膜層30的流體傳輸層16和擴增反應(yīng)器31，其包括用于加注和空出擴增反應(yīng)器的細流管44。在PCR反應(yīng)期間，例如，水溶液可從約30° C低溫循環(huán)至約95° C高溫重復循環(huán)(20-50次)。為防止所述水溶液因蒸發(fā)或濃縮而減小容積，例如，在整個溶液上方的管側(cè)邊，最好密封該溶液的暴露的表面，從而該反應(yīng)不會因為缺少足夠的溶液量或未密封環(huán)境下濃度發(fā)生改變而失敗。為防止蒸發(fā)或不受控制的濃縮，通常可將蠟、硅油、礦物油或其他物質(zhì)引入至溶液頂面以防止蒸發(fā)；然而，使用這些材料有一些缺點。例如，礦物油在室溫下為液態(tài)，因此，它給某些自動化系統(tǒng)帶來操作問題。蠟在室溫下為固態(tài)，對自動化系統(tǒng)來說其融化溫度非?？煽?，但是蠟通常妨礙更需要的復雜PCR反應(yīng)。硅酮與礦物油類似，在室溫為液態(tài)，因此也有類似的操作問題，但其不妨礙PCR反應(yīng)。
對于自動PCR系統(tǒng)，當PCR反應(yīng)管(例如，31，圖11、12)被加注后，具有能夠自動覆蓋溶液的物質(zhì)則尤其有益。例如，可使用高純度硅油和少量(很少％)蠟的受控混合物作為添加劑。在一個示例性方面，該混合物的組成為蠟=1%至20%，硅油=99%至80%。根據(jù)一個方面，該混合物的組成為約5%蠟和95%硅油。所述蠟可為標準PCR蠟(例如，西格瑪奧德里奇(Sigma Aldrich)石蠟，熔點為58-62° C)。該混合物在室溫和期望的儲藏溫度為固態(tài)。該混合物可鋪成一層物質(zhì)，位于該管的開口下方和流管44底部開口上方的PCR管
(31)的上部內(nèi)表面。分析物被引入至所述管中后，當?shù)谝惠啛嵫h(huán)實施期間溫度升高時，所述混合物融化并覆蓋溶液的表面以防止蒸發(fā)，同時其對所述反應(yīng)沒有妨礙作用。反應(yīng)完成后，在將擴增反應(yīng)器中溫度降至該混合物熔點以下時，可在混合物再固化之前或之后，將反應(yīng)物從密封物以下經(jīng)流管(44，圖12)移除。在一個方面，該混合物可冷卻而形成位于溶液上的一層固體蓋帽，細流管44將溶液從該固化層以下抽吸出去。圖13A描述了“4檢測單元”CARD的分解圖，其包括槽層17、包括其薄膜層30的流體傳輸層16和擴增反應(yīng)器31，其包括用于加注和空出擴增反應(yīng)器的細流管44。該圖還顯示了二氧化硅過濾膜保持環(huán)36a、用于二氧化硅過濾槽36的二氧化硅過濾膜36b和用于支承分析室中分析膜47的穿孔緊固環(huán)43。圖14A-D描述了槽層17分析區(qū)一部分的一個替代性布置及其所附連的流體傳輸層16。該替代性布置用于覆蓋分析膜47以改善循環(huán)的擴增物和分析槽41中分析膜47上的靶分子之間的接觸。該覆蓋可有開口以使得氣泡可從分析槽41中排出。通過取消前述穿孔環(huán)布置43中所用的步驟或平臺，該布置還可使得能夠有效加熱分析槽41。在該替代性布置中，所述分析膜直接位于薄膜層30上，薄膜層30依次直接設(shè)置于加熱元件48a上。在一個檢測中，分析反應(yīng)期間熱量供給通常是個重要步驟。該覆蓋系統(tǒng)還允許有供給和排空分析槽的通道的不同布置。在該替代性布置中，由于所述膜位于槽的最底部，可以交替的方式在膜47的頂面沖洗所述流體。為了使所述膜保持在構(gòu)成槽底部的薄膜層上，在分析槽41的基板層16a上形成一個突出部分，并如圖14B所示在分析槽41的各端部的該突出部分下形成的通道口。分析槽41構(gòu)造為長大于寬，其在各端口與通道口結(jié)合而允許有在分析膜長度上的有效流動，并進一步與所述覆蓋結(jié)合而允許有改善的所述流體與分析膜表面的接觸，使得流體中的擴增物更有效地與其附連至分析膜的靶標雜交。使用流體傳輸層16的泵和通道，使所述流體順時針和反時針地交替循環(huán)以交替方向流經(jīng)所述膜，可進一步改善所述布置。圖14C描述了 4檢測單元的替代性氣分平臺15和墊圈層28的一個示例，其對應(yīng)于圖14A和14B描述的分析區(qū)的替代性布置。注意位于分析槽41下方所述氣分平臺15上的第二加熱器48a。圖14D描述了氣分平臺層15b的內(nèi)部氣動通道32，其顯示了從氣動供給系統(tǒng)18引入至15a底層的氣動信號是如何進一步被分離并傳送至15b表面上的特定墊圈層28空間。圖15A描述了氣分平臺15的一個示例性單個檢測單元的分解透視圖，其整合了氣動磁性組件51和與其連接的多功能加熱器48，用于制備、擴增和分析反應(yīng)的需要。該圖還包括可選的薄膜層53，其為流體傳輸層16和所述氣分平臺15之間的界面。所述系統(tǒng)可數(shù)個(例如，"Quad C ARD"'”j并連接至氣動供給系統(tǒng)18以通過控制系統(tǒng)19并行地或以隨機
順序來操作多個檢測單元。所述系統(tǒng)提供了在檢測期間所需的磁力使用，用于任何特定檢測所需的操縱鐵的、磁的或順磁的顆粒。實踐中所需的顆粒可通過分配系統(tǒng)13引入至槽層17的特定槽，并在所述檢測的一些步驟期間與樣品結(jié)合?；蛘撸@些顆?？稍诒谎b入樣品輸入槽33之前與樣品結(jié)合，再或者，所述顆?？稍谥圃炝黧w傳輸層16或槽層17的過程中預 先裝入至槽或通道中。樣品和所述顆粒的混合物可預先裝入至位于氣動活塞組件(可選擇地，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)51上的槽或通道中，或者，所述樣品/顆?；旌衔锟杀槐盟椭廖挥跉鈩踊钊M件(可選擇地，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)51上的槽或通道中。在其中的一種情形下，所述位于氣動活塞組件(可選擇地，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)51上的槽或通道可從屬于磁鐵49，其位于固定在氣動活塞組件(可選擇地，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)51的活塞桿52末端的磁鐵支架50上,通過給氣動活塞組件(可選擇地，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)51的汽缸提供正壓，其引導磁鐵進入含有樣品/顆?；旌衔锏募訜岬牟?5，非加熱的槽56或通道正下方的位置。當磁力傳送至具有樣品/顆粒混合物的位點，所述檢測則利用所述顆粒的磁性實現(xiàn)特定的檢測要求；例如，將所述顆粒用于特定生物材料的濃縮步驟，所述生物材料被本領(lǐng)域已知的檢測步驟，即基于磁性顆?；蚱渌胀w粒吸附。可選擇地或組合地，所述氣動磁鐵系統(tǒng)51可被并入所述氣分平臺15的區(qū)域，從而進行中的所述顆粒和樣品可同時進行加熱和磁力作用。這種情形的一個實施例是用所述顆粒從較大的樣品容積中濃縮出生物體。在這種情況下，當所述生物體被捕獲時是活的，然后可對其進行熱激以使得所述生物體表達其死亡后無法正常表達或不表達的RNA。在熱激后，通過施加負壓至氣動活塞組件(可選擇地，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)51的汽缸而移除所述磁力，從而從加熱的磁性槽55下方的位置撤走磁鐵49，并將所述顆粒和帶有生物體的濃縮樣品的溶液泵送至另一個位置，以進行從所述生物體中提取RNA，進一步以與上述方法一致的方式擴增所述提取的RNA和分析所得的擴增物。圖15A還描述了可在與擴增反應(yīng)器31分隔的槽54中供熱，從而在分析擴增物之前變性擴增物，孵化標記反應(yīng)，或改善特定反應(yīng)的過程。其還描述了定位該擴增反應(yīng)器的替代性方式。盡管該圖沒有在先前描述的管和細流管44布置中提供擴增反應(yīng)器，但沒有理由表明這樣的管和細流管44布置與上述氣動汽缸組件51不能一起使用。如圖所示，所述氣分平臺15和流體傳輸層16之間的界面包括可選的薄膜層53，而非上述討論的墊圈層28。所述薄膜層所起的作用同樣是為薄膜層30提供一個分離的空間以使得當由氣動信號驅(qū)動的氣分平臺15將負壓施加到薄膜層30的未粘合區(qū)時其可彎曲至其中，所述氣動信號在控制系統(tǒng)19指令下來自附連至氣動供給系統(tǒng)18的氣分平臺15的氣動通道32。圖15B描述了如圖15A所示的相同原件，但沒有薄膜層。因此，墊圈層28所起的作用如上述圖7所示，且流體傳輸層16直接與所述氣分平臺15界面連接。所述無薄膜層的布置是有利的，因為無薄膜層時在生產(chǎn)和材料上成本更低而該系統(tǒng)的檢測性能并無區(qū)別。圖16描述了單個檢測單元的視圖，其用于改善的快速檢測稀少的目標物、非活體的和活體的水生生物體，并顯示了功能性結(jié)構(gòu)，包括氣動磁鐵51和多個加熱的反應(yīng)位點，以及該系統(tǒng)使用的槽和通道布置。特別地，該系統(tǒng)描述了如何將所述氣分平臺15與流體傳輸層16及其附連的槽層17組合配置，從而將熱量遞送至檢測的不同步驟。在特定的情形，熱量用于一個制備步驟的加熱的磁力分離/濃縮/反應(yīng)槽55中(其中可根據(jù)需要結(jié)合在槽55中加熱選擇性使用磁力)。在可選的加熱之后，樣品經(jīng)流體傳輸層16傳輸用于檢測的進一步的制備步驟。根據(jù)檢測需要提取DNA或RNA后，將提取的DNA或RNA與擴增預混合液混合并經(jīng)流體傳輸層16傳輸至擴增反應(yīng)器31。如圖16中所示，所述反應(yīng)器在流體傳輸 層16的平面上，盡管其也可使用如圖11、12和13所配置的流體傳輸層16平面外的反應(yīng)器。在擴增反應(yīng)器31中產(chǎn)生了擴增物后，將其傳輸至加熱的分析反應(yīng)器54中對其進行加熱變性和/或標記它們，或要求加熱的一系列組合需要。然后，將擴增物傳輸至分析槽41 (其也被構(gòu)建為用于加熱)以完成所述檢測。圖17A-0還描述了如下所述的示例性分析過程如圖17A所描述，將樣品放入槽33/55，將緩沖液和磁珠(beads)分配至槽33/55，通過使用臨近槽33/55的大薄膜抖動而輕度振蕩地孵化。選擇檢測的合適溫度和孵化時間。將磁鐵49提升至槽33/55下的位置，然后將內(nèi)容物泵送至廢料槽35。如圖17B所描述，使磁鐵49下降而從槽33/55下的位置中出來，將洗滌緩沖液分配至普通槽34 (洗滌緩沖液I)，從普通槽34 (洗滌緩沖液I)將洗滌緩沖液泵送至槽33/55以重懸浮磁珠。按上述的抖動溫和地振動，然后將磁鐵49提升至槽33/55下的位置，再將內(nèi)容物泵送至廢料槽35。如圖17C所描述，將多功能加熱器48設(shè)置在合適的孵化溫度(如果特定檢測需要的話)，在進行適當孵化后，使磁鐵49下降而從槽33/55下的位置中出來；將洗滌緩沖液分配至槽37/56并將其泵送至槽33/55以重懸浮磁珠，溫和地振動，將多功能加熱器48設(shè)置在合適的孵化溫度(如果特定檢測需要的話)；將細胞裂解緩沖液分配至通用試劑槽
34(細胞裂解緩沖液)，將細胞裂解緩沖液泵送至槽33/55，按上述的抖動溫和地振動，根據(jù)特定檢測的需要加熱；將有機醇(例如乙醇)分配至通用試劑槽34(乙醇)并將其泵送至槽33/55，按上述的抖動溫和地振動，根據(jù)特定檢測的需要加熱。如圖17D所描述，將槽33/55的內(nèi)容物泵送至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上。如圖17E所描述，抽吸二氧化硅過濾槽36的內(nèi)容物使其穿過二氧化硅過濾槽36中的二氧化硅過濾膜36b，再泵送至廢料槽35，然后(可選地)打開真空端口 59以抽吸空氣穿過所述過濾膜。如圖17F所描述，將有機醇(例如乙醇)分配至通用試劑槽34 (乙醇)并將其泵送至二氧化硅過濾槽36，至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上；然后，重復如在圖17E中所描述的步驟。如圖17G所描述，將相同的或另一種洗滌緩沖液分配至通用試劑槽34(洗滌緩沖液2)并將其泵送至二氧化硅過濾槽36，至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上；然后，重復如圖17E中所描述的步驟。如圖17H所描述，將相同的或另一種洗滌緩沖液分配至通用試劑槽34(洗滌緩沖液3)并將其泵送至二氧化硅過濾槽36，至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上；然后，重復如圖17E中所描述的步驟。重復如圖17H和17E中所描述的步驟；然后，重復如圖17F和17E中所描述的步驟。如圖171所描述，將洗滌緩沖液分配至槽37/56并將其泵送至二氧化硅過濾槽36，·至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上。加以恰當孵化，然后將其泵送回到槽 37/56。如圖17J所描述，將結(jié)合緩沖液分配至槽37(結(jié)合緩沖液)并將其泵送至槽37/56 ;然后將磁珠分配至槽37/56 ;恰當?shù)胤趸蛽u動。將磁鐵49提升至槽37/56下的位置，再將槽37/56的內(nèi)容物泵送至廢料槽35。如圖17K所描述,使磁鐵49下降以從槽37/56下方的位置出來。將相同的或另一種洗滌緩沖液分配至槽37(洗滌緩沖液A)，并將槽37的內(nèi)容物(洗滌緩沖液A)泵送至槽37/56以重懸浮所述磁珠。恰當?shù)販睾驼駝?。將磁鐵49提升至槽37/56下的位置，再將槽37/56的內(nèi)容物泵送至廢料槽35。重復多次。如圖17L所描述，使磁鐵49下降以從槽37/56下方的位置出來。將相同的或另一種洗滌緩沖液分配至槽37(洗滌緩沖液B)，并將槽37的內(nèi)容物(洗滌緩沖液B)泵送至槽37/56以重懸浮所述磁珠。恰當?shù)販睾驼駝印⒋盆F49提升至槽37/56下的位置，再將槽37/56的內(nèi)容物泵送至廢料槽35。使磁鐵49下降以從槽37/56下方的位置出來。將相同的或另一種洗滌緩沖液分配至槽37 (洗滌緩沖液B)，并將槽37的內(nèi)容物(洗滌緩沖液B)泵送至槽37/56以重懸浮所述磁珠。恰當?shù)販睾驼駝?。將磁鐵49提升至槽37/56下的位置，再將槽37/56的內(nèi)容物泵送至槽37 (洗滌緩沖液B)以清潔槽37/56和擴增預混合液槽38之間的通道和薄膜。如圖17M所描述，使磁鐵49下降以從槽37/56下方的位置出來。將擴增預混合液分配至擴增預混合液槽38，并將擴增預混合液槽38的內(nèi)容物泵送至槽37/56以重懸浮所述磁珠。恰當?shù)販睾驼駝印⒉?7/56的內(nèi)容物泵送回擴增預混合液槽38。泵送或抽吸擴增預混合液槽38的內(nèi)容物至擴增反應(yīng)器直至廢棄以完全填滿所述擴增反應(yīng)器。以合適的溫度和次數(shù)進行孵化用于擴增。如圖17N所描述，將雜交緩沖液分配至分析槽41 (雜交緩沖液)并泵送一部分至廢料槽42。將一部分槽41的內(nèi)容物(雜交緩沖液)泵送至槽54(加熱的分析槽)。將擴增反應(yīng)器的部分內(nèi)容物泵送至廢料槽42。將擴增反應(yīng)器的部分內(nèi)容物和槽41的另一部分內(nèi)容物(雜交緩沖液)泵送至槽54 (加熱的分析槽)。如圖170所描述，根據(jù)需要將任何其他所需的試劑分配至槽54(加熱的分析槽)。根據(jù)需要搖動、加熱和孵化槽54(加熱的分析槽)的內(nèi)容物。將槽54(加熱的分析槽)的所有或部分內(nèi)容物泵送至槽41(分析槽)以進行槽54 (加熱的分析槽)內(nèi)容物的分析。將流動的緩沖液分配至槽41 (流動的緩沖液)，當所有早期泵送至槽41 (分析槽)的內(nèi)容物消耗完后，將槽41的內(nèi)容物(流動的緩沖液)泵送至槽41 (分析槽)以完成所述分析。最后，目測分析槽41 (分析槽)中過濾膜上顯示的結(jié)果。圖18描述了氣分平臺15的側(cè)截面視圖，其具有整合的氣動活塞組件51，其中一個組件位于多功能加熱器組件48中，其中一個組件位于所述系統(tǒng)的準備區(qū)。該圖特別顯示了用于所述系統(tǒng)準備區(qū)的氣動活塞組件(可選擇地，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)51的內(nèi)部部件。圖19描述了氣分平臺15的側(cè)截面視圖，其具有整合的氣動活塞組件(可選擇地，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)51，所述氣動活塞組件51位于多功能加熱器組件48中，以及其內(nèi)部部件。圖20所示為雙檢測單元布置的分層頂視圖，其顯示了所述氣分平臺15的示例性可替代功能，整合了針對磁力分離/濃縮通道區(qū)57的氣動磁性組件51而不是如圖17A-0 所述的槽，還包括所述系統(tǒng)使用的槽和通道布置。圖2IA-K進一步描述了如下示例性分析過程如圖21A所描述，將樣品放入樣品輸入槽33，將酶分配至通用試劑槽34并將其泵送至樣品輸入槽33。以輕度振蕩孵化。將細胞裂解緩沖液分配至通用試劑槽34并將其泵送至樣品輸入槽33。以輕度振蕩孵化。將磁珠分配至通用試劑槽34并將其泵送至樣品輸入槽33。以輕度振蕩孵化。將有機醇(例如異丙醇)分配至通用試劑槽34并將其泵送至樣品輸入槽33，以輕度振蕩孵化。如圖21B中所描述，將磁鐵49提升至分離/濃縮通道57下的位置，再將所述內(nèi)容物泵送至廢料槽35。使磁鐵49下降以從分離/濃縮通道57下的位置出來。將洗滌緩沖液分配至通用試劑槽34 (準備)，再將其泵送至分離/濃縮通道57，并順時針和逆時針交替地循環(huán)多次流經(jīng)分離/濃縮通道57以重懸浮和洗滌磁珠。將磁鐵49提升至分離/濃縮通道57下的位置，再將所述內(nèi)容物泵送至廢料槽35。使磁鐵49下降以從分離/濃縮通道57下的位置出來。將相同的或另一種洗滌緩沖液分配至通用試劑槽34 (準備)，再泵送至分離/濃縮通道57，并順時針和逆時針交替地循環(huán)多次流經(jīng)分離/濃縮通道57以重懸浮和洗滌磁珠。將磁鐵49提升至分離/濃縮通道57下的位置，再將所述內(nèi)容物泵送至廢料槽35。根據(jù)檢測的需要繼續(xù)上述洗滌步驟。將洗滌緩沖液分配至通用試劑槽34 (準備)并將其泵送至廢料槽35以清除準備區(qū)的槽、通道和薄膜的任何殘留試劑。如圖21C中所描述，將所述溶液從分離/濃縮通道57泵送至通用試劑槽34 (準備)。將高鹽緩沖液分配至通用試劑槽34 (準備)。將有機醇(例如乙醇)分配至通用試劑槽34(準備)。通用試劑槽34的內(nèi)容物(準備)泵送至至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上，抽吸所述內(nèi)容物使其流經(jīng)二氧化硅過濾槽36的二氧化硅過濾膜36b，再泵送至廢料槽35。如圖21D中所描述，將相同的或另一種洗滌緩沖液分配至通用試劑槽34(洗脫)，泵送至二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的頂部上，抽吸所述內(nèi)容物使其流經(jīng)二氧化硅過濾槽36的二氧化硅過濾膜36b，再泵送至廢料槽35。根據(jù)所述檢測的需要用相同的或替代性的洗滌緩沖液重復操作。
如圖21E中所描述，將洗脫緩沖液分配至槽37(洗脫)，并向上泵送其穿過二氧化硅過濾槽36中二氧化硅過濾膜36b的底部。如圖21F中所描述，抽吸二氧化硅過濾槽36的內(nèi)容物使其流經(jīng)二氧化硅過濾膜，再將其泵送至洗脫槽37 (中心)，然后同樣地泵送至洗脫槽37L和37R ;或繞過洗脫槽37 (中心)直接將等量物質(zhì)泵送至槽37L和37R。如圖21G中所描述，將擴增預混合液分配至槽38L和38R。根據(jù)所述檢測，分配至單獨槽中的預混合液可含有或不含相同的引物。在所述描述中，最初的樣品被分為兩等份。根據(jù)特定檢測和提供的進一步容納分開的樣品的槽、通道和擴增反應(yīng)器布局，所述樣品保持為單份、或分為多于兩個等份。將槽37L和擴增預混合液槽38L中的溶液泵送至擴增反應(yīng)器31L和31R(對于左側(cè)的檢測單元描述了兩個反應(yīng)器，盡管單個擴增反應(yīng)器是必需的，也可能多于兩個)。在右側(cè)的檢測單元中重復操作。以合適的溫度和次數(shù)孵化用于擴增。如圖21H中所描述，將預雜交緩沖液分配至通用試劑槽40 (左和右)，并由此進入擴增反應(yīng)器31 (左和右)，直至到分析槽41 (左和右)中的分析膜47(左和右)頂部上。 如圖211中所描述，將擴增反應(yīng)器31 (左和右)的內(nèi)容物泵送至分析槽41 (左和右)中的分析膜47 (左和右)的頂部上，并循環(huán)操作多次，以在擴增物和附連至分析膜47(左和右)的靶標之間提供足夠的接觸。當實現(xiàn)了滿意的雜交時，將所述內(nèi)容物泵送至廢料槽42。將洗滌緩沖液分配至通用試劑槽40 (左和右)，并泵送至懸浮于分析槽41 (左和右)中的分析膜47 (左和右)的頂部上，再泵送至廢料槽42 (重復多次)。如圖21J中所描述，將合適的擴增物顯色劑(例如，辣根過氧化物酶("HRP"))分配至通用試劑槽40 (左和右)，并泵送至懸浮于分析槽41 (左和右)中的分析膜47 (左和右)的頂部上，循環(huán)操作直至反應(yīng)滿意地完成，然后將內(nèi)容物泵送至廢料槽42。將洗滌緩沖液分配至通用試劑槽40 (左和右)，并泵送至懸浮于分析槽41 (左和右)中的分析膜47 (左和右)的頂部上，然后將內(nèi)容物泵送至廢料槽42。重復多次。如圖21K中所描述，將顯色劑反應(yīng)物(例如，四甲基聯(lián)苯胺〃TMB")分配至通用試劑槽40 (左和右)，并泵送至懸浮于分析槽41 (左和右)中的分析膜47 (左和右)的頂部上，如上所述循環(huán)操作直至試劑完全反應(yīng)(例如，TMB和HRP)，再將內(nèi)容物泵送至廢料槽42。將洗滌緩沖液分配至通用試劑槽40 (左和右)，并泵送至懸浮于分析槽41 (左和右)中的分析膜47 (左和右)的頂部上，再泵送至廢料槽42 (重復多次)。最后，將照相機27定位于分配系統(tǒng)13，在懸浮于分析槽41 (左和右)中的分析膜47(左和右)上方，并記錄該圖像。然后，通過控制系統(tǒng)19處理所述圖像資料并將結(jié)果傳遞給操作員。圖24-25描述了如本文所述的使用CARD裝置自動化分析組織樣本的非限制性示例方法。圖45顯示使用圖20中所示的CARD配置，按照根據(jù)圖21-22中所示的方法，成功地將DNA純化、洗脫和擴增。凝膠上顯示的條帶為擴增的假絲酵母(可導致敗血癥的酵母)25S rRNA。柱頭樣品為_Ctl，其表示標準品陰性對照。+Ctl為標準品陽性對照。S1-S4為4個CARD電泳。S1-S4的白色方框結(jié)果為來自CARD并在純化的第二步之前擴增的樣品等份。在這個實施方案中，先將所述核酸純化，然后洗脫(純化和2種洗脫有兩個階一是從第一階段至第二階段，然后從第二階段洗脫)、擴增、跑凝膠電泳。結(jié)果證明，純化的第二階段提供了顯著改善的目標物擴增。這種情形下，擴增假絲酵母25S rRNA的引物進入到全血樣品中。參照圖24，與通常的混合樣品相反，將所述組織樣品用直徑3mm的刀具切割。將刀具插入至樣品槽，然后開動刀具柱塞，將切割好的樣品轉(zhuǎn)移至分析室。更具體地，參照圖25，按前述裝入樣品；控制器將細胞裂解緩沖液/蛋白酶K分配至試劑槽；所述細胞裂解緩沖液/蛋白酶K被泵送至樣品槽；將混合物循環(huán)；控制器將乙醇分配至試劑槽；將乙醇與反應(yīng)溶液混合；將反應(yīng)溶液泵送至二氧化硅過濾膜頂部的純化器；所述反應(yīng)溶液被泵送經(jīng)由二氧化硅膜穿過二氧化硅過濾膜進入廢料槽。此外，放入樣品之前可將篩子放入所述槽中，從而所述組織經(jīng)過篩子而增加樣本的表面積，使試劑有效地與樣本反應(yīng)。圖22描述了通道式磁力分離/濃縮系統(tǒng)的雙檢測單元布置的，其顯示了槽層17、流體傳輸層16、薄膜層30，而擴增反應(yīng)器31平面外顯示了其組件部件。圖22還包括二氧化娃過濾系統(tǒng)36a和36b。核酸在一些實施方案中，本發(fā)明提供擴增和/或分離目標核酸分子(本文也稱為“目標核酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”)的方法。分離的核酸分子(或“分離的核酸”)是分離自 存在于核酸分子的自然來源的其他核酸分子。優(yōu)選地，“分離的”核酸沒有自然地位于該核酸源自的生物體基因組DNA中的核酸側(cè)面(即，位于核酸5’和3’端的序列)的核酸序列(例如，蛋白質(zhì)編碼序列)。在其他實施方案中，所述分離的核酸沒有內(nèi)含子序列?！澳繕撕怂帷?、“靶核酸”、“靶多核苷酸”是指特定的目標多核苷酸序列分子。可用本發(fā)明方法分析的這類目標核酸包括，但不限于，DNA分子，如基因組DNA分子、cDNA分子及其片段，包括寡核苷酸、表達序列標簽("ESTs")、序列標簽位點("STSs")等?？捎帽景l(fā)明方法分析的這類目標核酸還包括RNA分子，但不限于，如信使RNA (mRNA)分子、核糖體RNA (rRNA)分子、CRNA( S卩，由體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的cDNA分子制備的RNA分子)及其片段。在各種實施方案中，所述分離的核酸分子可含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或O. Ikb的核苷酸序列，其自然地位于該核酸源自的細胞基因組DNA中的核酸分子側(cè)面。另外，分離的核酸分子，如cDNA分子，可基本上沒有其他細胞物質(zhì)，沒有用重組技術(shù)制備時的培養(yǎng)媒介物，或沒有進行化學合成時的化學前體物或其他化學物質(zhì)。所述目標核酸可為DNA或RNA，或其嵌合混合物或衍生物或修飾版本。所述核酸可在基本部分、糖部分或磷酸骨架進行修飾，并可包括其他附加的基團或標簽。例如，在一些實施方案中，所述核酸可包括至少一個修飾的基本部分，其選自下組(包括但不限于)5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β -D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、I-甲基鳥嘌呤、I-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿卩密卩定、2-甲硫基-Ν6-異戍烯基腺嘌呤，尿卩密唳-5-輕乙酸(V)、OSYW(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-巰基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯，尿嘧啶-5-羥乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6- 二氨基嘌呤。在另一個實施方案中，所述核酸可包括至少一個修飾的糖部分，其選自(包括但不限于)樹膠醛糖、2-氟樹膠醛糖、木酮糖和己糖。
在又一個實施方案中，所述核酸可包括至少一個修飾的磷酸骨架，其選自(包括但不限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺酯、磷酰胺酯、磷酰二胺酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和甲縮醛(formacetal)或其類似物。用作引物、探針或模板的核酸可市購或由本領(lǐng)域已知的標準方法獲得，例如，使用自動化DNA合成器(如，購買自BiosearchTechnologies公司，加利福尼亞州諾瓦托；Applied Biosystems公司，加利福尼亞州福斯特市等)和標準的亞磷酰胺化學；或使用非特異性核酸裂解化學物質(zhì)或酶或位點特異性限制內(nèi)切酶裂解大的核酸片段。如果來自一個物種的目標核酸的序列是已知的，而另一個物種的對應(yīng)基因是所需基因，本領(lǐng)域通常是根據(jù)該已知序列設(shè)計探針。所述探針與所需序列來源物種的核酸雜交，例如與來自目標物種基因組或DNA文庫的核酸雜交。在一個實施方案中，核酸分子被用作探針，其在適當?shù)膰栏駰l件下與擴增的、分離的目標核酸互補或可雜交。
在另一個實施方案中，核酸分子被用作探針，其在適當?shù)膰栏駰l件下與擴增的目標核酸雜交且至少95%互補。在另一個實施方案中，核酸分子被用作探針，其至少45%(或55%、65%、75%、85%、95%、98%或99%)與目標核苷酸序列相同或互補。在另一個實施方案中，核酸分子被用作探針，其包括目標核酸的至少25(50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800或4000)個核苷酸的片段或其互補片段。在另一個實施方案中，核酸分子被用作探針，其在適當?shù)膰栏駰l件下與具有目標核苷酸序列的擴增核酸分子雜交或互補。在其他實施方案中，核酸分子被用作探針，其長度可為至少 25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800或4000個核苷酸，且可在適當?shù)膰栏駰l件下與目標擴增核酸分子雜交或為其互補片段?？捎糜跈z測擴增的目標核酸的探針(或模板)的核酸可通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得，例如，通過使用可與目標核苷酸序列的3’和5’端雜交的合成引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，和/或通過使用對所述核苷酸序列有特異性的寡核苷酸探針從cDNA或基因組克隆而從質(zhì)粒獲得?；蚪M克隆可通過在合適的雜交條件下探測基因組DNA文庫而確定，例如，根據(jù)探針與待探測的基因組DNA的相關(guān)性的高度、低度或中度嚴格條件。例如，如果用于目標核苷酸序列的探針和所述基因組DNA來自相同的物種，那么可使用高度嚴格的雜交條件；然而，如果探針和所述基因組DNA來自不同的物種，那么可使用低度嚴格的雜交條件。高度、低度和中度嚴格條件均為本領(lǐng)域熟知的條件?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的標準方法對擴增的目標核酸進行可檢測的標記。所述可檢測的標記可為熒光標記，例如，通過組合核苷酸類似物。適用于本發(fā)明的其他標記，包括但不限于生物素、亞氨基生物素、抗原、輔因子、二硝基酚、硫辛酸、烯族化合物、可檢測的多肽、富電子分子、通過作用于底物而能產(chǎn)生可檢測信號的酶和放射性同位素。優(yōu)選地，放射性同位素包括32P、35S、14C、15N和1251，僅舉上述例子。適用于本發(fā)明的熒光分子，包括但不限于熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、德克薩斯紅、5’-羧基-熒光素('卞祖乃^’^’-二甲氧基-彳’一’-二氯^-羧基-熒光素("JOE")、N，N，N’，N’ -四甲基-6-羧基-羅丹明("TAMRA")、6’ -羧基-X-羅丹明("R0X")、HEX、TET、IRD40和IRD41。適用于本發(fā)明的突光分子還包括菁染料(cyaminedyes),包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5、Cy7 和 FluorX ；B0DIPY 染料，包括但不限于B0DIPY_FL、BODIPY-TR、BODIPY-TMR、B0DIPY-630/650 和 B0DIPY-650/670 ；ALEXA 染料，包括但不限于ALEXA-488、ALEXA-532、ALEXA-546、ALEXA-568 和 ALEXA-594 ;以及其他本領(lǐng)域已知的熒光染料。適用于本發(fā)明的富電子指示劑分子，包括但不限于鐵蛋白、血藍蛋白、膠態(tài)金。可選地，可通過為其特異性配位第一基團而標記擴增的目標核酸(靶多核苷酸)。與第一基團具有親和力、共價連接至指示劑分子的第二基團，可間接用于檢測靶多核苷酸。在這樣一個實施方案中，適用于作為第一基團的化合物，包括但不限于生物素和亞氨基生物素。本發(fā)明方法擴增和分析(例如，檢測)的目標核酸可與一個或多個探針接觸，條件是多核苷酸分子具有與雜交探針互補的序列。如本文所用，“探針”是指特定序列的多核苷酸分子其能夠與具有特定序列(通常為與探針序列互補的序列)的目標核酸分子雜交，從而靶多核苷酸分子和探針的雜交能夠被檢測到。所述探針的多核苷酸序列可為，例如DNA 序列、RNA序列或DNA和RNA聚合物的序列。例如，所述探針的多核苷酸序列可為提取自細胞的基因組DNA、cDNA.mRNA或cRNA序列的全部或部分序列。所述探針的多核苷酸序列也可為合成的序列，例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的寡核苷酸合成技術(shù)。所述探針序列也在體內(nèi)酶法合成，體外酶法合成(例如,通過PCR)或體外非酶法合成。優(yōu)選地，將用于本發(fā)明方法的探針固定在固體載體或表面上，從而未與探針或多個探針雜交或結(jié)合的多核苷酸序列可被沖洗掉并去除，但不會去除與其結(jié)合或雜交的探針或多個探針和任何多核苷酸序列。將探針固定在固體載體或表面上的方法是本領(lǐng)域所熟知的。在一個特定的實施方案中，所述探針可包括一個陣列的不同多核苷酸序列，其結(jié)合至固體(或半固體)的載體或表面上，如玻璃表面或尼龍或硝化纖維薄膜。最優(yōu)選地，所述陣列為可尋址的陣列，其中各不同探針位于所述載體或表面上特定的已知位點，從而根據(jù)其在所述載體或表面上的位點可確認測定出的特定探針。在一個具體的實施方案中，由Zhou等人描述于WO 2009/049268A1 (公開于2009年4月16日)中的方法可用于將核酸探針固定在固體的載體或表面上。盡管本發(fā)明所用的探針可包括任何種類的多核苷酸，在優(yōu)選的實施方案中，所述探針包括寡核苷酸序列(即，長度為約4至約200個堿基的多核苷酸序列，且更優(yōu)選其長度為約15至約150個堿基)。在一個實施方案中，所用的短寡核苷酸序列長度為約4至約40個堿基，且更優(yōu)選其長度為約15至約30個堿基。然而，本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案所用的長寡核苷酸探針的長度為約40至約80個堿基，且尤其優(yōu)選長度為約50至約70個堿基的寡核苷酸序列(例如，長度為約60個堿基的寡核苷酸序列)。CARD 的應(yīng)用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然本文公開的基于CARD的診斷檢測可用于許多不同的應(yīng)用，其中目前應(yīng)用于臺式(bench-top based)的檢測。塑料CARD的設(shè)計使得可將所有需要的微流體網(wǎng)絡(luò)、閥門、泵和槽結(jié)合至簡單、便宜的一次性使用微流體器件上。由于所有檢測功能(即，流動和混合速率、溫度控制，包括熱循環(huán)、駐留時間等)可很容易地通過軟件控制，因此不同技術(shù)水平的人員可以容易地實施復雜的多個PCR檢測。而且，CARD可插入至輕便的電池操作供醫(yī)療點用的(POC，point of care)控制器或具有更高產(chǎn)能的EncompassMDx 工作臺。無論選擇何種形式,都可實現(xiàn)輕松操作。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過對擴增引物的選擇和檢測探針的選擇來調(diào)整所述CARD以用于任何目標核酸序列的檢測。在一個實施方案中，所述CARD可用于進行分子診斷檢測，基于個體基因組背景，其可提供對其潛在疾病狀態(tài)的掌控基礎(chǔ)。在另一個實施方案中，所述CARD可用于進行藥物基因組學敏感性篩選，例如，遺傳的藥物敏感傾向、藥物組合物、目標化學制品或化合物。在另一個實施方案中，所述CARD可用于進行致癌篩選檢測，即篩選與癌癥易患傾向相關(guān)的目標核酸。
·
在另一個實施方案中，所述CARD可用于進行感染性致病劑、病原體或敗血癥的篩選檢測。在另一個實施方案中，所述CARD可用于單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分析,其用于腫瘤學目的，藥物基因組學目的，伴隨診斷(劑量或其他對特定藥物組合物特異性的需求)或檢測可傳染的或不傳染的感染性疾病。在另一個實施方案中，所述CARD可用于工業(yè)或環(huán)境檢測，針對感染人類、動物或植物的目標生物體，或針對加工的食品或非加工的食品中腐敗微生物。在另一個實施方案中，所述CARD可用于工業(yè)上的檢測，用于監(jiān)測娛樂用水(海灘、泳池、公園等的水)，或飲用水、壓艙水或處理后廢水的水處理系統(tǒng)。在另一個實施方案中，所述CARD可用于進行分布于大容量液體中的稀少祀核酸的篩選檢測。在另一個實施方案中，所述CARD可用于進行稀少靶核酸的篩選檢測，其中所述稀少靶核酸區(qū)別于樣品中非靶核酸的高本底。在一些實施方案中，所述CARD可容易地調(diào)整為具有多個擴增反應(yīng)器(例如，31，圖11、12)，其隔離競爭性引物并注入至單個分析槽41，從而多個擴增反應(yīng)器可同時對來自單個樣品的核酸操作。本領(lǐng)域技術(shù)人員可調(diào)整所述CARD以進行任何本領(lǐng)域已知的熱介導的核酸擴增，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄酶(RT-)PCR、CDNA末端快速擴增(RACE)JI^J]循環(huán)擴增、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)、連接酶鏈反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)的擴增(TAA)、冷PCR和非酶法擴增技術(shù)(NEAT)。除了加熱CARD用于核酸擴增，可加熱所述CARD以測定檢測的生物體(例如，該生物體表達的熱激相關(guān)的RNA的存在)的存活力。加熱還可用于在進行分析如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測中調(diào)整雜交的嚴格性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可調(diào)整所述CARD以適應(yīng)任何本領(lǐng)域已知的擴增物的分析或檢測方法，包括但不限于比色法、熒光比色法、化學發(fā)光法、電化學法、電泳法、橫流法、蛋白質(zhì)微陣列法、核酸微陣列法、熒光法或上述各種檢測方法的組合。提供以下實施例用于說明而非限制本發(fā)明。實施例實施例I :華法林敏感性的藥物基因組學檢測該實施例描述了華法林敏感性藥物基因組學檢測的一個特定實施方案，其已經(jīng)被完全自動化地整合到CARD上。進行反向斑點雜交(RDB)以分析所述結(jié)果，盡管如下所述，也可使用引物延伸方法。通過選擇引物和探針，熟練的從業(yè)者可容易地調(diào)整下述方法以用于任何目標物的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測，并可用于其他檢測，例如致癌篩選檢測。通常，在CARD上進行的檢測包括下列步驟I.直接將原始樣本應(yīng)用于CARD上(僅有的操作員步驟)。2.化學細胞裂解。3.通過結(jié)合到CARD中二氧化硅柱上而進行核酸提取和純化。 4.從二氧化硅柱上洗脫純化的核酸。5.將一份純化的核酸與PCR預混合物混合，所述PCR預混合物含有進行PCR擴增所需的所有試劑，包括緩沖液、引物、核苷三磷酸、氯化鎂、Taq DNA聚合酶和尿嘧啶-DNA糖基酶(UNG )，其用于確保不可能發(fā)生擴增物交叉污染。6.將完整的混合物引入至PCR熱循環(huán)槽中，其直接位于嵌入所述進氣總管的電阻加熱器上，然后啟動熱循環(huán)程序。7.完成熱循環(huán)程序后，將擴增物引入至測定模塊進行檢測，例如，通過引物延伸方法(圖26A-B)或反向斑點雜交(RDB)檢測(圖29)。8.對分析膜上的檢測點進行攝影和分析，例如通過引物延伸方法或RDB膜。9.將檢測目標的結(jié)果提供給用戶。在這個實施方案中盡管使用了 PCR擴增，應(yīng)用上述方法可采用任何本領(lǐng)域已知的熱介導的核酸擴增，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄酶(RT-)PCR、CDNA末端快速擴增(RACE)、滾動循環(huán)擴增、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)、連接酶鏈反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)的擴增(TAA)、冷PCR和非酶法擴增技術(shù)(NEAT)。參考圖14A-14L和圖18中槽的變形，使用下列操作和試劑進行藥物基因組學研究，其涉及已知為華法林敏感性指示器的三個單獨的SNP(CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORCI*2)的單核苷酸多態(tài)性(“SNPs”)。探針組使用下列探針組測定CYP2C9*2、CYP2C9*3 和 VK0RC1*2 CYP2C9*2_WT/5AmMC6/TGAGGACCGTGTTCA(SEQ ID NO:113)CYP2C9*2_MUT/5AmMC6/TGAGGACTGTGTTCA(SEQ IDNO:114)CYP2C9*3_WT/5AmMC6/A AGG TCA ATG TAT CTC T(SEQID NO:115)CYP2C9*3_MUT/5AmMC6/AGG TCA AGG TAT CTC(SEQ IDNO:116)VKORCl_WT/5AmMC6/CAT CGA CCC TTG GAC(SEQ ID NO:117)VKORCl_MUT/5AmMC 6/GTC CAA GAG TCG ATG A(SEQ IDNO:118)樣品添加和細胞裂解a.操作員將5μ I血液或懸浮的口腔粘膜拭子樣品加入至樣品輸入槽。b.將30 μ I細胞存儲緩沖液分配至試劑輸入槽，并將其泵送至樣品輸入槽。c.將30 μ I蛋白酶K和細胞裂解緩沖液的混合物分配至試劑輸入槽，并將其泵送至樣品輸入槽，孵化5分鐘。d.將30 μ I乙醇分配至試劑輸入槽，并將其泵送至樣品輸入槽。e.將樣品輸入槽的所有內(nèi)容物泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過過濾膜，并將其泵送至廢料槽。f.將40 μ I乙醇分配至試劑輸入槽，并將其泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過過濾膜，并將其泵送至廢料槽。g.將70 μ I洗滌緩沖液I分配至試劑輸入槽，并將其泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過過濾膜，并將其泵送至廢料槽。h.將70 μ I洗滌緩沖液2分配至試劑輸入槽，并將其泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過過濾膜，并將其泵送至廢料槽。
i.將90 μ I水分配至試劑輸入槽并將其泵送至廢料槽。j.將70 μ I洗脫緩沖液分配至試劑輸入槽，并將其泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后將其泵送至廢料回到其來自的通道。然后抽吸任何殘留流體使其穿過所述過濾膜，并將其泵送至廢料槽。洗脫a.將50 μ I洗脫緩沖液分配至一個洗脫槽，并泵送其一部分至另一個洗脫槽，然后將其剩余部分向上泵送穿過純化槽中過濾膜底部，通過將其交替地注入和空出純化槽至少2次來抖動。PCR 裝載a.將12 μ I PCR預混合液I分配至一個預混合液槽，然后重復操作將12 μ I PCR預混合液2分配至另一個預混合液槽。b.將少量(3次彎曲的薄膜)純化槽的內(nèi)容物泵送至第二洗脫槽，該槽中泵送有洗脫緩沖液。c.泵送單次彎曲的薄膜以驅(qū)動少量物質(zhì)從純化槽至一個擴增槽，然后向該同一擴增槽中加入來自該擴增槽同一側(cè)的預混合液槽中的預混合液。重復操作以加注第二擴增槽。PCRa.于 37。C 10 分鐘b.于 95。C 2 分鐘c.循環(huán) 40xi.于 95。C 30 秒ii.于 45。C 30 秒iii.于 72。C 30 秒iv.于 72。C 3 分鐘反向斑點雜交(RDB)過濾膜滅活處理在PCR熱循環(huán)期間進行RDB過濾膜滅活處理，從而所述兩個步驟與擴增完成相協(xié)調(diào)。a.將80 μ I水泵送至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜，然后各順時針和反時針交替循環(huán)15次后廢棄。
b.將80 μ I的O. IN NaOH泵送至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜，順時針和反時針交替循環(huán)15次，再泵送至廢料槽。c.將80 μ I水泵送至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜，然后各順時針和反時針交替循環(huán)15次后廢棄。重復該兩個步驟多次。預雜交a.將 80 μ I SS 緩沖液(O. 15Μ NaCl+0. OlM磷酸鈉+0. 001MEDTA+0. 1%SDS，最終 pH7. 25-7. 50)分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜，進行循環(huán)；將8(^ I水分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜，然后順時針和反時針交替循環(huán)5次，然后不循環(huán)地孵化10分鐘。擴增物移出在用于預雜交的10分鐘孵化期間，可開始這些步驟?！.在加入SS緩沖液前，將擴增反應(yīng)器的溫度升高至95° C 30秒。b.同時將80μ1 SS緩沖液分配至分析試劑槽，并將其泵送至一個擴增反應(yīng)器中。對另一個擴增反應(yīng)器進行重復操作。各擴增反應(yīng)器孵化3分鐘。c.關(guān)閉擴增加熱器，并冷卻擴增反應(yīng)器以使得所述蠟/硅油固化所述密封層，從而當移除擴增物時所述液相的蠟/硅油不隨擴增物一起被移除。雜交a.進行擴增物移出步驟a_c的同時，排空所述分析槽，將分析槽下的加熱器溫度升高至50° C以加熱所述膜。b.向各擴增反應(yīng)器泵送3次沖程，以將各反應(yīng)器的一些內(nèi)容物泵送至分析膜。c.通過順時針和反時針交替循環(huán)，孵化分析槽的內(nèi)容物15分鐘。最好使用覆蓋的分析槽設(shè)計以改善所述反應(yīng)。然后排空所述內(nèi)容物至廢料槽。d.將80 μ I SS緩沖液泵送至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜，然后各順時針和反時針交替循環(huán)15次，然后泵送至廢料槽。重讀操作2次。e.將分析槽溫度降至低于30° C。f.將80 μ I SS緩沖液泵送至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜，然后循環(huán)一次并孵化5分鐘，每次循環(huán)I分鐘再泵送至廢料槽。結(jié)合a.將80 μ I HRP分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析膜，將其順時針和反時針交替循環(huán)10分鐘，再泵送至廢料槽。b.將80 μ I SS緩沖液泵送至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜，然后順時針和反時針交替各循環(huán)15次，再泵送至廢料槽。重讀操作3次。底物添加a.將80 μ I TMB分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析膜，將其順時針和反時針交替循環(huán)5分鐘，再泵送至廢料槽。b.將80 μ I水分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析膜，將其順時針和反時針交替循環(huán)15次，再泵送至廢料槽。重讀操作2次。圖像分析a.將照相機置于分析膜上方并記錄圖像。
b.將圖像發(fā)送至控制系統(tǒng)進行處理。c.報告結(jié)果。實施例2 :基于CARD的快速和自動化檢測單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的方法引言該實施例描述了 CARD的應(yīng)用，其用于進化分子診斷學領(lǐng)域并體現(xiàn)了低成本分析臨床原始樣品的CARD技術(shù)。一旦原始樣本被引入至CARD后，所有的檢測功能，包括細胞裂解、核酸純化、多重PCR和終點法分析，都會自動化實施。所述CARD被用于藥物基因組學檢測以測定與華法林(warfarin)敏感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。分析了來自20位個體志愿者的原始口腔粘膜拭子樣品，通過在CARD上實施的華法林敏感性檢測確認的SNP圖樣經(jīng)雙向DNA測序證實。然而，通過選擇引 物和探針，熟練從業(yè)者可容易地調(diào)整下述藥物基因組學方法指南以檢測任何目標核酸序列 或SNP。這樣的檢測可用于，例如，篩選病毒性病原體、致癌基因或其他目標基因突變、變異或標記，幾乎可以檢測任何細胞或組織。背景分子診斷學應(yīng)用自1980年代早期興起以來得到很大的發(fā)展，尤其是作為可檢測導致感染性疾病的緩慢生長或苛養(yǎng)細菌的方法。分子診斷學也大大促進了病毒性病原體的檢測，包括病毒載量檢測。由于可獲得更多的人類基因組資料，分子診斷學應(yīng)用在藥物基因組學、伴隨診斷和其他個性化醫(yī)療應(yīng)用中得到進一步的發(fā)展。盡管有其能力和多功能性，然而，需要高度訓練的人員和昂貴設(shè)備限制了將分子診斷學應(yīng)用于專門實驗室或配備適當設(shè)備和人員的中心實驗室。盡管基于橫流層析檢測方式的免疫學檢測(例如，妊娠檢測)，已發(fā)展了許多有效的“快速現(xiàn)場測試”(POC)診斷法，實施更復雜的分子檢測的能力還未完全達到易用且便宜的POC形式。在分子診斷學能夠更廣泛地應(yīng)用于各種POC設(shè)置以前，該檢測需要進行簡化和減少所需的設(shè)備。目前“臺式(bench top)”分子檢測需要高度訓練的人員花費很大的努力從原始臨床樣本開始，制備樣品用于分析。隨后的基因擴增和測定步驟也需要相當?shù)募夹g(shù)和昂貴的設(shè)備。另外，橫向流動POC檢測通常依賴于對測試條上的顏色強度的主觀解釋，如果能夠提供清晰而客觀的數(shù)字化結(jié)果，那么來自更為復雜的分子檢測的結(jié)果就會更有意義。如果這些過程能夠以無縫連接的全自動方式被整合，那么各種不同水平的技術(shù)人員就能夠進行一系列的POC分子檢測，并以經(jīng)濟的檢測方式獲得對結(jié)果的客觀、清晰解釋。分子POC市場面臨的挑戰(zhàn)導致引入了一些“樣品-結(jié)果(sample-to-results) ”平臺，但在將樣品引入系統(tǒng)中進行基因擴增和檢測之前，大多數(shù)還需要對樣品進行分開的“樣品制備”步驟和/或設(shè)備或可觀的樣品“預制備”。為實現(xiàn)真正的“樣品-結(jié)果”簡單化，現(xiàn)已研制出一個平臺，將全部所需的樣品制備、檢測和測定步驟整合至一個能實現(xiàn)全自動分子診斷檢測的單獨、便宜和便攜的塑料器件。該實施例中描述的CARD僅需引入原始樣品，則隨后的步驟可自動化實施。該器件的低成本資產(chǎn)設(shè)備和一次性用品，以及無需“手動”操作，將有助于使分子診斷學用于全面的臨界和快速現(xiàn)場測試成為現(xiàn)實。材料和方法檢測優(yōu)化“臺式”檢測以建立各種可轉(zhuǎn)化至CARD的全自動平臺參數(shù)。使用本領(lǐng)域已知的方法設(shè)計引物和探針分別用于擴增和捕獲。如果任何待分析的生物體難于細胞裂解，其還涉及對標準的化學性細胞裂解和核酸純化方法進行優(yōu)化。所有序列獲自美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI) (www. ncbi. nlm. nih. gov)。使用本領(lǐng)域的標準方法設(shè)計引物和探針，采用CLC Sequence Viewer軟件(www.clcbio.com),美國集成 DNA 技術(shù)公司(Integrated DNA Technologies)的 SciTools, (www.idtdna.com/scitools/)和 NCBI Primer Blast 軟件(www. ncbi. nlm. nih. gov/tools/primer-blast)。所用引物和探針在美國集成DNA技術(shù)公司(衣阿華州科爾維爾)合成。所有微生物和病毒DNA購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC中心，弗吉尼亞州馬納薩斯市)。華法林敏感性檢測去識別的口腔粘膜拭子獲自征得同意的志愿者，將細胞裂解后提取DNA。在CARD上使用引物進行DNA擴增，所述引物設(shè)計用于擴增已知的報告華法林敏感性CYP2C9*2、 CYP2C9*3 和 VK0RC1*2 (27-32)的 3 個單獨 SNP 附近的區(qū)域。所述 CYP2C9*2 和 CYP2C9*3SNPs對應(yīng)于細胞色素P450基因中的突變，VKORCI*2對應(yīng)于維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體子單元I基因中的突變。純化之后，所述DNA分開至兩個不同的PCR反應(yīng)中；一個混合物中含有用于擴增兩個CYP2C9突變附近區(qū)域的引物，另一個混合物含有用于擴增VK0RC1*2突變附近區(qū)域的引物。進行PCR后，將來自兩個反應(yīng)混合物的擴增物混合、變性，并轉(zhuǎn)移至含有共價連接至所述濾膜的探針的小室(chamber)。在緩沖液、含有生物素化dUTP的dNTP、鎂離子和缺乏3’-5’核酸外切酶校正讀碼功能的DNA聚合酶(例如，Vent牌聚合酶，New England Biolabs公司，馬塞諸塞州伊普斯維奇)存在下，將變性的擴增物與捕獲探針退火。對于引物延伸檢測，所述固定的探針，長約20核苷酸，在其3’末端含有信息核苷酸。在這些條件下，所述變性和退火的擴增物鏈作為模板，而固相探針代表待延伸的“引物”。當模板和引物之間存在準確匹配時，就會發(fā)生整合dNTP包括生物素化的dUTP的DNA合成。然而，如果在固定的“引物”的末端堿基和模板之間只要發(fā)生了一個錯配，延長和生物素整合就不會發(fā)生(圖26A-B)。如在CARD上所進行，所述引物延伸檢測的熱循環(huán)步驟在分析槽41中實施(參見圖 14A-C)。一輪延伸以后，與結(jié)合鏈霉親和素的HRP和TMB底物一起孵化后，測定延伸產(chǎn)物。用Image J軟件(rsb. info. nih. gov/i j)對數(shù)字化捕獲的圖像進行分析。測量所述點的平均強度，野生型點的平均值除以突變體探針的平均值。比例大于、等于或小于I分別對應(yīng)于野生型純合子、雜合子或純合子突變體基因型。在康奈爾大學生命科學核心實驗中心(康奈爾大學，紐約州伊薩卡)通過雙向測序確認引物延伸的基因型，其使用了美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)自動化3730DNA分析器，其帶有Big Dye終止劑化合物(Terminator chemistry)(Rosenblum, BB, Lee, LG, Spurgeon, SL等人，用于改善DNA測序方式的新染料標記的終止劑(New dye-labeled terminators for improved DNA sequencing patterns),核酸研究(Nucleic Acid Res.),1997;25:4500-4504;Heiner, CR. , Kunkapiller, KL, Chen, S-M.等人，用BigDye終止劑化合物測序多兆堿基-模板NDA (SequencingMultimegabase-Template DNA withBigDye Terminator Chemistry),基因組石開究(GenomeResearch), 1998 ;8:557-561)和Ampli-Taq-FS DNA聚合酶(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，加利福尼亞州福斯特市)。結(jié)果在CARD上進行的實所述檢測被設(shè)計為通過確認影響華法林代謝的3個已知的單獨SNP而實施基因型分析(華法林敏感性檢測)。該單獨的(VK0RC1*2)和多重的(CYP2C9*2和CYP2C9*3)PCR檢測被設(shè)計用于擴增各SNP附近的區(qū)域，然后將變性的擴增物用于進行各等位基因基因型的引物延伸檢測。為評估在CARD上進行的SNP檢測，分析了來自總共20個志愿者的口腔粘膜拭子。使用(I)在CARD上進行的華法林SNP檢測和(2)雙向DNA測序評估每個樣品。使用引物延伸檢測，華法林敏感性檢測區(qū)分出在3個不同的華法林相關(guān)SNP發(fā)現(xiàn)的各種等位基因。如圖26A-B所示，PCR-擴增的DNA序列變性后能夠用于與固定在濾膜上的特定捕獲探針雜 交。在該檢測中，使用所示擴增物為模板，所示捕獲探針最終作為引物進行延伸。如在材料和方法中所述，將生物素化的dUTP整合至引物延伸序列上使得能夠結(jié)合HRP-鏈霉共軛體(streptavidinylated HRP)并進行顏色檢測。圖27為表明如何從引物延伸過濾膜中識別出基因型的代表性圖像；圖28所示為獲自20個個體的7個不同基因型。3個識別出的SNP每一個中存在的3個可能基因型可用肉眼檢測和/或通過確定每個斑點的信號強度比例而檢測。當在華法林敏感性檢測上評估來自20個志愿者的各口腔粘膜拭子樣品后，最初通過至少2個不同的個體識別出所述基因型。通過上述的材料和方法中的雙向測序和圖像分析確認這些結(jié)果。該實施例中的華法林敏感性檢測表明了 CARD的多能性。除了所做的檢測，僅需一個“手動”(用戶操作)步驟(S卩，起初引入“原”樣品)，隨后所有步驟均為計算機自動化操作。由于其易于實施和解釋結(jié)果，該檢測可用于POC設(shè)置，醫(yī)生希望使用其中的基因組信息以及臨床信息幫助確定正確的起始華法林劑量。因此，通過重復的PT/INR測試最終確定合適的華法林治療劑量，而不必依賴于費時而具有潛在危險性的“試錯法”來確定劑量，醫(yī)生可最初就以基于一些已知華法林劑量算法的更合適華法林劑量開始治療(Daly, AK和King, BP, 口服抗凝血劑的遺傳藥理學(Pharmacogenetics of oralanticoagulants),遺傳藥理學(Pharmacogenetics), 2003; 13:247-252 ；Takahashi, H.和Eschizen, H.，華法林消除的遺傳藥理學及其臨床意義(Pharmacogenetics ofwarfarinelimination and its clinical implications), Clin.Pharmacokinet2001 ；40:587-603 ；Schwarz, UI, Ritchie, MD, Bradford, Y 等人，在最初抗凝作用期間對華法林反應(yīng)的遺傳決定因素(Genetic determinantsof response to warfarin duringinitial anticoagulation) , N. Eng.J.Med2008;358:999-1008 ；0sinbowale, 0. , AlMalki, M. , Schade, A.,等人，控制華法林抗性的算法(An algorithm for managingwarfarinresistance), Clev. Clinic J. of Med. 2009;76:724-730)。在CARD上進行的檢測提供了以完全免于手動的方式，方便、經(jīng)濟地進行復雜分子檢測的方法。而且，進行該檢測所需設(shè)備的低成本和低的一次性費用使該平臺帶來了真正的“樣品-結(jié)果”分子檢測的快速現(xiàn)場測試設(shè)置。實施例3 :基于CARD的自動化人乳頭狀瘤病毒(HPV)檢測
該實施例描述了人乳頭狀瘤病毒(HPV)檢測的一個特定實施方案，其已經(jīng)被完全自動化地整合到CARD上。通過選擇擴增引物和檢測探針，熟練的從業(yè)者可容易地調(diào)整下述方法以用于其他目標核酸序列的檢測。根據(jù)需要將陰道拭子收集后置于可長期室溫保存的合適運輸媒介中。所述運輸媒介可為，例如PBS緩沖液，其中的樣品可立即引入至CARD中進行分析。所述運輸媒介也可為本領(lǐng)域已知可防止DNA降解的任何溶液,從而可將樣品保存?zhèn)溆谩⒁环輼悠窇?yīng)用于CARD并按如下所描述的方法開始進行。無需操作員的任何進一步介入，所有以下步驟均為自動化實施細胞裂解、核酸純化、PCR擴增和在低密度微陣列上的多重終點法檢測。下列操作和試劑用于進行再CARD上的HPV檢測。參見圖14A-14L。樣品添加和細胞裂解a.操作員將樣品(例如，陰道拭子)插入至樣品輸入槽。
b.將30 μ I蛋白酶K和細胞裂解緩沖液的混合物分配至試劑輸入槽，并將其泵送至樣品輸入槽，孵化5分鐘。c.將30 μ I乙醇分配至試劑輸入槽，并將其泵送至樣品輸入槽。d.將樣品輸入槽的所有內(nèi)容物泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過過濾膜，并將其泵送至廢料槽。e.將40μ I乙醇分配至試劑輸入槽，并將其泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過過濾膜，并將其泵送至廢料槽。f.將70 μ I洗滌緩沖液I分配至試劑輸入槽，并將其泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過過濾膜，并將其泵送至廢料槽。g.將70 μ I洗滌緩沖液2分配至試劑輸入槽，并將其泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過過濾膜，并將其泵送至廢料槽。h.將90 μ I水分配至試劑輸入槽并將其泵送至廢料槽。i.將70 μ I洗脫緩沖液分配至試劑輸入槽，并將其泵送至所述純化槽中的過濾膜頂部，然后將其泵送至廢料回到其來自的通道。然后抽吸任何殘留流體使其穿過所述過濾膜，并將其泵送至廢料槽。洗脫a.將50 μ I洗脫緩沖液分配至一個洗脫槽，并泵送其一部分至另一個洗脫槽，然后將其剩余部分向上泵送穿過純化槽中過濾膜底部，通過將其交替地注入和空出純化槽至少2次來抖動。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)裝載a.將12 μ I PCR預混合液I分配至一個預混合液槽，然后重復操作將12 μ I PCR預混合液2分配至另一個預混合液槽。b.將少量(3次彎曲的薄膜)純化槽的內(nèi)容物泵送至第二洗脫槽，該槽中泵送有洗脫緩沖液。c.泵送單次彎曲的薄膜以驅(qū)動少量物質(zhì)從純化槽至一個擴增槽，然后向該同一擴增槽中加入來自該擴增槽同一側(cè)的預混合液槽中的預混合液。重復操作以加注第二擴增槽。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
a.于 37。C 10 分鐘b.于 95。C 2 分鐘c.循環(huán) IOxi.于 95。C 30 秒ii.于 46。C 30 秒iii.于 72。C 30 秒d.循環(huán) 30xi.于 95。C 15 秒ii.于 49。C 30 秒iii.于 72。C 30 秒iv.于 72。C 3 分鐘反向斑點雜交(RDB)過濾膜滅活處理a.在上述PCR熱循環(huán)期間進行反向斑點雜交(RDB)過濾膜滅活處理，從而所述兩個步驟與擴增完成相協(xié)調(diào)。b.將150 μ I的O. IN NaOH泵送至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜的頂部，將其從所述膜的頂部穿過穿孔環(huán)并回到所述膜的頂部循環(huán)5次，再泵送至廢料槽。c.將90 μ I水泵送至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜的頂部，然后將其從所述膜的頂部穿過穿孔環(huán)并回到所述膜的頂部各循環(huán)3次，再泵送至廢料槽。再重復該步驟I次。預雜交a.將 70 μ I 雜交緩沖液(O. 15Μ NaCl+0. OlM磷酸鈉 +0. 001MEDTA+0. 1%SDS+15% 甲酰胺，最終PH 7. 25-7. 50)分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜的頂部，將其從所述膜的頂部穿過穿孔環(huán)并回到所述膜的頂部循環(huán)5次，再泵送至廢料槽。擴增物移出a.將70 μ I雜交緩沖液分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜的頂部。b.將70 μ I雜交緩沖液分配至分析試劑槽，并將其泵送至一個擴增反應(yīng)器中。對另一個擴增反應(yīng)器進行重復操作。c.關(guān)閉擴增加熱器，并冷卻擴增反應(yīng)器以使得所述蠟/硅油固化所述密封層，從而當移除擴增物時所述液相的蠟/硅油不隨擴增物一起被移除。雜交a.將各擴增反應(yīng)器的內(nèi)容物泵送至所述分析膜的頂部。b.通過循環(huán)(從分析膜的頂部穿過穿孔環(huán)并回到分析膜的頂部)孵化所述分析槽的內(nèi)容物12. 5分鐘。然后排空所述內(nèi)容物至廢料槽。c.將90 μ I洗滌緩沖液分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜的頂部，然后將其從所述膜的頂部穿過穿孔環(huán)并回到所述膜的頂部各循環(huán)3次，再泵送至廢料槽。重復操作2次。結(jié)合a.將120 μ I HRP分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析膜的頂部，將其從所述分析膜的頂部穿過穿孔環(huán)并回到所述分析膜的頂部循環(huán)4分鐘，再泵送至廢料槽。b.將90 μ I洗滌緩沖液泵送至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析過濾膜的頂部。然后將其從所述分析膜的頂部穿過穿孔環(huán)并回到所述分析膜的頂部各循環(huán)3次，再泵送至廢料槽。重讀操作3次。底物添加a.將120 μ I TMB分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析膜的頂部，將其從所述分析膜的頂部穿過穿孔環(huán)并回到所述分析膜的頂部各循環(huán)10分鐘，再泵送至廢料槽。b.將90 μ I水分配至分析試劑槽，并將其泵送至所述分析膜的頂部。然后將其從所述分析膜的頂部穿過穿孔環(huán)并回到所述分析膜的頂部循環(huán)15次，再泵送至廢料槽。重讀操作3次。
圖像分析a.將照相機置于分析膜上方并記錄圖像。b.將圖像發(fā)送至控制系統(tǒng)進行處理。c.報告結(jié)果。實施例4 :基于CARD的快速分子檢測和20個臨床相關(guān)的HPV種類的確認該實施例描述了使用上述實施例3中所述的方案，直接從CARD上的臨床樣品中，快速、容易且自動化測定和區(qū)分至少20種臨床相關(guān)的人乳頭狀瘤病毒(HPV)的方法。引言在低收入國家婦女中宮頸癌是導致癌癥相關(guān)的死亡的主要原因，在世界范圍內(nèi)其為導致癌癥相關(guān)的死亡第二大原因。在目前FDA批準的分子診斷學方法中，除了將HPV分為“高”或“低”風險類型，其中沒有一種能夠區(qū)分各種HPV。目前，美國有兩種FDA批準的用于直接測定HPVDNA的分子診斷測試法，雜交捕獲測試(Digene HC2, Qiagen, Valencia, CA)和 Cervista HPV 測試(Hologic, Bedford MA)。二者均依賴于信號擴增而非目標物擴增。然而，兩種FDA批準的試劑盒無法識別單獨的HRHPV，而是將單獨或多個HR HPV識別為同樣的陽性結(jié)果。另外，有將LR HPV作為一組檢測的雜交捕獲試劑盒和僅特異性檢測HPV 16和18的Cervista試劑盒。盡管提供了兩種確定宮頸癌可能性的高預測性測試法，低收入地區(qū)和工業(yè)化地區(qū)的宮頸癌死亡率差異依然很大。文化、社會經(jīng)濟和后勤保障的障礙阻礙了貧困地區(qū)的婦女受益于這些測試法的預測價值。設(shè)計一種便宜的快速現(xiàn)場測試器件用于HPV的分子測試，會大大改善全世界的宮頸癌檢測。這樣的檢測將提供關(guān)于HPV狀態(tài)的即時和準確結(jié)果，并告知是否需要進一步治療或需要時間做下一步檢查。該實施例描述的HPV核酸測試可排除上述障礙而提供給不同的人群。材料和方法基因組DNA的制備、稀釋和存儲將購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC中心，弗吉尼亞州馬納薩斯市)的C-33A人宮頸癌細胞系培養(yǎng)并維持于含有10%胎牛血清的伊格爾氏最小必需培養(yǎng)基(EaglesMinimal Essential Media),于37。C、CO2下進行水套加熱孵化。將細胞培養(yǎng)至匯合到一起，通過直接刮擦至PBS中或通過胰蛋白酶化后再細胞計數(shù)進行收集。收集約5百萬個細胞(相當于I千萬個基因組)并進行細胞裂解，然后用QiagenDNeasy試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化基因組DNA。通過260nm處的吸光度測定核酸的濃度。純化的核酸于-20° C存儲。質(zhì)粒DNA的制備、稀釋和儲存含有HPV基因組的嵌合質(zhì)粒DNA購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC中心，弗吉尼亞州馬納薩斯市)并轉(zhuǎn)化至DH5CI大腸桿菌中。將培養(yǎng)物增值，用Qiagen微型質(zhì)粒試劑盒(Qiagen Plasmid MiniKit) (Qiagen, Valencia, CA)純化粒 DNA。通過 260nm 處的吸光度測定DNA濃度，將DNA稀釋至1E6個拷貝/ μ I。質(zhì)粒DNA儲備液于-20 ° C存儲。從臨床樣品制備DNA所有樣品均為在Digene存儲運輸媒介中的最初作為陰道拭子收集的樣品。部分樣品還用Digene變性溶液做了預處理。將200 μ I樣品用Qiagen DNAeasy或機構(gòu)內(nèi)部(in-house)的純化試劑進行核酸純化，這將在別處描述。純化的核酸于-20° C存儲。
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HPV引物和探針的設(shè)計基于對應(yīng)于L2基因3’端和LI基因5’端的HPV區(qū)設(shè)計HPV LI基因引物組，其最初由Yoshikawa描述，再由其他人詳細描述(Yoshikawa H, Kawana T, KitagawaK, Mizuno M, Yoshikura H, Iwamoto A :使用通用引物進行DNA擴增檢測和分類外陰人乳頭狀瘤病毒(Detection and typing of multiple genital human papiIlomavirusesbyDNA amplication with consensus primers), Jpn J Cancer Res 1991, 82(5):524-531 ；Jeney C, Takacs T，Sebe A, Schaff Z:使用L1F/L1R引物系統(tǒng)基于多重PCR和雜交進行DNA擴增檢測和分類46種外陰人乳頭狀瘤病毒(Detection and typing of 46 genitalhumanpapillomaviruses by the L1F/L IR primer system based multiplex PCRandhybridization), J Virol Methods 2007，140(1-2) :32-42 ;Takacs T,Jeney C, KovacsL, Mozes J, Benczik M, Sebe A:用于測定15種高風險和5種低風險HPV類型的基于分子信標的實時 PCR 法(Molecularbeacon-based real-time PCR method for detection of15 high-risk and 51ow-risk HPV types),J Virol Methods 2008,149 (I):153-162)。各特定HPV類型的序列獲自國家生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnologyinformation) (www. ncbi. nlm. nih. gov)。所述 HPV 類型和對應(yīng)的登錄號如下NC_000904;11:M14119;16:NC_001526;18:NC_001357;31:J04353;33:M12732;35:M74117;39:M62849M38185;42:M73236;43:AJ620205;44:U31788;45:X74479;5LM62877;52:X74481;53:NC_001593;56:EF177177;58:D90400;59:X77858;66:U31794;68:DQ080079?；贘eney 等人描述的引物(Jeney C，Takacs T, Sebe A, SchaffZ :使用 LlF/LlR引物系統(tǒng)基于多重PCR和雜交進行DNA擴增檢測和分類46種外陰人乳頭狀瘤病毒(Detection and typing of 46 genitalhuman papillomaviruses by the LlF/L IR primer system based multiplexPCR and hybridization), J Virol Methods
2007,140(1-2) :32-42),使用 CLC Sequence Viewer 軟件(www. clcbio. com)校準目標 HPV基因組的正向或反向引物區(qū)。將引物歸類于最相似序列。在最多10個3’核苷酸內(nèi)不允許有錯配，以使得在由聚合酶催化核苷酸結(jié)合處上游區(qū)域有最佳的堿基配對。序列被校準后，將其分組，從而單個引物中包含的簡并核苷酸不超過2個。除了 HPV 6、11、16和18略微修改，捕獲-特異性探針序列由Jeney等人描述。所述捕獲探針序列如圖30 (表1，SEQ ID N0S: 1-20)所示。探針為5’端用通過6-碳間隔臂連接的伯胺修飾。所有的引物和探針在美國集成DNA技術(shù)公司(衣阿華州科爾維爾)合成。球蛋白引物和探針的設(shè)計選擇人球蛋白基因為必需的內(nèi)部陽性對照以確認臨床樣品的核酸純化。所述正向和反向引物分別設(shè)計如下5’-GAA TAA CAGTGA TAA TTT CTG GG-3'和5’-GAA GATMG AGG TAT GAACAT GA_3’ (SEQ ID NO:21)。所述端氨基 β -球蛋白捕獲探針為5’-ATCGAGCTG AAG GGC ATC GAC TTC ΑΑ-3’ (SEQ ID NO:22)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)針對HPV 16和HPV 18，基于其顯著的高風險HPV亞型，實施了含有全長病毒DNA的質(zhì)粒的廣譜PCR優(yōu)化方案。初步實驗表明，相比HPV 18，HPV 16的擴增難度 更大，因此優(yōu)化的重點在于HPV 16擴增。熱循環(huán)條件類似于Jeney等人所描述的條件(Jeney C，Takacs T, Sebe A, SchaffZ :使用L1F/L1R引物系統(tǒng)基于多重PCR和雜交進行DNA擴增檢測和分類46種外陰人乳頭狀瘤病毒(Detection and typingof 46 genitalhuman papillomaviruses by the L1F/L IR primer systembased multiplex PCR andhybridization) ,J Virol Methods 2007，140(1-2) :32-42)實施，其中進行 PCR 時 10 個循環(huán)為低溫退火，其余25-35個循環(huán)為高溫退火。在32ng C33A純化核酸的背景下，使用1000個含有質(zhì)粒HPV 16的拷貝進行PCR，優(yōu)化MgC12濃度、引物濃度、緩沖液成分以及兩次退火溫度中的每次退火溫度。在下列條件下最大程度地優(yōu)化PCR:10mM Tris-HCl，pH 9,50mMKCl, 100μ g/ml BSA, I. 5mM MgC12,0. 2mM dATP,0. 2mM dGTP,0. 2mM dCTP,0. 075mM dTTP,0. 125mM dUTP，0. 2μ M各單獨引物，0. 002單位/ μ I熱穩(wěn)定的尿嘧啶-DNA糖基酶，UDG (USB公司，俄亥俄州克利夫蘭市)和0. 05單位/ μ I GoTaq Hot Start聚合酶(Promega公司，威斯康星州麥迪遜市)。熱循環(huán)條件如下37° C 10分鐘(UDG激活)；95° C 2分鐘；10個循環(huán)的 95° C 30 秒，46° C 30 秒，72° 30 秒；25-35 個循環(huán)的 95° C30 秒，49° C 30秒，72° C 30秒；最后72° C延伸3分鐘。這些同樣的條件經(jīng)證明可用于β-球蛋白擴增。PCR優(yōu)化在MJ Mini梯度熱循環(huán)儀(Biorad公司，加利福尼亞州赫爾克里士)上實施，并進一步在Multigene II熱循環(huán)儀(Labnet公司，新澤西州木橋鎮(zhèn))上證實。電泳和圖像分析擴增后，將2μ1 6χ染料加入至10 μ I樣品中至終體積12 μ I。在裂解于0. 5ΧTAE (50Χ TAE 為 2Μ Tris-醋酸，IOOmM EDTA ；0. 5ΧΤΑΕ 為 20mM Tris-醋酸，ImM EDTA)緩沖液中的3%瓊脂糖凝膠上分析樣品，緩沖液中加有1/10,000體積的GelGreen(Biotium公司，加利福尼亞州海沃德市)。使用VWR微電泳系統(tǒng)(VWR公司，賓夕法尼亞州西切斯特市)，將樣品在100V電壓下電泳30-60分鐘。加樣孔用17泳道(4mm寬)或24泳道(3mm寬)梳子制備，其中分別加有5 μ I或3 μ I含染料的樣品。使用Dark Reader透射儀(Clare Chemical Research公司，科羅拉多州德羅斯)照明凝膠條帶，使用索尼Cyber-shot DSCH2數(shù)字照相機照相，ISO設(shè)為80，F(xiàn)=3. 5，快門速度=3秒，計時器=2秒。使用ImageJ軟件(http://rsb. info. nih. gov/i j/)定量條帶。使用設(shè)為50像素的滾球半徑去掉背景，收集計量峰下面的條帶面積。從臨床樣品中克隆LI片段將來自純化自臨床樣品的DNA的特定類型HPV LI擴增區(qū)克隆。為此，通過擴增和反向斑點雜交技術(shù)雜交確認特定HPV類型。HPV LI區(qū)克隆自含有單獨感染的樣品。用特異性型LI序列設(shè)計正向和反向引物(參見圖31，表2(SEQ ID NOS:23-46)，側(cè)面分別連接有Bam HI和EcoRl限制性位點。接著將所述消化的片段進行凝膠純化，并連接至BamHl/Eco Rl消化的和凝膠純化的pBS nKS+(BluesCript)克隆載體。使用HPV引物混合物證實HPV插入片段的成功擴增，并通過RDB和測序證實特定類型，使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems)自動化3730DNA分析器，其帶有Big Dye終止劑化合物和Ampli-Taq-FS DNA聚合酶(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，加利福尼亞州福斯特市)。點位對照和陽性對照的設(shè)計用于RDB過濾膜的點位對照設(shè)計為如下/5AmMC6/AAA AAA AAA AAA AAA AAA/3Bio/(SEQ IDNO:47)。將陽性對照設(shè)計為含有針對HPV 6/11的正向引物序列，針對HPV 42的反向引物 序列，其側(cè)面連接來自綠色熒光蛋白的非-HPV相關(guān)序列，質(zhì)粒為pEGFP-C2。為此，將引物設(shè) 計為具有Bam HI和EcoRl限制性位點，側(cè)面分別連接正向和反向引物序列，其依次側(cè)面連接能夠擴增258bp GFP插入片段的GFP特定序列。所得正向和反向引物序列分別為5’ -GCTTGG ATC CCG TAA ACG TAT TCC CTT ATTTTT TTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG-3’ (SEQID NO: 48)，以及5’-MG CGA ATT CAC TCT MA TAC TCT GTA CTG TCTTGT AGT TGC CGT CGTCCT TGA-3’ (SEQ ID NO:49)。擴增以后，將PCR產(chǎn)物純化并用Bam HI和Eco Rl限制性酶切。然后將消化的片段進行凝膠純化，并連接至Bam Hl/Eco Rl消化的和凝膠純化的pBSII KS+(Bluescript)克隆載體。使用HPV引物混合物證實GFP片段的成功擴增。反向斑點雜交(RDB)采用Zhang 等人描述的方法制備濾膜(Zhang Y, Coyne MY, WillSG, LevensonCH, Kawasaki ES:使用膜結(jié)合修飾的寡核苷酸進行癌癥和遺傳性疾病的單堿基突變分析(Single-base mutational analysis ofcancer and genetic diseases using membranebound modifiedoligonucIeotides), Nucleic Acids Res 1991，19 (14) : 3929-3933)。簡而言之，將帶負電荷的尼龍，0. 45um的Biodyne C膜(Pall Corporation, city, state)在0· INHCl中預先濕潤，然后在10%Ν-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)中激活15分鐘。將膜在水中沖洗后于空氣中干燥。將端氨基核酸探針重懸浮于含O. 1%吐溫的O. 5M碳酸氫鈉中，使用BioRobotics Biogrid(馬薩諸塞州波士頓)在膜上點樣。將膜在空氣中干燥并保持干燥至使用。使用前將膜在O. IN NaOH中孵化以淬滅任何尚未結(jié)合的激活位點。 將5 μ I擴增物與50 μ I雜交緩沖液(3XSSPE，O. 1%SDS, 25%甲酰胺)混合，于95° C加熱5分鐘，立即放到冰上以防止重新退火。所有膜的操作在室溫下輕度振蕩實施。將膜在250 μ I雜交緩沖液中預雜交15分鐘，然后加入變性的擴增物并雜交1-3小時。雜交以后，在1.5ml O. 1%SDS中沖洗過濾膜兩次，每次10-15分鐘。將膜與1:500稀釋的結(jié)合鏈霉親和素的辣根過氧化物酶(Thermo Fisher Scientific公司，馬薩諸塞州沃爾瑟姆)在IX SSPE/0. 1%SDS中孵化化30分鐘，然后在O. 5X SSPE/0. 3%SDS中沖洗3次，每次10分鐘。將 750 μ I 的一步法 TMB-Blotting 溶液(Thermo Fisher Scientific 公司)加入至膜上，顯色10分鐘。用5ml水沖洗膜10分鐘。將顯色的過濾膜用HewlettPackard Scanjet4850掃描和/或進行照相記錄。
結(jié)果PCR引物的設(shè)計圖32(表 3A，SEQ ID NOS: 50-77)和圖 33(表 3B，SEQ IDNOS: 78-105)顯示了按照“材料和方法”中描述的規(guī)則設(shè)計的用于擴增所述HPV LI基因的引物。從3’端開始校準以后，在最多10個3’核苷酸內(nèi)不允許有任何錯配，每個引物最多使用2個簡并核苷酸，總共設(shè)計了 8個正向和8個反向引物序列。這將Jeney等人(Jeney C，TakacsT, Sebe A, SchaffZ:使用L1F/L1R引物系統(tǒng)基于多重PCR和雜交進行DNA擴增檢測和分類46種外陰人乳頭狀瘤病毒(Detection andtyping of 46 genital human papillomaviruses by theL1F/L IR primersystem based multiplex PCR and hybridization), J Virol Methods2007，140(1-2) :32-42)合成的引物數(shù)目減少了一半，從而減少了 PCR檢測的總成本。從降解序列中產(chǎn)生了共13個正向引物和21個反向引物。按照這種方法，其中含有的引物混合物準確匹配20HPV目標物中的16個，包括除一個外的所有高風險類型。而且，盡管試圖覆蓋盡可能多的引物序列，在低風險類型中錯配并非是令人非常擔心的問題。推斷盡管期望所有相關(guān)的類型都和會這些引物一起擴增，在不大可能的事件中即低風險則沒有擴增，這些條件下的假陰性并不像假陰性高風險那么重要。正向引物組中的錯配包括單獨的低風險42和43錯配，以及3個低風險44的錯配。反向引物組中的錯配包括單獨的低風險11和44錯配，以及高風險66錯配。除了一個在HPV 44正向序列中以外，所有錯配都在引物的5，端內(nèi)。 HPV擴增的確認HPV LI引物組最初在含全長或部分HPV序列的嵌合質(zhì)粒上測定。圖34所示為各種HPV類型的質(zhì)粒DNA擴增結(jié)果。將含100個拷貝/μ I的含有針對HPV 6、11、16、18、52的全長DNA序列的質(zhì)粒或針對HPV 35的部分序列的反應(yīng)混合物進行40個循環(huán)的擴增。在所有情況下，在I. 6ng/μ I C33A核酸存在下擴增HPV。所有質(zhì)粒與引物組一起擴增。每種質(zhì)粒作為模板的效果存在差異，HPV 18比其他模板明顯效果更好的。為了清除顯示LI引物組的各質(zhì)粒模板之間的效果差異，在2倍梯度稀釋的質(zhì)粒DNA中進行擴增。圖35A-D所示為代表性實驗的結(jié)果，其中每個反應(yīng)中HPV質(zhì)粒DNA以12-12，500個拷貝/ μ I DNA在I. 6ng/μ I基因組核酸的背景下擴增。上部圖像為用于分離含質(zhì)粒的HPV 16和HPV 18的擴增產(chǎn)物的凝膠，與圖34所示相似，在低拷貝數(shù)量下HPV 18表現(xiàn)出比HPV 16更好的擴增效果。這些凝膠以及類似凝膠的圖像分析數(shù)據(jù)對其余質(zhì)粒的擴增產(chǎn)物分析如圖35Β所示。這些圖像的數(shù)據(jù)證實HPV 18比其他質(zhì)粒具有明顯更好的擴增效果，類似地在這些條件下HPV 16的擴增敏感性差一些。HPV 18擴增在約200個拷貝/μ I時開始穩(wěn)定，HPV 11、35和52的擴增在約800個拷貝/ μ I時開始穩(wěn)定，而效果最差的模板HPV 16的擴增在約1500個拷貝/ μ I時開始穩(wěn)定。除了全長和部分HPV克隆以外，將直接克隆至臨床樣品的LI目標區(qū)與LI引物一起擴增。圖3 所示為10個拷貝/ μ I至10，000個拷貝/ μ I的12個特異性型HPV克隆的PCR圖像分析結(jié)果。與在全長質(zhì)粒中所見到的類似，一些模板比其他模板更敏感。在最敏感模板的擴增中，HPV 18、31、33、51、56和66在〈150個拷貝/μ I時開始穩(wěn)定。更困難模板的擴增在>300個拷貝/ μ I時開始穩(wěn)定，而最困難模板HPV16的擴增在1500個拷貝/μ I時開始穩(wěn)定。其余模板在這些較低和較高范圍之間顯示擴增穩(wěn)定。總之，這些數(shù)據(jù)表明，HPV測定的所有目標物均為與LI引物組一起擴增的合適模板。初步實驗(數(shù)據(jù)未示出)表明，HPV和β -球蛋白不能在互相產(chǎn)生不利影響的情況下在同樣的反應(yīng)混合物中同時擴增。通常，如果一個模板大大多于另一個模板，就會存在PCR反應(yīng)物競爭，從而使得其為一個最終產(chǎn)物效果差的檢測。因此，檢測被設(shè)計為β_球蛋白和HPV能夠在分開的室(chamber)中進行擴增，但需要有同樣的熱循環(huán)條件。在圖35A和35B所示的實驗中，將同樣的引物與β_球蛋白引物一起擴增。圖35Α的下部圖像所示為球蛋白擴增產(chǎn)物的代表性凝膠。這些實驗的樣品含有與所示HPV擴增曲線一樣的輸入HPV和基因組DNA。HPV輸入增加了，而基因組輸入核酸穩(wěn)定在I. 6ng/μ I。在該圖像中可以看出，輸入HPV的水平對球蛋白擴增的影響很小或無影響。圖3 所示為圖35Β中所示各質(zhì)粒HPV進行的伴侶球蛋白凝膠電泳的圖像分析結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，不考慮HPV的輸入，β球蛋白擴增保持相對穩(wěn)定。因此，鑒于HPV和球蛋白的共擴增導致競爭，存在其中一個模板而無特異性引物不對特定目標物的擴增產(chǎn)生不利影響。球蛋白曲線
·
將內(nèi)部對照β -球蛋白在與HPV分開的室中擴增，但處于與HPV相同的溫度和循環(huán)條件下。因此，確定在這些條件下β_球蛋白擴增表現(xiàn)如何非常重要。為解決這一問題，將純化至C33A細胞的梯度稀釋的核酸與β-球蛋白引物一起擴增。以O(shè). 025-1. 6ng/μ I的純化核酸擴增30、35或40個循環(huán)。這些實驗的結(jié)果如圖36所示。當PCR擴增40個循環(huán)，擴增物產(chǎn)物在〈O. 2ng/ μ I輸入核酸時完全飽和。反之，當擴增30或35個循環(huán)，球蛋白擴增分別在O. 4或O. Ing/ μ I時開始穩(wěn)定，且分別到>1. 6或>0. 8ng/ μ I時開始穩(wěn)定。這些數(shù)據(jù)來自不同天使用不同時間純化的C33A核酸，表明了該檢測的高度可重復性。在圖36中的實驗中，模板存在于在純化自C33A細胞的總核酸而不是純化的DNA的背景下。因為這些實驗的最終目標是設(shè)計用于HPV檢測的快速現(xiàn)場測試微流體分子診斷工具，該檢測的每個步驟的設(shè)計理念是實現(xiàn)終點法測試。因此，考慮到使用核糖核酸酶處理的核酸導致無RNA的純化DNA。在實驗中，在純化模塊核糖核酸酶被確定為沒有必要且可能不利于從低細胞濃度中的實際核酸回收。也即，在DNA有限的情況下，RNA可作為載體而有助于純化。進行了一些純化實驗以比較產(chǎn)量加/減核糖核酸酶處理，在C33A細胞的情況下，無核糖核酸酶處理的核酸產(chǎn)量通常要高4倍，表明實際基因組DNA量是通過在260nm處吸光度測定的實際產(chǎn)量的四分之一。HPV/球蛋白的反向斑點雜交(RDB)基因組和HPV DNA在分開的容器中PCR擴增后，將所述擴增物混合并在單獨濾膜上進行RDB。圖37A所示為在I. 6ng/ μ I基因組核酸背景下10個拷貝/ μ I的HPV的擴增結(jié)果。上部圖像所示為HPV擴增物的凝膠圖像，底部圖像所示為對應(yīng)的球蛋白擴增物。相對強度表明各克隆作為模板的作用與前述對于10個拷貝/ μ I (圖37Β和數(shù)據(jù)未示出)所見的一致。圖37Β所示為各HPV和球蛋白擴增物組合的RDB結(jié)果。各克隆被其特異性膜結(jié)合探針捕獲并產(chǎn)生清晰的斑點。無論擴增物圖像強度，除一個以外的所有其他RDB斑點都很強。另一方面，HPV 53捕獲的強度顯示出類似于低強度擴增，但是仍然可鑒別。臨床樣品-細胞數(shù)目的測定確定在RDB上特定的檢測后HPV和球蛋白擴增的有力和可重復條件后，使用真實的生物樣本證實所述檢測。將獲得的117個臨床樣品進行核酸純化、HPV和球蛋白擴增，最后通過RDB測定。收集所有117個樣品并存儲于存儲運輸媒介(STM，Qiagen)中。其中部分樣品在存儲前還用堿性變性試劑(Qiagen)處理。核酸純化之前，將樣品冷凍并存儲數(shù)周。平均而言，純化自樣品的核酸存儲時加入變性試劑比樣品僅存儲于STM中時的產(chǎn)量稍高。來自含變性試劑/STM溶液與僅含STM溶液的產(chǎn)量分別為11和4. 6ng/l·! 1，在260/280nm處的吸光度比率分別為I. 8和1.6。起初，O. 5μ I各樣品在球蛋白存在下通過PCR30個循環(huán)進行分析，無論其產(chǎn)生的核酸濃度，各樣品可檢測的擴增物條帶可通過像素強度測量，并通過RDB測定證實。如圖38中所示，盡管在這些條件下并非直接相關(guān)，像素強度增加的趨勢與ng/ μ I產(chǎn)量增加的趨勢一致。因此，甚至不存在可檢出的核酸時(通過吸光度，Nanodrop檢出限 lng/ μ 1),30個循環(huán)的PCR后該檢測產(chǎn)生了可檢測的球蛋白擴增物，從而證實了該檢測用于臨床研究的敏感性和用處。將半量PCR擴增球蛋白用于計算臨床樣品中基因組的數(shù)目。報告表明，陰道拭子含有約 1_5 百萬個細胞(Depuydt CE, Benoy IH, Bailleul EJ, VandepitteJ, Vereecken AJ, Bogers JJ :改善的宮頸內(nèi)取樣和通過 Cervex-Brush Combi 宮頸刷進行 HPV 病毒載量測定(Improvedendocervical sampling and HPV viral load detection by Cervex-BrushCombi),細胞病理學(Cytopathology) 2006, 17 (6) :374-381 ；Quint WG, Pagliusi SR, Lelie N, de Villiers EM, Wheeler CM :第一次世界衛(wèi)生組織關(guān)于人乳頭狀瘤病毒DNA測定的國際合作研究結(jié)果(Results of thefirst WorldHealth Organization international collaborative study ofdetection of humanpapillomavirus DNA), Clin Microbiol 2006,44(2):571-579 ；Schellenberg J,BlakeBall T, Lane M, Cheang M, Plummer F :流式細胞儀定量由參加婦科診療的成人自行收集的陰道拭子樣品中細菌(Flow cytometric quantification of bacteria in vaginal swabsamples self-collected by adolescents attending a gynecologyclinic),微生物學方法雜志(J Microbiol Methods) 2008，73(3) :216-226)相當于 6. 4x10-6-3. 2xl0_5g 純DNA。使用來自C33A細胞的無RNA的DNA，進行30個循環(huán)的PCR，產(chǎn)生了對于ng輸入的像素強度曲線(圖39A)。這類似于圖36產(chǎn)生的曲線，然而，這種情況下總輸入核酸為基因組DNA，因此直接與基因組數(shù)目相關(guān)。為了從ng/ μ I轉(zhuǎn)換為#基因組,使用下列公式((ng/nl)/1E9) /3. 2E_12g/ 基因組為了將基因組轉(zhuǎn)換為細胞，將上述公式的結(jié)果除以2。為了確定臨床樣品中存在的基因組數(shù)目，通過稀釋分析了各種低、中、高產(chǎn)量的樣品(圖38)，以便擴增物的所得強度落入該檢測的線性范圍內(nèi)。圖39B中的結(jié)果顯示，僅儲存于STM中的樣品的計算范圍為l-40ng/ μ I。這些數(shù)目比由260nm處吸光度得到的ng/ μ I高約2-7倍。這并不奇怪，因為如上所述，在無核糖核酸酶存在下純化的總核酸比核糖核酸酶處理后純化的DNA平均高4倍。使用上述公式，該范圍對應(yīng)于312. 5-12，500基因組/μ I或156. 25-6，250細胞/μ I。這些樣品的最初容積為1ml。因此，在這些樣品中發(fā)現(xiàn)的細胞數(shù)目范圍為 156，250-6，250，000。圖39C所示為存儲于STM和變性劑中的樣品計算的ng/μ I。在這些條件下，計算的ng/ μ I和由260nm處吸光度得到的ng/ μ I之間的差異并不像在堿存在下水解RNA那么一致。在這些條件下計算的DNA范圍為O. 6-20ng/μ I。這對應(yīng)于187. 5-6250基因組/ μ I或93. 75-3125細胞/μ I。這些樣品的最初容積為I. 5ml。因此，在這些樣品中發(fā)現(xiàn)的細胞數(shù)目范圍為 140, 625-4，687，500?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，使用該半量系統(tǒng)能夠估計在不同條件下存儲的樣品的細胞數(shù)目，且不考慮該存儲，計算的細胞范圍與前述的報告一致。這些數(shù)據(jù)提供了在陰道樣品中預期的較低(約150，000個細胞)和較高(約5，000，000個細胞)的限制，并表明該檢測可兼容樣品中預期的所有范圍。臨床樣品和HPV的證明為表明該系統(tǒng)可和與當前接受的HPV測定方法一樣或更好地測定和區(qū)分HPVJf由來自所有117個臨床樣品的純化核酸，在所得擴增物進行RDB后，使用LI引物組進行PCR。圖40 (表4)概括了臨床樣品的PCR和RDB結(jié)果。如表中所示，75% (88/117)的樣 品PCR后表現(xiàn)出HPV擴增條，45%(40/88)的HPV擴增物陽性通過HPV-特定探針在RDB上被捕獲到。對于未檢測到其他樣品最可能的解釋是，不存在該HPV類型的特定捕獲探針。在所述的HPV RDB陽性斑點中，31/40含有高風險HPV類型，存在為單獨感染(21)、多個高風險感染(5)或結(jié)合低和高風險感染(5)。其余9個RDB陽性樣品均由于低風險單獨(7)或多數(shù)⑵感染。確定了與Digene HC2 (Qiagen, Valencia, CA)數(shù)據(jù)相比，在測定高風險HPV上該檢測具備如何的優(yōu)勢。如圖41A的數(shù)據(jù)顯示了使用Digene系統(tǒng)的HPV高風險陽性樣品，相對于由該實施例中描述的系統(tǒng)獲得的HPV結(jié)果的比較。該檢測證實了除了一個以外的Digene高風險樣品的高風險感染性。該樣品(數(shù)據(jù)未示出)導致Digene陽性I. 01,僅考慮Digene陽性高風險。然而，在該樣品的多個重復中，從未檢測到HPV擴增物。這表明這可能被識別為假陽性。另一方面，該檢測系統(tǒng)表明在這個實施例中找出了一些其他使用Digene HC2試劑盒無法測定出的高風險樣品，如圖41B中所示，本檢測系統(tǒng)找出了 6個被Digene系統(tǒng)識別為陰性的高風險樣品，表明了該實施例中所述檢測的高度敏感性和特異性。討論該實施例描述了測定和區(qū)分單獨低和高風險HPV亞型的HPV分子診斷測試的發(fā)展。該方法開發(fā)為用于僅需在用戶部位輸入生物樣本的全自動微流體(CARD)平臺。該自動化方案從樣品中釋放核酸，并將其與球蛋白和HPV特異性引物一起擴增，通過反向斑點雜交和測定確認HPV的特定亞型。所述實施例表明了所述檢測確認20種不同感染性HPV類型以及來自人上皮細胞的β_球蛋白的能力。另外，還表明了該檢測的敏感性和可重復性。初步研究(未示出)旨在測定以前已知的基于PCR的確認生物樣品中HPV特異性亞型的方法，并確定是否任何這些方法均適合使用所述HPV檢測，和/或是否任何這些方法均可被改善。用于所述CARD的良好目標物選擇的標準包括I.在PCR期間不需要大量延伸時間的短擴增物的擴增，因而使得減少了 PCR的整個時間。2.選定高可變區(qū)作為靶標以設(shè)計用于所有目標靶標的特定捕獲探針，當其變得相關(guān)時可被延長以包括新的HPV亞型。3.在靶標位點側(cè)面區(qū)域的高的同源性，以將擴增所有目標HPV靶標的所需的引物數(shù)目減低至最小。盡管許多本領(lǐng)域已知的基于PCR的方法依賴于LI基因中的獨特核酸序列的擴增，也有依賴于HPV基因組中替代性基因的方法(Josefsson A, Livak K, Gyllensten U :通過使用突光5’外切酶檢測而測定和定量人乳頭狀瘤病毒(Detection and quantitationof humanpapiIlomavirus by using the fluorescent 5'exonuclease assay), JClinMicrobiol 1999，37 (3) : 490-496)。圖 42 (SEQ ID NO: 106)所示為 HPV 16 的 LI 基因序列,HPV 16含有明顯對應(yīng)于各種用于擴增的目標區(qū)的序列(SEQ ID NOS: 107-112)。SEQ IDNO: 107 和 SEQ ID NO: 108 分別為 LI 正向和反向引物；SEQ ID NO: 109 和 SEQ ID NO: 110 為SPF 引物；SEQ ID NO: 110 和 SEQ ID NO: 111 為 GP5/GP6 ;SEQ ID NO: 109 和 SEQ ID NO: 112為 PGMYl 1/09。三個已經(jīng)建立的系統(tǒng)擴增位于LI基因中間的所有或部分450bp區(qū)。所述MY09/MYll系統(tǒng)最初在1990年代早期描述為一組簡并引物，其可測定多個產(chǎn)生約450bp擴增物的HPV 類型(Hildesheim A, Schiffman MH, Gravitt PE, Glass AG, Greer CE, Zhang T, ScottDR, Rush BB, Lawler P, Sherman ME等人特異性型人乳頭狀瘤病毒感染在細胞學正常婦 女中的持久性(Persistence of type-specific humanpap i I lomavirus infection amongcytologically normal women), J InfectDis 1994，169 (2) : 235-240)。為了避免使用簡并引物可能引起的一些問題，Gravitt 等人(Gravitt PE, Peyton CL, Alessi TQ, WheelerCM, Coutlee F，Hildesheim A, Schiffman MH, Scott DR, Apple RJ :改善的人外陰乳頭狀瘤病毒擴增(Improved amplication of genetal humanpapi I lomavirus) ,J Clin Microbiol2000，38(1) : 357-361)改進了該MY09/MY11系統(tǒng)并設(shè)計了一組5個正向和13個反向引物。單獨組合這些引物能夠擴增任何目標HPV類型。針對該同樣的區(qū)域，Snijders等人(Snijders PJ, van den Brule AJ, Schrijnemakers HF, Snow G, MeijerCJ, Walboomers JM:聚合酶鏈反應(yīng)在通用引物中的應(yīng)用使得能夠進行廣譜的人乳頭狀瘤病毒基因型測定(Theuse of general primers in thepolymerase chain reaction permits the detectionof a broad spectrum ofhuman papillomavirus genotypes), J Gen Virol 1990,71(PtI) : 173-181)確認了通過在3’延伸而進一步修改后的單獨序列引物(de RodaHusmanAM, Walboomers JM, van den Brule AJ, Meijer CJ, Sni jdersPJ :使用在 3’ 延伸的通用引物GP5和GP6和鄰近的高度保守序列以改善通過PCR測定人乳頭狀瘤病毒(The useof general primers GP5and GP6 elongated at their 3'ends with adjacent highlyconservedsequences improves human papillomavirus detection by PCR), J GenVirol1995, 76 (Pt 4) :1057-1062),并將其擴大以覆蓋更廣范圍的HPV類型(Schmitt M, DondogB, Waterboer T, Pawlita M :使用新的廣譜GP5+和GP6+引物通過PCR均勻擴增人外陰α乳頭狀瘤病毒(Homogeneous amplication of genital human alpha papillomavirusbyPCR using novel broad-spectrum GP5+and GP6+primers), J ClinMicrobiol2008,46(3) :1050-1059) o該“通用引物”系統(tǒng)產(chǎn)生的擴增物的大小為150bp。針對LI 基因的同樣區(qū)域，Kleter 和同事(Kleter B, van Doom LJ, SchrauwenL,Molijn A, Sastrowijoto S，ter Schegget J, Lindeman J, terHarmsel B, BurgerM，Quint W :用于測定和確認肛門和外陰人乳頭狀瘤病毒的高度敏感PCR反向雜交線性探針檢測的發(fā)展和臨床評估(Development and clinical evaluation of ahighly sensitive PCR-reversehybridization line probe assay for detectionand identification ofanogenital human papillomavirus)， J Clin Microbiol1999, 37(8) :2508-2517 ；Kleter Bj van Doom LJj ter Schegget Jj Schrauwen Lj vanKrimpen K，Burger M，ter Harmsel B，Quint W :用于高度敏感廣譜測定肛門和外陰人乳頭狀瘤病毒的新短片段 PCR 檢測(Novelshort-fragment PCR assay for highly sensitivebroad-spectrum detectionof anogenital human papillomavirus), Am J Pathol1998，153(6) :1731-1739)設(shè)計了一個通過結(jié)合“通用堿基”、肌苷而能夠識別所有HPV類型的4個正向和2個反向引物的系統(tǒng)。這些引物擴增一個65bp區(qū)域，該擴增物內(nèi)包括可直接針對特異性型捕獲的高可變區(qū)。集中于上游LI序列，Yoshikawa，等人(YoshikawaH，Kawana Tj Kitagawa K，Mizuno Mj Yoshikura H，Iwamoto A :使用通用引物進行 DNA 擴增檢測和分類外陰人乳頭狀瘤病毒(Detection and typing of multiple genitalhumanpapillomaviruses by DNA amplication with consensus primers)， Jpn J Cancer Res1991,82(5) :524-531)描述了后來修改為包括多達46個獨特HPV類型的L1C1/L1C2引物(Jeney C，Takacs T，Sebe A，SchaffZ:使用L1F/L1R引物系統(tǒng)基于多重PCR和雜交進行DNA擴增檢測和分類46種外陰人乳頭狀瘤病毒(Detection and typing of 46 genitalhuman papillomaviruses by the L1F/L IR primer system based multiplexPCRand hybridization),J Virol Methods 2007，140(1-2) :32-42 ;Takacs T，Jeney Cj KovacsLj Mozes Jj Benczik M，Sebe A:用于測定15種高風險和5種低風險HPV類型的基于分子信標的實時 PCR 法(Molecularbeacon-based real-time PCR method for detection of15 high-risk and 51ow-risk HPV types)，J Virol Methods 2008，149 (I):153-162)。該研究由 Jeney 承擔(Jeney C，Takacs T，Sebe A, SchaffZ:使用 L1F/L1R 引物系統(tǒng)基于多重PCR和雜交進行DNA擴增檢測和分類46種外陰人乳頭狀瘤病毒(Detection andtyping of 46 genital human papiIlomavirusesby the L1F/L IR primer systembased multiplex PCR and hybridization), J Virol Methods 2007，140 (1-2):32-42 ;Takacs T，Jeney C，Kovacs L，Mozes J，Benczik M，Sebe A :用于測定 15 種高風險和 5 種低風險HPV類型的基于分子信標的實時PCR法(Molecular beacon-based real-timePCRmethod for detection of 15 high-risk and 5 low-risk HPV types), JVirol Methods
2008,149(1):153-162)以確認能夠更敏感地測定更多類型的新區(qū)域，在HPV LI序列內(nèi)確認了一個與通過X射線晶體學研究確定的蛋白的一個高可變區(qū)一致的區(qū)域(ChenXSj Garcea RLj Goldberg I，Casini Gj Harrison SC :組裝自人乳頭狀瘤病毒 16 的 LI 蛋白的小病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)(Structure of small virus-like particlesassembled from theLI protein of human papillomavirus 16) ,Mol Cell2000，5 (3) : 557-567)，并通過域交換實驗進一步證實(Olcese VAj ChenYj Schlegel Rj Yuan H :HPV16L1環(huán)域在形成特異性型構(gòu)象表位中的特征(Characterization of HPV 16 LI loop domains in the formation ofatype-specific, conformational epitope)，BMC Microbiol 2004，4:29)。該引物的應(yīng)用描述于Jeney C, Takacs T，Sebe A，SchaffZ (使用L1F/L1R引物系統(tǒng)基于多重PCR和雜交進行DNA擴增檢測和分類46種外陰人乳頭狀瘤病毒(Detection and typing of 46 genitalhumanpapiIlomaviruses by the L1F/L1R primer system based multiplex PCRandhybridization), J Virol Methods 2007，140 (1-2):32-42)和 Takacs T，Jeney Cj KovacsL, Mozes J, Benczik M, Sebe A (用于測定15種高風險和5種低風險HPV類型的基于分子信標的實時 PCR 法(Molecularbeacon-based real-time PCR method for detection of 15high-risk and 5low-risk HPV types), J Virol Methods 2008, 149 (I) : 153-162),其產(chǎn)生了而一個_250bp擴增物。對前述的各LI擴增方法進行檢測。各系統(tǒng)均獲得成功。針對上游L1250bp區(qū)而選擇做進一步研究，由于其擴增物大小和捕獲探針區(qū)內(nèi)的高度可變性，該捕獲探針區(qū)允許更好地設(shè)計能夠在室溫下雜交的捕獲探針。隨著對HPV感染和宮頸癌潛在發(fā)展的了解增多，越來越清楚的是，除了確定高風險HPV類型的存在，理解每個細胞中病毒載量或HPV顆粒數(shù)目，還將有益于診斷。為檢驗該檢測的應(yīng)用，評估了來自同樣樣品的HPV和球蛋白的像素強度。圖43A所示為HPV像素強度隨對應(yīng)的球蛋白像素強度增加的曲線圖結(jié)果。如圖43A所示，球蛋白像素強度和HPV像素強度增加之間沒有關(guān)聯(lián)。
然后，將HPV和球蛋白像素的比率與高風險HPV類型的存在進行比較。圖43B顯示了 HPV和球蛋白像素的比率，并針對至高風險HPV類型繪制曲線。這些比率從〈I至>6變化，但與HPV類型的存在沒有明顯的關(guān)聯(lián)。圖43C顯示了 HPV和球蛋白像素的比率，并針對至高風險HPV類型繪制曲線。該“Digene”系列曲線描述了，與本發(fā)明檢測相比，商業(yè)上的Digene檢測結(jié)果數(shù)據(jù)。該插入圖顯示了隨后整合主圖中的Digene檢測結(jié)果(不同刻度的Y-軸)?？傊?，在CARD上進行的所述HPV檢測提供了用于快速可靠地分子檢測臨床相關(guān)HPV類型的全自動系統(tǒng)。而且，由于所述CARD的便攜性，該實施例中描述的方法在工業(yè)化國家和發(fā)展中國家均有廣泛的應(yīng)用。 實施例5 :基于CARD的稀少目標物檢測該實施例描述了稀少目標物的檢測。在該實施例中，所述稀少靶核酸與水生病原體相關(guān)。稀少靶核酸的測定顯示了其在水供給中的存在。該檢測可用于測定大容積液體樣品中存在的稀少目標物(來自少量的生物體或細胞核)。參照圖20A-20P，下列操作和試劑用于進行活水生病原體隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)檢測樣品添加和免疫磁力分離所有試劑均為商業(yè)購買自Dynal用于免疫磁力捕獲隱孢子蟲。將容積調(diào)整為用于CARD上的自動化操作。a.操作員將Iml預濃縮的含水樣品加入至樣品輸入槽。b.將100 μ I緩沖液1、100 μ I緩沖液2和10 μ I磁珠分配至樣品所在的相同管
中。輕度振蕩或抖動下孵化30分鐘。c.提升樣品輸入槽下的磁鐵，并將槽中的內(nèi)容物泵送至廢料槽。d.將200 μ I緩沖液I分配至緩沖液I槽，將磁鐵降低后將所述緩沖液泵送至樣品輸入槽以重懸浮所述磁珠。e.提升樣品輸入槽下的磁鐵，并將槽中的內(nèi)容物泵送至廢料槽。熱激熱激為可選地實施以測定在以上描述的免疫磁力分離步驟中捕獲的活生物體。(否則，按如下的詳細描述用標準PCR方法進行DNA擴增。)RNA擴增試劑和RNA擴增技術(shù)(例如，RT-PCR或NASBA或本領(lǐng)域已知的等同技術(shù))進行擴增。a.將磁鐵降低。b.將40 μ I不含核酸酶的水分配至非加熱的磁力分離槽，將所有內(nèi)容物泵送至加熱的磁力分離槽，并輕輕抖動以重懸浮所述磁珠。c.打開加熱器至42° C保持5分鐘。活的隱孢子蟲(Crypto)將開始表達編碼熱激蛋白的RNA。細胞裂解和純化
所有試劑均為商業(yè)購買自Qiagen公司。將容積調(diào)節(jié)為用于CARD上的自動化操作。a.將100 μ I Qiagen公司的細胞裂解緩沖液RLT分配至細胞裂解緩沖液槽，并將其泵送至樣品輸入槽，抖動搖晃6次。然后，將加熱器溫度升高至60° C并孵化10分鐘。10分鐘期間抖動兩次，到5分鐘時抖動一次，然后是恰好到10分鐘之前抖動一次。b.將100 μ I乙醇分配至乙醇槽，將其泵送至樣品輸入槽并抖動6次。c.將樣品輸入槽的全部內(nèi)容物泵送至二氧化硅過濾膜的頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過所述過濾膜，將其泵送至廢料槽。通過打開連接至真空端口的閥門并提供30秒的真空抽吸空氣穿過所述過濾膜。d.將100 μ I乙醇分配至乙醇槽，并將其泵送至二氧化硅過濾膜的頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過所述過濾膜，將其泵送至廢料槽。通過打開連接至真空端口的閥門并提供30秒的真空抽吸空氣穿過所述過濾膜。e.將100 μ I緩沖液2分配至緩沖液2槽，并將其泵送至二氧化硅過濾膜的頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過所述過濾膜，將其泵送至廢料槽。通過打開連接至真空端口的閥門并提供30秒的真空抽吸空氣穿過所述過濾膜。f.將100 μ I緩沖液3分配至緩沖液3槽，并將其泵送至二氧化硅過濾膜的頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過所述過濾膜，將其泵送至廢料槽。通過打開連接至真空端口的閥門并提供30秒的真空抽吸空氣穿過所述過濾膜，并重復一次。g.將100 μ I乙醇分配至乙醇槽，并將其泵送至二氧化硅過濾膜的頂部，然后抽吸所述內(nèi)容物穿過所述過濾膜，將其泵送至廢料槽。通過打開連接至真空端口的閥門并提供30秒的真空抽吸空氣穿過所述過濾膜。h.將40 μ I不含核酸酶的水分配至非加熱的磁力分離槽，將所有內(nèi)容物泵送穿過二氧化硅過濾膜的底部并孵化2分鐘，然后將所有內(nèi)容物泵送回到所述非加熱的磁力分離槽。mRNA 分離所有試劑均為商業(yè)購買自Dynal，將容積調(diào)整為用于CARD上的自動化操作。a.先將100 μ I結(jié)合緩沖液、再將20 μ I磁珠分配至非加熱的磁力分離槽，然后將結(jié)合緩沖液泵送至所述非加熱的磁力分離槽。在輕輕抖動下孵化5分鐘。b.提升非加熱的磁力分離槽下的磁鐵，并將槽中的內(nèi)容物泵送至廢料槽。c.將100μ I洗滌緩沖液A分配至洗滌緩沖液A槽，并將其泵送至非加熱的磁力分離槽。將磁鐵降低并在輕輕抖動下重懸浮磁珠。
d.提升非加熱的磁力分離槽下的磁鐵，并將槽中的內(nèi)容物泵送至廢料槽。e.再次重復步驟c和步驟d。f.將100 μ I洗滌緩沖液B分配至洗滌緩沖液B槽，并將其泵送至所述非加熱的磁力分離槽。將磁鐵降低并在輕輕抖動下重懸浮所述磁珠。g.提升非加熱的磁力分離槽下的磁鐵，并將槽中的內(nèi)容物泵送至廢料槽。h.再次重復步驟f和步驟g。i.當所述非加熱的磁力分離槽被排空(除磁珠以外)，往回泵送空氣至洗滌緩沖液B槽以清潔通道和薄膜的任何殘留流體。NASBA 擴增
a.降低非加熱的磁力分離槽下的磁鐵。b.將30 μ I NASBA預混合液分配至擴增預混合液槽，并將其泵送至非加熱的磁力分離槽。抖動非加熱的磁力分離槽中的內(nèi)容物以重懸浮所述磁珠。c.將非加熱的磁力分離槽中的內(nèi)容物泵送回擴增預混合液槽。d.將多功能加熱器溫度升高至41° C。e.抽吸擴增預混合液槽中的內(nèi)容物穿過擴增反應(yīng)器，并泵送其少量至廢料槽。該過程完全以流體加注擴增反應(yīng)器(無氣泡)。f.將擴增反應(yīng)器的內(nèi)容物于41° C孵化90分鐘。橫向流動分析a.將20 μ I雜交緩沖液分配至雜交緩沖液槽，并泵送最初其中的4 μ I部分至廢料以清潔通道和薄膜。b.將4 μ I雜交緩沖液泵送至加熱的分析槽。c.從擴增反應(yīng)器中泵送最初其中的14μ I容積至廢料以清潔通道和薄膜。d.然后從擴增反應(yīng)器中泵送2μ I至加熱的分析槽，再從雜交緩沖液槽中泵送6μ I至加熱的分析槽。e.將4μ I標記物(此處為用與所述擴增物同源的寡核苷酸標記的脂質(zhì)體，加入在橫向流動分析的終點時可見的標記物)分配至加熱的分析槽。在輕度振蕩下于41° C孵化5分鐘。f.將8μ I加熱的分析槽中內(nèi)容物泵送至分析槽中的橫向流動條。g.在來自加熱的分析槽的最初8 μ I容積或溶液被泵送至橫向流動條后，同時將
35μ I流動的緩沖液分配至流動的緩沖液槽，并將其泵送至橫向流動條。h.標記的脂質(zhì)體如果與擴增物進行了雜交，將被另一條附連至橫向流動測試條是互補寡核苷酸捕獲，而脂質(zhì)體內(nèi)部所含的染料在該相同位點上可以看見。圖像分析a.將照相機置于分析膜上方并記錄圖像。b.將圖像發(fā)送至控制系統(tǒng)進行處理。c.報告結(jié)果。圖44顯示了基于CARD測定獲得的結(jié)果。測定了來自隱孢子蟲的熱激mRNA。MS=免疫磁力分離。HS=熱激。本文引用的所有參考文獻，包括出版物、專利申請和專利均以參考形式并入本文中，如同各參考文獻獨立地和特別地表明其如前文所述以參考方式全文并入本文中。所用術(shù)語“一”、“一個”和“所述”以及本發(fā)明上下文中提到的類似指示(特別是在所附權(quán)利要求書上下文中)將解釋為涵蓋單數(shù)和復數(shù)，除非本文另有說明或明顯與上下文抵觸。術(shù)語“包含”、“具有”、“包括”、“含有”均解釋為開放式術(shù)語(即，意思為“包括但不限于”)，除非另有說明。術(shù)語“連接的”解釋為部分或全部地容納于其中、連接至或連接在一起，甚至是中間有某種東西。本文描述的范圍值僅旨在作為速記方法來單獨地提到落入該范圍中的每個數(shù)值，除非另有說明，每個單獨的數(shù)值被并入至本申請文件中，如同其在本文中單獨提到。本文描述的所有方法均可以任何合適的順序?qū)嵤?，除非另有說明或明顯與上下文抵觸。本文所用的任何和所有實施例或示例性語言(例如，“如”)僅旨在更好地說明本發(fā)明實施方案，而非限制本發(fā)明的保護范圍，除非另有聲明。
本申請文件中沒有語言應(yīng)被解釋為表示作為實施本發(fā)明關(guān)鍵的不要求保護的要素。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神和保護范圍的情況下，顯然可以對本發(fā)明做出各種修改和變化。無意將本發(fā)明限制于特定形式或已公開的形式，但相反，其旨在涵蓋所有落入所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明精神和保護范圍內(nèi)的修改、替代性構(gòu)造和等效物。因此，本發(fā)明旨在涵蓋本發(fā)明提供的落入所附權(quán)利要求書和其等效物范圍內(nèi)的修改和變化。
權(quán)利要求
1.獨立式生物檢測裝置，包括 機殼; 設(shè)置于所述機殼中的液分平臺，其包括可控-活動試劑分配系統(tǒng)； 設(shè)置于所述機殼中的試劑供給部件； 氣分平臺，其可拆卸地設(shè)置于機殼中與液分平臺共用的空間內(nèi)，可拆卸地連接至流體傳輸層和多個槽，其中待引入的所述流體傳輸層、所述槽和測試樣品設(shè)置于所述機殼中與液分平臺分開的空間內(nèi)； 氣動供給系統(tǒng)，其在機殼中與液分平臺分開的空間內(nèi)可拆卸地連接至氣分平臺；以及 設(shè)置于所述機殼中的控制系統(tǒng)，其連接至至少一個所述液分平臺和所述氣動供給系統(tǒng)； 其中所述裝置的特征在于，其為獨立式全自動生物檢測裝置。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其中所述液分平臺還包括 移動控制系統(tǒng)，其可操作地連接至所述試劑分配系統(tǒng)，其中所述試劑分配系統(tǒng)包括具有終端分配頭的試劑分配部件；以及 連接至試劑分配系統(tǒng)的照相機，其視場至少包括槽內(nèi)目標物的選定區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其中所述試劑分配部件為具有長度L和選定內(nèi)徑的長針結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述試劑分配系統(tǒng)還包括流體連接至所述試劑分配部件的試劑存儲結(jié)構(gòu)；其中所述試劑存儲結(jié)構(gòu)具有選定的尺寸，所述尺寸可操作地與選定的內(nèi)徑匹配。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其中所述試劑存儲結(jié)構(gòu)為一段管子的長度。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其中所述試劑分配部件為多個分別具有不同的選定內(nèi)徑、長度為L的長針結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其中所述試劑分配系統(tǒng)還包括多個試劑存儲結(jié)構(gòu)，所述試劑存儲結(jié)構(gòu)分別流體連接至所述多個試劑分配部件；其中各試劑存儲結(jié)構(gòu)具有選定的尺寸，所述尺寸可操作地與各自選定的內(nèi)徑匹配。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其中各試劑存儲結(jié)構(gòu)為一段管子的長度。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，僅具有兩個試劑存儲結(jié)構(gòu)，所述試劑存儲結(jié)構(gòu)分別流體連接至兩個試劑分配部件；其中一個試劑分配部件具有內(nèi)徑b1;0. 003 ^ b! ^ O. 018英寸，另一個試劑分配部件具有內(nèi)徑b2，0. 015 < b2 < O. 030英寸。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其中所述氣分平臺與具有至少一種檢測能力的微流體系統(tǒng)連接。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的裝置，其中所述微流體系統(tǒng)還包括多層式、一體化、聚合材料的、非彈性微流體部件，所述微流體部件具有包括多個氣動薄膜微特征的給定配置。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，其中所述氣分平臺下側(cè)具有多個僅氣動的端口，且設(shè)置于所述氣分平臺中的多個僅氣動的通道流體連接至在流體傳輸層的多個閥門和所述多個僅氣動的端口 ；其中所述多個氣動端口具有固定配置，且所述多個僅氣動的通道具有給定配置，其特定地匹配于在流體傳輸層的多個氣動薄膜的給定配置。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述氣動供給系統(tǒng)還包括讓氣動信號從其中通過的多個口管，其流體連接至所述多個僅氣動的端口 ；其中所述多個口管具有固定配置，其特定地匹配于所述氣分平臺的多個僅氣動的端口的固定配置并可拆卸地連接至所述氣分T D O
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，其中各多層式、一體化微流體部件還包括 聚合的、非彈性基板，其中設(shè)置有多個流體通道，各所述流體通道具有入口端和出口端; 至少一個試劑槽，其能夠容納試劑材料； 至少一個雙向薄膜泵，包括至少三個基于非彈性膜的薄膜閥結(jié)構(gòu)；以及 閥門，其設(shè)置為流體連接至至少一個試劑槽和至少一個入口端， 其中所述閥門適于可控地引導材料從至少一個試劑槽經(jīng)由至少一個連接至所述閥門的所述通道流向多個槽， 進一步地，其中各多層式、一體化微流體部件由非彈性聚合材料構(gòu)成。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其中各基板還包括多個分析槽，各分析槽內(nèi)設(shè)置有分析系統(tǒng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述分析系統(tǒng)為下述之一比色的、熒光比色的、化學發(fā)光的、電化學的、電泳的、橫流的、蛋白質(zhì)微陣列、核酸微陣列、熒光的分析系統(tǒng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，還包括具有多個周邊含凹口的緊固環(huán)結(jié)構(gòu)，其中所述分析膜可操作地置于所述緊固環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述槽具有至少部分的內(nèi)周框架，所述分析膜設(shè)置于該框架上。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述緊固環(huán)結(jié)構(gòu)包括兩個各自具有多個周邊含凹口的相對的環(huán)結(jié)構(gòu)，進一步地，其中所述分析膜設(shè)置于所述兩個相對的環(huán)結(jié)構(gòu)中間。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，還包括加熱器。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，其中所述加熱器設(shè)置在可加熱、可磁吸接合的槽附近加熱。
22.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，還包括 流管安裝層，其附連于包括多個流管的所述基板的底面，各流管具有流體連接至分別的流體通道的近端和從基板上垂直向下伸出的遠端；以及 分別的多個擴增/反應(yīng)室，在其頂部區(qū)域附連有所述管安裝層從而各管的遠端設(shè)置為基本上靠近其底部區(qū)域。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的裝置，還包括加熱器，其用于升高各擴增/反應(yīng)室的溫度。
24.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，還包括可操作地設(shè)置于槽或通道下的磁性組件，其中所述磁性組件還包括磁鐵、磁鐵支架、活塞桿和氣動活塞組件(或者，所述活塞組件可為電機或電磁啟動的)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的裝置，還包括可操作地連接至所述磁性組件的加熱器組件。
26.用于分離、擴增和分析可能存在于流體測試樣品中的靶核酸序列的自動化方法，包括 提供操作微流體系統(tǒng)的氣分平臺，所述微流體系統(tǒng)中設(shè)置有流體傳輸層和流體通道，以及與所述氣分平臺連接的槽； 將所述流體測試樣品引入至所述流體通道； 從流體連接至流體傳輸層的至少一個分立的槽向所述通道提供至少一種試劑； 在流體傳輸層、槽或擴增反應(yīng)器的區(qū)域內(nèi)混合所述流體測試樣品和所述至少一種試劑； 將所述流體測試樣品輸送至可操作地連通至流體傳輸層的溫控擴增/反應(yīng)反應(yīng)器；在足以使靶核酸序列得以擴增的條件下，于所述擴增/反應(yīng)反應(yīng)器中孵化所述流體測試樣品； 將所述流體測試樣品輸送至分析槽；以及 分析來自測試樣品的擴增的靶核酸序列， 其中所述測試樣品從流體傳輸層中的起始位置被輸送至分析槽，與任何其他樣品和所述氣分平臺及分配系統(tǒng)相隔離。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的自動化方法，其中所述輸送和混合步驟通過經(jīng)由至少一個由所述氣分平臺操作的多薄膜閥的泵來泵送所述流體測試樣品和一定量至少一種試劑通過所述流體傳輸層來完成。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的自動化方法，其中所述分析步驟還包括在微流體系統(tǒng)中的微陣列分析槽內(nèi)進行微陣列分析。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的自動化方法，還包括在微陣列分析槽內(nèi)提供微陣列分析膜；使流體在微陣列分析膜表面上流動；沿著微陣列分析膜外圍通過流體出口路線基本上去除所述流體。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的自動化方法，還包括在微陣列分析槽內(nèi)提供微陣列分析膜；使流體在微陣列分析膜表面上向后和向前交替流動。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的自動化方法，還包括向微陣列分析膜提供熱量。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的自動化方法，其中所述靶核酸序列與目標疾病或病癥、傳染因子、病原體、癌癥易患傾向，或?qū)δ繕怂幬?、藥物組合物、化學制品或化合物的敏感傾向相關(guān)。
33.根據(jù)權(quán)利要求26所述的自動化方法，其中所述靶核酸序列包括SNP。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的自動化方法，其中所述疾病或病癥為HPV或敗血癥。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的自動化方法，其中所述靶核酸序列與華法林敏感傾向或?qū)θA法林治療反應(yīng)的抗凝傾向相關(guān)。
36.根據(jù)權(quán)利要求26所述的自動化方法，其中所述分析步驟包括測定所述擴增的靶核酸序列和靶核酸序列探針之間的相互作用。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的自動化方法，其中所述分析步驟包括測定下列情形的存在或傾向 所述目標疾病或病癥， 所述傳染因子， 所述病原體， 癌癥，或 對所述目標藥物、藥物組合物、化學制品或化合物敏感。
38.根據(jù)權(quán)利要求26所述的自動化方法，其中所述分析步驟包括測定擴增的靶核酸序列的量或水平，其中所述方法還包括將所述靶核酸序列的量或水平與預選的量或水平進行比較。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述量或水平與預選的量或水平的差異表示有下列情形存在或傾向 目標疾病或病癥， 傳染因子， 病原體， 癌癥，或 對目標藥物、藥物組合物、化學制品或化合物敏感。
全文摘要
本發(fā)明提供獨立式全自動生物檢測裝置，包括機殼；設(shè)置于所述機殼中的液分平臺，其包括可控-活動試劑分配系統(tǒng)；設(shè)置于所述機殼中的試劑供給部件；氣分平臺，其可拆卸地設(shè)置于機殼中與液分平臺共用的空間內(nèi)，可拆卸地連接至流體傳輸層和多個槽，其中待引入的所述流體傳輸層、所述槽和測試樣品設(shè)置于所述機殼中與液分平臺分開的空間內(nèi)；氣動供給系統(tǒng)，其在機殼中與液分平臺分開的空間內(nèi)可拆卸地連接至氣分平臺；以及設(shè)置于所述機殼中的控制系統(tǒng)，其連接至至少一個所述液分平臺和所述氣動供給系統(tǒng)。
文檔編號G01N33/50GK102906573SQ201180020381
公開日2013年1月30日 申請日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者周朋, 林肯·楊, 本杰明·湯馬斯, 陳宗院, 格雷戈·穆奇卡, 陶德·羅斯維奇, 格溫多琳·斯碧茨, 若碧娜·婭斯敏 申請人:瑞昂尼克公司