專利名稱：一種瓊脂擴散法檢測鴨黃病毒抗體的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用一種瓊脂擴散法檢測鴨黃病毒抗體的方法，屬于動物傳染病和免疫學領域。
背景技術(shù)：
自2010年以來在華東地區(qū)首次發(fā)生鴨黃病毒感染蛋鴨引發(fā)的鴨產(chǎn)蛋下降-死亡綜合癥的流行，并迅速傳播到浙江、安徽、福建、江蘇等省份的主要養(yǎng)殖場，之后傳播到廣東、山東、河南、河北等省市，到目前為止全國大部分主要水禽養(yǎng)殖地區(qū)均已受到該病的威脅。鴨子感染該病毒后，主要的臨床表現(xiàn)為病鴨出現(xiàn)高熱、沉郁、厭食等；蛋鴨出現(xiàn)產(chǎn)蛋量急劇下降甚至停產(chǎn)；肉鴨出現(xiàn)生長遲緩。該病的發(fā)病率高達100%，死亡率在59TlO%之間。該病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬的坦布蘇病毒。·
該病在我國屬于首次報道，其病原的生物學特性，分子流行病學和分子致病機理等方面的研究均剛剛起步，而該病近年來在我國水禽養(yǎng)殖區(qū)域的廣泛流行以及其造成的巨大經(jīng)濟損失，現(xiàn)有研究進展亟須不斷深入推進，針對養(yǎng)殖場及基層獸醫(yī)檢疫部門技術(shù)欠缺，設備簡單的現(xiàn)狀，創(chuàng)建一種簡便有效的檢測其抗體的方法十分必要且緊迫。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種瓊擴法檢測鴨黃病毒抗體的方法。本發(fā)明的鴨黃病毒為鴨黃病毒，由安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室分離。該病毒株已于2012年4月18日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國，武漢，武漢大學；其保藏名稱為鴨黃病毒AH-FlO株，保藏編號為CCTCC NO: V201213。瓊脂擴散法檢測鴨黃病毒抗體的方法的步驟如下(I)無菌采集感染鴨黃病毒的病鴨卵巢病變組織，將其研磨勻漿后反復凍融三次，12000r/min離心IOmin ;無菌條件下取其上清液,將上清液經(jīng)O. 22um微孔濾膜過濾除菌后接種10日齡SPF (即無特定病原體)雞胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育，棄去24小時內(nèi)接種死亡的雞胚,收獲48小時至120小時內(nèi)死亡雞胚尿囊液，連續(xù)傳至5代，收獲病毒尿囊液；將第5代黃病毒尿囊液經(jīng)3%。甲醛混合搖勻，于37°C搖床內(nèi)滅活36小時，得到鴨黃病毒瓊擴抗原；(2)用pH值為7. 2，濃度為1/15M的PBS緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，制備瓊擴平板，瓊脂糖凝膠厚度在4. 8mm 5. 2mm之間,用七孔梅花打孔器打孔；將制備的瓊擴抗原加入中間孔，其加入量為每孔25微升；將待檢測的瓊擴抗體按2倍稀釋后的濃度依次加入周圍六孔，即加入六孔的瓊擴抗體的濃度分別是原瓊擴抗體濃度的2—1，2_2，2_3，2_4，2_5，2_6 ;將瓊擴平板于37°C濕盒中反應15小時后觀察，讀取瓊擴效價。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在本發(fā)明建立了瓊擴方法檢驗抗體的效價，檢驗結(jié)果重復性好，快速準確。確定了瓊脂糖凝膠緩沖液的較好的類型及濃度。


圖I是鴨血清抗體效價為I : 4時的瓊擴結(jié)果圖2是鴨血清抗體效價為I : 16時的瓊擴結(jié)果
具體實施例方式以下通過具體實施例對本 發(fā)明技術(shù)方案做進一步解釋說明。實施例I從安徽區(qū)域感染鴨黃病毒的病鴨中無菌條件下采集其卵巢等病變組織，將其研磨勻衆(zhòng)后反復凍融三次，12000r/min離心lOmin。無菌條件下取其上清液,將上清液經(jīng)O. 22um微孔濾膜過濾除菌后接種10日齡SPF雞胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育，棄去24小時內(nèi)接種死亡的雞胚,收獲48小時至120小時內(nèi)死亡雞胚的尿囊液，將收獲的一代病毒尿囊液接種10日齡SPF雞胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育。收獲48小時至120小時內(nèi)死亡雞胚的尿囊液，獲取第二代病毒尿囊液，如此連續(xù)傳至5代，收獲尿囊液備用。在收獲的第5代病毒尿囊液中按體積比加入3%。甲醛于37°C搖床滅活36小時，滅活完成后，按滅活病毒液96份，吐溫-804份搖勻，即為制苗用抗原做為下步乳化的水相；白油佐劑做為下步乳化油相。按體積比油相3份、水相I份的比例取油相、水相攪拌乳化，制備成鴨黃病毒滅活油乳劑疫苗，并加入1%硫柳汞溶液使之終濃度為萬分之一，搖勻備用。瓊擴最適條件的確定使用制備的鴨黃病毒滅活疫苗胸部肌肉注射免疫產(chǎn)蛋蛋鴨，免疫劑量為ImL/只，三周后同樣途徑及方法進行第二次免疫，第二次免疫兩周后對蛋鴨采血，提取血清，作為瓊擴抗體。將第5代黃病毒尿囊液經(jīng)3%。甲醛混合搖勻，于37°C搖床內(nèi)滅活36小時，制備鴨黃病毒瓊擴抗原。選用PBS緩沖液(即含O. 05%吐溫一 20的ρΗ7· 4的磷酸鹽緩沖液)，PB緩沖液(PB緩沖液的配制取 19ml O. 2mol/L 的 NaH2P04 和 81ml O. 2mol/L 的 Na2HP04 · 12H20,充分混合即為O. 2mol/L的PB緩沖液。)及質(zhì)量濃度O. 85%的生理鹽水三種緩沖液，在不同pH值的條件下；PB及PBS緩沖液的不同濃度，同份抗體的瓊擴效價比較，篩選反應較好的緩沖液及pH值,結(jié)果見表一表一
緩沖液配置的溶液PH__PB和PBS的濃度
瓊脂糖凝膠 6 8 I U 7.2 7.4 1/15M 1/10M I/ -jM
0.85%生理鹽水 1:8 1:8 1:16 1:8---
PBS 緩沖液 1:16 1:16 1:32 1:16 1:32 1:16 1:16
PB 緩沖液 1:81:16 1:8 I Ib I 8 1:8由結(jié)果可知在pH值為7. 2，，濃度為1/15M的PBS緩沖液配制的1%瓊脂糖凝膠具有較好的瓊擴反應效果。實施例2對安徽多家蛋鴨場送檢60份至少連續(xù)免疫兩次的黃病毒滅活疫苗(相鄰兩次免疫時間間隔為15天左右)的鴨血清進行瓊擴法檢驗其抗體。用濃度為1/15M的PBS緩沖液配制的1%瓊脂糖凝膠，制備瓊擴平板，瓊脂糖凝膠厚度在4. 8mm 5. 2mm之間，用七孔梅花打孔器打孔 。將制備的瓊擴抗原加入中間孔，瓊擴抗體按2倍稀釋后的濃度依次加入周圍六孔(瓊擴抗體的濃度分別是2—1，2_2，2_3，2_4，2_5，2_6)。抗原抗體加入量約為每孔25微升。將瓊擴平板于37°C濕盒中反應15小時后觀察，讀取瓊擴效價(如圖I、圖2所示)。瓊擴效價統(tǒng)計見表二 表二
權(quán)利要求
1.一種瓊脂擴散法檢測鴨黃病毒抗體的方法，其特征在于該方法包括如下步驟 (1)無菌采集感染鴨黃病毒的病鴨卵巢病變組織，將其研磨勻漿后反復凍融三次，12000r/min離心IOmin ;無菌條件下取其上清液,將上清液經(jīng)O. 22um微孔濾膜過濾除菌后接種10日齡SPF (即無特定病原體)雞胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育，棄去24小時內(nèi)接種死亡的雞胚,收獲48小時至120小時內(nèi)死亡雞胚尿囊液，連續(xù)傳至5代，收獲病毒尿囊液；將第5代黃病毒尿囊液經(jīng)3%。甲醛混合搖勻，于37°C搖床內(nèi)滅活36小時，得到鴨黃病毒瓊擴抗原； (2)用pH值為7.2，濃度為1/15M的PBS緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，制備瓊擴平板，瓊脂糖凝膠厚度在4. 8mm 5. 2mm之間，用七孔梅花打孔器打孔；將制備的瓊擴抗原加入中間孔，其加入量為每孔25微升；將待檢測的瓊擴抗體按2倍稀釋后的濃度依次加入周圍六孔，即加入六孔的瓊擴抗體的濃度分別是原瓊擴抗體濃度的2—1，2_2，2_3，2_4，2_5，2_6 ;將瓊擴平板于37°C濕盒中反應15小時后觀察，讀取瓊擴效價。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種瓊脂擴散法檢測鴨黃病毒抗體的方法，屬于獸醫(yī)傳染病學和免疫學領域。所檢測的鴨黃病毒為安徽某鴨場分離株，將病料接種SPF雞胚，傳至5代，獲得穩(wěn)定毒株，命名為鴨黃病毒AH-F10株。尿囊液經(jīng)甲醛滅活加入白油佐劑乳化，制備滅活疫苗，連續(xù)兩次免疫產(chǎn)蛋鴨獲取鴨黃病毒陽性血清。該陽性血清與經(jīng)甲醛滅活的鴨黃病毒液進行瓊擴反應，可呈現(xiàn)清晰的沉淀帶。通過不同緩沖液及緩沖液不同濃度對陽性血清瓊擴效價的影響，確定該瓊擴反應最適的緩沖液及緩沖液濃度。該方法可較為簡便的診斷目前我國流行的鴨黃病毒病，做為流行病學調(diào)查的操作簡便，效果明顯，成本低廉的檢測方法。
文檔編號G01N33/559GK102914647SQ20121017172
公開日2013年2月6日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者王桂軍, 王漢清, 張洪輝, 劉雪蘭, 李槿年, 李郁, 魏建忠, 楊德康, 倪欣濤, 李寧 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學