專利名稱：電化學(xué)免疫傳感器制備方法及其用于豬鏈球菌的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電化學(xué)免疫傳感器，尤其涉及一種電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及其用于豬鏈球菌2型抗原的檢測方法。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌(S.suis)是一種重要的人畜共患病原菌，表現(xiàn)為急性出血性敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、哺乳仔豬下痢和孕豬流產(chǎn)等。豬鏈球菌感染不僅可致豬敗血癥肺炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及心內(nèi)膜炎，而且可感染特定人群發(fā)病，并致死亡，危害非常嚴(yán)重。豬鏈球菌病原體早已長期存在于豬群身上，因?yàn)橥饨绛h(huán)境發(fā)生的變化使得該病原體發(fā)生變異，從而突破種群障礙，通過傷口、消化道等途徑傳染給人。根據(jù)莢膜多糖(CPS)抗原成分不同，可以將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型(1-34型和1/2型)。其中，豬鏈球菌2型(SS2)為最常見，也是毒力最強(qiáng)的血清型。豬鏈球菌是一種條件致病性病原菌，成年豬感染后一般不表現(xiàn)任何臨床癥狀，但是，受到應(yīng)激因素的刺激，往往會加劇發(fā)病率和死亡率。血清學(xué)調(diào)查或抗體水平監(jiān)測有助于了解豬群中鏈球菌感染狀況，為控制豬鏈球菌病提供科學(xué)的依據(jù)。電化學(xué)免疫分析將分析化學(xué)與臨床診斷相結(jié)合，利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性親合作用建立了新型免疫分析技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于臨床各領(lǐng)域，是診斷疾病、療效觀察和醫(yī)學(xué)科研的重要途徑。然而，在臨床檢測中，通常對單個(gè)樣品的檢測成本較高，而批量的檢測又會耽誤病人的診斷時(shí)間，尤其對于心血管類急性疾病，快速準(zhǔn)確的檢測尤為重要。因此，基于對衡量標(biāo)志物定量測定的要求，具有較高的靈敏度和短的響應(yīng)時(shí)間的電流型免疫傳感器逐漸成為人們關(guān)注的課題。目前，用于豬鏈球菌2型檢測的方法有ELISA、PCR、酶聯(lián)免疫法、免疫色譜法及瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等，但這些方法檢測時(shí)間長，成本高，只適用于實(shí)驗(yàn)室診斷，不適合大量樣品的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，該電化學(xué)免疫傳感器能夠快速檢測豬鏈球菌2型抗原。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌2型的檢測方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于:用納米金修飾玻碳電極，然后用緩沖溶液洗滌后晾干，將豬鏈球菌2型抗體I滴涂于所述玻碳電極表面，4 °C過夜，再將所述玻碳電極在牛血清白蛋白(BSA)溶液中浸泡即得電化學(xué)免疫傳感器。上述玻碳電極用納米金修飾前依次經(jīng)1.0，0.3和0.05 Mm的Al2O3糊拋光后用蒸餾水沖洗干凈，再分別在蒸餾水、丙酮、蒸餾水中超聲洗滌、晾干。上述豬鏈球菌2型抗體I的濃度為70 ug/mL，用量為10 uL。
上述牛血清白蛋白(BSA)溶液的濃度為0.25 wt.%。上述修飾電極在牛血清白蛋白(BSA)溶液中浸泡時(shí)間為2 h。本發(fā)明的另一個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，上述電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌2型的檢測方法，其特征在于，
1)合成羧基二茂鐵納米球(nFc)；
2)制備羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯(nFc/Gr)；
3)制備生物耦合物；
4)將上述電化學(xué)免疫傳感器浸泡在待測豬鏈球菌2型樣品中孵育40min，再將制備好的生物稱合物滴涂于其玻碳電極表面，I h后洗去未結(jié)合的生物稱合物，在pH= 6.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入2 mm抗壞血酸作為測試底液，用示差脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行檢測，其峰電流的大小與濃度有關(guān)，從而可求得待測樣品中的豬鏈球菌2型抗原的濃度。上述合成羧基二茂鐵納米球(nFc)為取0.1 g羧基二茂鐵粉末溶于25 mL無水乙醇中，再在超聲條件下以30 mL/min速度加入125 mL去離子水，然后在超聲條件下放置25 min,最后用去離子水洗漆、干燥。上述制備羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯(nFc/Gr)為先將5 mg石墨烯分散在5mL聚醚酰亞胺(PEI)溶液中，在135 0C下回流3 h，用去離子水離心洗滌兩次，然后將其分散在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，再用摩爾比為4:1的1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)活化羧基二茂鐵納米球(nFc)表面的羧基，然后洗滌三次以分離多余的EDC/NHS，再將已活化的羧基二茂鐵納米球(nFc)納米球與PEI功能化石墨烯(PE1-Graphene)溶液在室溫下混合,攪拌4 h,經(jīng)去離子水離心洗漆分離得羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯的復(fù)合物(nFc/Gr)，將其分散在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。上述制備生物耦合物為先將500 ng/mL的豬鏈球菌2型抗體2 (Ab2 )500 ML加入上述羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯的復(fù)合物(nFc/Gr)中,冰浴攪拌12 h,離心分離,再加入過量的牛血清白蛋白(BSA)溶液，冰浴攪拌5 h，離心分離制得Ab2-nFc/Gr生物耦合物。本發(fā)明具有如下有益效果:
1、本發(fā)明電化學(xué)免疫傳感器制備方法簡單，制備成本低，制備的電化學(xué)免疫傳感器結(jié)構(gòu)簡單，使用方便。2、本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌2型的檢測方法簡便易行，靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間短且檢測成本低，實(shí)現(xiàn)了臨床對豬鏈球菌2型個(gè)體抗原的快速檢測。3、本發(fā)明電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌2型的檢測結(jié)果與采酶聯(lián)免疫法的檢測結(jié)果一致，樣品回收率接近100%，證明本發(fā)明的檢測結(jié)果是準(zhǔn)確的、可靠的。4、本發(fā)明為心血管疾病的診治創(chuàng)造了重要條件。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例豬鏈球菌2型濃度(Concentration of SS2)與電流(Current)響應(yīng)線性圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例，電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，先將玻碳電極用納米金修飾前依次經(jīng)
1.0Mm、0.3Mm和0.05 Mm的Al2O3糊拋光后用蒸餾水沖洗干凈，再分別在蒸餾水、丙酮、蒸餾水中超聲洗滌、晾干；然后用納米金修飾玻碳電極，再用緩沖溶液PBS洗滌后晾干，將10 uL濃度為70 ug/mL的豬鏈球菌2型抗體I滴涂于修飾后的玻碳電極表面，4 °C過夜，再在濃度為0.25 wt.%的牛血清白蛋白(BSA)溶液中浸泡2 h即得電化學(xué)免疫傳感器。本實(shí)施例電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌2型的檢測方法如下:
I)合成羧基二茂鐵納米球(nFc)。取0.1 g羧基二茂鐵粉末溶于25 mL無水乙醇中，再在超聲條件下以30 mL/min速度加入125 mL去離子水,然后在超聲條件下放置25 min,最后用去離子水洗滌、干燥。2)制備羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯(nFc/Gr)。先將5 mg石墨烯分散在5 mL聚醚酰亞胺(PEI)溶液中，在135 V下回流3 h，用去離子水離心洗滌兩次，然后將其分散在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，再用摩爾比為4:1的EDC/NHS活化羧基二茂鐵納米球(nFc)表面的羧基，然后洗滌三次以分離多余的EDC/NHS，再將已活化的羧基二茂鐵納米球(nFc)納米球與PEI功能化石 墨烯(PE1-Graphene)溶液在室溫下混合,攪拌4 h,經(jīng)去離子水離心洗滌分離得羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯的復(fù)合物(nFc/Gr)，將其分散在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。3)制備生物耦合物。先將500 ng/mL的豬鏈球菌2型抗體2 (Ab2) 500 ML加入上述羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯的復(fù)合物(nFc/Gr)中,冰浴攪拌12 h,離心分離,再加入過量的牛血清白蛋白(BSA)溶液，冰浴攪拌5 h，離心分離制得Ab2-nFc/Gr生物耦合物。4)將電化學(xué)免疫傳感器分別浸泡在待測樣品1、樣品I1、樣品III中孵育40 min,再將制備好的生物耦合物滴涂于其玻碳電極表面，I h后洗去未結(jié)合的生物耦合物，在pH=
6.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入2 mm抗壞血酸作為測試底液，用示差脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行檢測，根據(jù)圖1求得豬鏈球菌2型抗原的濃度，檢測結(jié)果見下表I。
為了驗(yàn)證本發(fā)明電化學(xué)免疫傳感器檢測豬鏈球菌2型的準(zhǔn)確性，將樣品1、樣品I1、樣品III采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見下表I。表I 本實(shí)施例三種樣品中豬鏈球菌2型抗原的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于:用納米金修飾玻碳電極，然后用緩沖溶液洗滌后晾干，將豬鏈球菌2型抗體I滴涂于所述玻碳電極表面，4 °C過夜，再將所述玻碳電極在牛血清白蛋白溶液中浸泡即得電化學(xué)免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于:所述玻碳電極用納米金修飾之前依次經(jīng)1.0Mm、0.3Mm和0.05 Mm的Al2O3糊拋光后用蒸懼水沖洗干凈,再分別在蒸餾水、丙酮、蒸餾水中超聲洗滌、晾干。
3.如權(quán)利要求1或2所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于:所述豬鏈球菌2型抗體I的濃度為70 ug/mL，用量為10 uL。
4.如權(quán)利要求3所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于:所述牛血清白蛋白溶液的濃度為0.25 wt.%。
5.如權(quán)利要求4所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于:所述修飾電極在牛血清白蛋白溶液中浸泡時(shí)間為2h。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌的檢測方法，其特征在于: 1)合成羧基二茂鐵納米球； 2)制備羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯； 3)制備生物耦合物； 4)將所述電化學(xué)免疫傳感器浸泡在待測豬鏈球菌2型樣品中孵育40min，再將制備好的生物稱合物滴涂于其玻碳電極表面，I h后洗去未結(jié)合的生物稱合物，在pH= 6.5的磷酸鹽緩沖液中加入2 mm抗壞血酸作為測試底液，用示差脈沖伏安法進(jìn)行檢測。
7.如權(quán)利要求6所述的電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌的檢測方法，其特征在于:所述合成羧基二茂鐵納米球?yàn)槿?.1 g羧基二茂鐵粉末溶于25 mL無水乙醇中，再在超聲條件下以30 mL/min速度加入125 mL去離子水,然后在超聲條件下放置25 min,最后用去離子水洗滌、干燥。
8.如權(quán)利要求6或7所述的電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌的檢測方法，其特征在于:所述制備羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯為先將5 mg石墨烯分散在5 mL聚醚酰亞胺溶液中，在135 V下回流3 h，用去離子水離心洗滌兩次，然后將其分散在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，再用摩爾比為4:1的1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺活化羧基二茂鐵納米球表面的羧基，然后洗滌三次以分離多余的EDC/NHS，再將已活化的羧基二茂鐵納米球與聚醚酰亞胺功能化石墨烯溶液在室溫下混合，攪拌4 h，經(jīng)去離子水離心洗滌分離得羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯的復(fù)合物，將其分散在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中。
9.如權(quán)利要求6或7所述的電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌的檢測方法，其特征在于:所述制備生物耦合物為先將500 ng/mL的豬鏈球菌2型抗體2用量為500 ML加入所述羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯的復(fù)合物中，冰浴攪拌12 h，離心分離，再加入過量的牛血清白蛋白溶液，冰浴攪拌5 h，離心分離制得生物耦合物。
10.如權(quán)利要求8所述的電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌的檢測方法，所述制備生物耦合物為先將500 ng/mL的豬鏈球菌2型抗體2用量為500 ML加入所述羧基二茂鐵納米球功能化石墨烯的復(fù)合物中，冰浴攪拌12 h，離心分離，再加入過量的牛血清白蛋白溶液，冰浴攪拌5 h，離心分離制 得生物耦合物。
全文摘要
電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于用納米金修飾玻碳電極，然后用緩沖溶液洗滌后晾干，將豬鏈球菌2型抗體1滴涂于所述玻碳電極表面，4℃過夜，再將所述玻碳電極在牛血清白蛋白溶液中浸泡即得電化學(xué)免疫傳感器。本發(fā)明電化學(xué)免疫傳感器制備方法簡單，使用方便，用于豬鏈球菌2型的檢測方法簡便易行，靈敏度高，響應(yīng)時(shí)間短且檢測成本低，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為心血管疾病的診治創(chuàng)造了重要條件。
文檔編號G01N27/26GK103207218SQ20121000726
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者蘇會嵐, 袁若 申請人:西南大學(xué)