專利名稱：一種快速測(cè)定水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及飲用水源的環(huán)境監(jiān)測(cè)與保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用￠-環(huán)檸檬醛為技術(shù)指標(biāo)快速鑒別水樣中微囊藻的存在和測(cè)定其數(shù)量的方法。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，到20世紀(jì)90年代后期，在我國(guó)已調(diào)查的湖泊中，有88. 6%處于富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。進(jìn)入21世紀(jì)，湖泊富營(yíng)養(yǎng)化呈現(xiàn)高速發(fā)展的態(tài)勢(shì)。目前我國(guó)已經(jīng)發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化的湖泊面積達(dá)5000km2，具備發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化條件的湖泊面積達(dá)到14000km2。由于富營(yíng)養(yǎng)化水體面臨頻繁暴發(fā)淡水藻水華的問題，因此，以富營(yíng)養(yǎng)化水體作為飲用水源，會(huì)對(duì)我國(guó)居民的飲水安全造成嚴(yán)重威脅。

在淡水湖泊富營(yíng)養(yǎng)化引起的水華中，以春夏季微囊藻水華最為常見，如我國(guó)的太湖流域，微囊藻的生物量占藻類總生物量的90%以上；滇池的微囊藻水華常年不消退，水質(zhì)腐敗，藻毒素含量居高不下。隨著水體污染的加劇，越來越多的湖泊、水庫(kù)甚至河流也時(shí)常暴發(fā)水華現(xiàn)象，因此，需要辨別富營(yíng)養(yǎng)化水體的水華是否由微囊藻引起以及確定微囊藻的數(shù)量。目前鑒別微囊藻種類和數(shù)量的常用方法是光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)。前者通過檢測(cè)者直接觀察辨別藻細(xì)胞的種類，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，耗費(fèi)時(shí)間和體力較大，尤其是水樣較多時(shí)；后者測(cè)量精準(zhǔn)，但成本較高，操作繁瑣。因此，需要找到一種簡(jiǎn)便快捷的方法對(duì)引起水華的藻類及其數(shù)量進(jìn)行快速判斷，在第一時(shí)間掌握水華暴發(fā)的數(shù)據(jù)資料，為水環(huán)境的應(yīng)急處理提供基礎(chǔ)?！?-環(huán)朽1 樣醒(2，2，6-trimethyl-l-cyclohexene-l-carbonxaldehyde, ^ -cyclocitral)屬于微囊藻的代謝物，由微囊藻細(xì)胞內(nèi)的￠-胡蘿卜素在胡蘿卜素加氧酶的催化下，被氧氣氧化發(fā)生斷鍵反應(yīng)形成。3 -環(huán)檸檬醛是一種揮發(fā)性有機(jī)物，在不同濃度下(0. 5^80 u g/L)嗅味描述不同，當(dāng)濃度低于I y g/L時(shí)，為新鮮的青草味；當(dāng)濃度為2 10 u g/L時(shí)，為干草味或木頭味；當(dāng)濃度大于IOy g/L時(shí)，為類似煙草的味道。目前普遍認(rèn)為￠-環(huán)檸檬醛具有專屬性，只有微囊藻能產(chǎn)生，因此可以通過檢測(cè)3 -環(huán)檸檬醛的濃度得到微囊藻的細(xì)胞數(shù)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種快速測(cè)定水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，以微囊藻的特有產(chǎn)出物@ -環(huán)檸檬醛為指標(biāo)，利用固相微萃取和氣相質(zhì)譜測(cè)定水中微囊藻的細(xì)胞數(shù)目，該方法在采樣后能快速得到檢測(cè)結(jié)果，無需前處理，方便快捷，成本低廉。—種快速測(cè)定水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，包括如下步驟(I)取若干個(gè)與待測(cè)水樣處于同一水域的測(cè)試水樣，測(cè)量測(cè)試水樣中的￠-環(huán)檸檬醛濃度和微囊藻細(xì)胞數(shù)目，直線線性回歸擬合得到該水域P -環(huán)檸檬醛濃度與微囊藻細(xì)胞數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)取待測(cè)水樣，測(cè)量待測(cè)水樣中的￠-環(huán)檸檬醛濃度，根據(jù)所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)水樣中的微囊藻細(xì)胞數(shù)目。所述的待測(cè)水樣與測(cè)試水樣取于同一時(shí)段內(nèi)所述水域的不同區(qū)域，或不同時(shí)段內(nèi)所述水域的同一區(qū)域，或不同時(shí)段內(nèi)所述水域的不同區(qū)域。測(cè)量測(cè)試水樣中的0 -環(huán)檸檬醛濃度和微囊藻細(xì)胞數(shù)目，通過線性擬合得到該水域@ -環(huán)檸檬醛濃度與微囊藻細(xì)胞數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，適用于該水域不同區(qū)域以及與建立所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的微囊藻處于同一生長(zhǎng)周期的微囊藻細(xì)胞數(shù)目的測(cè)量。由于微囊藻喜溫和陽光，一般聚集在水體表面，因此最好采集水面以下0. 5m處的 水作為樣本，采樣時(shí)也可以為其他水深位置，但同一水域的采樣水深應(yīng)相同。所采集的水樣不少于IOOmL,且采集瓶上方不留空氣，4°C環(huán)境保存，并盡快檢測(cè)，防止保存過程中微囊藻數(shù)目發(fā)生改變和3 -環(huán)檸檬醛的揮發(fā)，影響檢測(cè)結(jié)果。作為優(yōu)選，所述步驟(I)中測(cè)量測(cè)試水樣中￠-環(huán)檸檬醛濃度的方法為利用固相微萃取收集測(cè)試水樣中微囊藻細(xì)胞產(chǎn)生的全部3 -環(huán)檸檬醛，使用氣相質(zhì)譜法測(cè)量￠-環(huán)檸檬醛濃度。固相微萃取利用萃取纖維萃取水樣，進(jìn)行氣相質(zhì)譜檢測(cè)集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，進(jìn)樣空白值小，甚至可以忽略，萃取纖維可以重復(fù)使用50次以上，成本較低。本發(fā)明中如無特殊說明，測(cè)量￠-環(huán)檸檬醛濃度時(shí)用的氣相質(zhì)譜條件為進(jìn)樣口溫度180°C ;柱壓為90kPa ;毛細(xì)管柱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0°C，恒定3min后，以8°C /min的速度升溫至120°C，再以15°C /min的速度升溫至250°C，恒定2min ;與質(zhì)譜接口溫度為2500C ;離子源溫度為200°C ;不分流進(jìn)樣；選擇離子檢測(cè)模式；離子源為EI (電子電離)。作為優(yōu)選，所述的氣相質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)物為2-異丁基-3-甲氧基吡嗪。￠-環(huán)檸檬醛的特征質(zhì)荷比為137和67，2-異丁基-3-甲氧基吡嗪的特征質(zhì)荷比為124和94，以2-異丁基-3-甲氧基吡嗪(IBMP)為內(nèi)標(biāo)，利用氣相質(zhì)譜建立P -環(huán)檸檬醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以保證標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的線性相關(guān)系數(shù)和重復(fù)性。本發(fā)明中如無特殊說明，氣相質(zhì)譜樣品中2-異丁基-3-甲氧基卩比嗪的最終濃度為20ng/L (lng=10_9g)。作為優(yōu)選，在測(cè)試水樣中加入2-異丁基-3-甲氧基吡嗪和氯化鈉后進(jìn)行固相微萃取。在水樣中加入氯化鈉，可以加速微囊藻細(xì)胞的破裂，使微囊藻細(xì)胞內(nèi)的￠-環(huán)檸檬醛全部釋放出來，同時(shí)，氯化鈉還可以提高溶液的極性，促進(jìn)3 -環(huán)檸檬醛和2-異丁基-3-甲氧基吡嗪的揮發(fā)。作為優(yōu)選，所述的測(cè)試水樣與氯化鈉的比例為IOmL 3 4g，即可使測(cè)試水樣中微囊藻細(xì)胞全部破裂，同時(shí)利于萃取。作為優(yōu)選，所述步驟(I)中測(cè)量測(cè)試水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法為顯微鏡計(jì)數(shù)法，利用顯微鏡計(jì)數(shù)法可以直觀快速得到微囊藻細(xì)胞數(shù)目。作為優(yōu)選，所述的顯微鏡計(jì)數(shù)法使用的固定染色試劑為含冰醋酸的盧戈氏試劑。含冰醋酸的盧戈氏試劑中各組分KI、I、冰醋酸以及蒸餾水的比例為2g : Ig : 2mL : 20mLo微囊藻的固定是指在酸性條件下，微囊藻的繁殖受到限制，在后續(xù)靜置及觀察過程中，微囊藻的數(shù)目不會(huì)發(fā)生改變，用冰醋酸調(diào)節(jié)溶液的PH至酸性，即完成了微囊藻的固定。經(jīng)所述含冰醋酸的盧戈氏試劑固定和染色后，可以在顯微鏡下清楚辨別微囊藻細(xì)胞，提高計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。染色完成后，取適量染色后的溶液，置于藻類計(jì)數(shù)框內(nèi)，靜置一段時(shí)間后，用顯微鏡觀測(cè)計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)重復(fù)至少兩次，使得到的微囊藻細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)誤差在可接受的范圍內(nèi)。作為優(yōu)選，所述測(cè)試水樣和待測(cè)水樣中P -環(huán)檸檬醛的濃度的檢測(cè)范圍為10 20000ng/L。若微囊藻液濃度過高導(dǎo)致P -環(huán)檸檬醛濃度超過檢測(cè)范圍，需要用Mi II-Q超純水進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)我國(guó)太湖流域、長(zhǎng)江流域和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的藻種測(cè)定，微囊藻細(xì)胞能產(chǎn)生IOOfg(lfg=10_16g)左右的￠-環(huán)檸檬醛，￠-環(huán)檸檬醛的檢測(cè)限為10ng/L，相應(yīng)微囊藻細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)限為105cell/L，低于暴發(fā)水華時(shí)，水體中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的最小值106cell/L。如果氣相質(zhì)譜無法檢測(cè)到￠-環(huán)檸檬醛，則可以認(rèn)為水華不是由微囊藻引起的。由于不同水域，微囊藻種類會(huì)有所差異，需取若干個(gè)與待測(cè)水樣處于同一水域的測(cè)試水樣，測(cè)量該測(cè)試水樣中的3 -環(huán)檸檬醛濃度和微囊藻細(xì)胞數(shù)目，直線線性回歸擬合得到該水域P -環(huán)檸檬醛濃度與微囊藻細(xì)胞數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率即該水域單顆微囊藻細(xì)胞的3-環(huán)檸檬醛生產(chǎn)量，再通過測(cè)定3-環(huán)檸檬醛濃度即可計(jì)算得到相應(yīng)的微囊藻細(xì)胞數(shù)目，該標(biāo)準(zhǔn)曲線適用于該水域其他檢測(cè)點(diǎn)以及與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的微囊藻處于同一生長(zhǎng)周期的微囊藻數(shù)目。本發(fā)明提供的快速測(cè)定微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，通過固相微萃取和氣相質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)微囊藻的專有產(chǎn)物3 -環(huán)檸檬醛的濃度，進(jìn)而得到微囊藻細(xì)胞數(shù)目，無需任何前處理，檢測(cè)過程方便快捷，成本較低，當(dāng)湖泊、水庫(kù)、河流等地表水發(fā)生水華時(shí)，可用該法測(cè)定該水域不同區(qū)域的微囊藻細(xì)胞數(shù)目，判斷水華是否由微囊藻引起。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例2中實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微囊藻產(chǎn)生的P-環(huán)檸檬醛的濃度隨微囊藻細(xì)胞數(shù)目變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中太湖流域水華暴發(fā)時(shí)期(2010年8月4日 11月16日)同一采樣點(diǎn)(無錫市太湖梅梁灣)的微囊藻產(chǎn)生的￠-環(huán)檸檬醛的濃度隨微囊藻細(xì)胞數(shù)目變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中長(zhǎng)江青草沙水庫(kù)2010年9月10日7處不同采樣點(diǎn)的微囊藻產(chǎn)生的￠-環(huán)檸檬醛的濃度隨微囊藻細(xì)胞數(shù)目變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中長(zhǎng)江青草沙水庫(kù)7處(I 7#)水樣采集點(diǎn)示意圖。
具體實(shí)施方式
^ -環(huán)檸檬醛濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以2-異丁基-3-甲氧基吡嗪(IBMP)為內(nèi)標(biāo)，采用氣相質(zhì)譜法(GC/MS)建立￠-環(huán)檸檬醛濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=25. 55X+4. 25X 10_2 (ng/L)，R2=O. 9968，^ -環(huán)檸檬醛濃度檢測(cè)范圍為 10 20000ng/L。^ -環(huán)檸檬醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及實(shí)施例中檢測(cè)P -環(huán)檸檬醛所用的氣相質(zhì)譜條件為進(jìn)樣口溫度180°C;柱壓為90kPa ;毛細(xì)管柱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0°C，恒定3min后，以8V /min的速度升溫至120°C，再以15°C /min的速度升溫至250°C，恒定2min ;與質(zhì)譜接口溫度為250°C ;離子源溫度為200°C ;不分流進(jìn)樣；選擇離子檢測(cè)模式，離子源為EI。實(shí)施例I六種常見的藍(lán)藻及綠藻均購(gòu)自中科院水生生物研究所，培養(yǎng)基為BG11，光照度20001ux，光照周期12h:12h，培養(yǎng)溫度為25°C。0D_是藻溶液在680nm波長(zhǎng)的吸光度，可反映藻的生物量。當(dāng)六種藻屬的OD68tl均為0. 4左右時(shí)(即六種藻類藻密度相近時(shí))，取培養(yǎng)液加入2-異丁基-3-甲氧基吡嗪使其最終濃度為20ng/L，加入無水氯化鈉，培養(yǎng)液與無水氯化納的比例為IOmL 3g，65°C水浴加熱，將萃取纖維(Supelco公司的57328-U型號(hào)，材質(zhì)為DVB/CAR/PDMS)置于樣品上方氣相介質(zhì)中，萃取30min，再將萃取纖維插入氣相質(zhì)譜進(jìn)樣口解吸2min，利用氣相質(zhì)譜測(cè)定3 -環(huán) 檸檬醛，根據(jù)￠-環(huán)檸檬醛濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到￠-環(huán)檸檬醛濃度，結(jié)果見表I。表I數(shù)據(jù)表明，除了微囊藻，其余藻均不能檢測(cè)到￠-環(huán)檸檬醛，進(jìn)一步驗(yàn)證了^-環(huán)檸檬醛為微囊藻專屬產(chǎn)物。表I不同藻產(chǎn)生的P -環(huán)檸檬醛的濃度
權(quán)利要求
1.一種快速測(cè)定水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)取若干個(gè)與待測(cè)水樣處于同一水域的測(cè)試水樣，測(cè)量測(cè)試水樣中的0-環(huán)朽1檬醒濃度和微囊藻細(xì)胞數(shù)目，直線線性回歸擬合得到該水域0 -環(huán)檸檬醛濃度與微囊藻細(xì)胞數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)曲線; (2)取待測(cè)水樣，測(cè)量待測(cè)水樣中的3-環(huán)檸檬醛濃度，根據(jù)所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)水樣中的微囊藻細(xì)胞數(shù)目。
2.如權(quán)利要求I所述的快速測(cè)定水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，其特征在于，所述步驟(I)中測(cè)量測(cè)試水樣中￠-環(huán)檸檬醛濃度的方法為利用固相微萃取收集測(cè)試水樣中微囊藻細(xì)胞產(chǎn)生的全部3 -環(huán)檸檬醛，使用氣相質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)量3 -環(huán)檸檬醛濃度。
3.如權(quán)利要求2所述的快速測(cè)定水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，其特征在于，所述氣相質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法米用的內(nèi)標(biāo)物為2-異丁基-3-甲氧基卩比嗪。
4.如權(quán)利要求2所述的快速測(cè)定水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，其特征在于，在測(cè)試水樣中加入2-異丁基-3-甲氧基吡嗪和氯化鈉后進(jìn)行固相微萃取。
5.如權(quán)利要求4所述的快速測(cè)定水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，其特征在于，所述的測(cè)試水樣與氯化鈉的比例為IOmL 3 4g。
6.如權(quán)利要求I所述的快速測(cè)定微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，其特征在于，所述步驟(I)中測(cè)量測(cè)試水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法為顯微鏡計(jì)數(shù)法。
7.如權(quán)利要求6所述的快速測(cè)定微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，其特征在于，所述的顯微鏡計(jì)數(shù)法使用的固定染色試劑為含冰醋酸的盧戈氏試劑。
8.如權(quán)利要求2所述的快速測(cè)定微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，其特征在于，所述測(cè)試水樣和待測(cè)水樣中￠-環(huán)檸檬醛的濃度的檢測(cè)范圍為l(T20000ng/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速測(cè)定水樣中微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，包括如下步驟(1)取若干個(gè)與待測(cè)水樣處于同一水域的測(cè)試水樣，測(cè)量測(cè)試水樣中的β-環(huán)檸檬醛濃度和微囊藻細(xì)胞數(shù)目，直線線性回歸擬合得到該水域β-環(huán)檸檬醛濃度與微囊藻細(xì)胞數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)取待測(cè)水樣，測(cè)量待測(cè)水樣中的β-環(huán)檸檬醛濃度，根據(jù)所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)水樣中的微囊藻細(xì)胞數(shù)目。本發(fā)明提供的快速測(cè)定微囊藻細(xì)胞數(shù)目的方法，無需任何前處理，檢測(cè)過程方便快捷，成本較低，當(dāng)湖泊、水庫(kù)、河流等地表水發(fā)生水華時(shí)，可用該法測(cè)定該水域多個(gè)區(qū)域的微囊藻細(xì)胞數(shù)目，并判斷水華是否由微囊藻引起。
文檔編號(hào)G01N15/14GK102721640SQ20121017371
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者張儀萍, 張可佳, 張土喬, 李聰 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)