專利名稱：一種高效液相色譜梯度法測定左亞葉酸鈣有關(guān)物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及左亞葉酸鈣及左亞葉酸鈣相關(guān)制劑的分析方法，具體涉及ー種用高效液相色譜梯度法進(jìn)行測定的方法，屬于藥物制劑分析檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
左亞葉酸鈣為左亞葉酸的鈣鹽，其化學(xué)名稱為(_)-N-[4[[[(6S)-2-氨基-5-甲?；?1，4，5，6，7，8-六氫-4-氧代-6-蝶啶基]甲基]氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酸鈣鹽五水合物。與5-氟尿嘧啶合用，用于治療胃癌和結(jié)直腸癌。左亞葉酸鈣的主要雜質(zhì)有7種，其在左亞葉酸鈣的合成過程中生成，在儲藏過程中還有可能產(chǎn)生降解產(chǎn)物。左亞葉酸鈣與其中一種雜質(zhì)ニ氫葉酸結(jié)構(gòu)相似，在現(xiàn)有的檢測方法中難以完全分離；另外，左亞葉酸酸性較強(qiáng)，在等度分離中需加入相應(yīng)的離子對試劑，存在所得主峰理論板數(shù)低，主峰與相鄰雜峰分離差、靈敏度低、色譜柱使用時(shí)間短，方法耐用性差等問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種采用高效液相色譜梯度法對左亞葉酸鈣、左亞酸鈣中間體及含左亞葉酸鈣的相關(guān)制劑進(jìn)行檢查的測定方法。本發(fā)明的高效液相色譜梯度法可對上述制劑中的雜質(zhì)A:(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊ニ酸；C:(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸；D :(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氫-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸；G :25)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氫_6_蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸和其它雜質(zhì)進(jìn)行有效的分離和含量測定。本發(fā)明的技術(shù)方案為ー種高效液相譜梯度法檢測左亞葉酸鈣待測樣品中有關(guān)物質(zhì)的方法，其特征在干，該檢測方法包括以下步驟(I)制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液在下述色譜條件下進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，校定檢測系統(tǒng)；色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠(250X4. Omm, 5 μ m)為填充劑，以磷酸鹽緩沖液為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40 60)為流動相B，梯度洗脫，柱溫為35 40°C,優(yōu)選40°C,流速為O. 9 I. lml/min,優(yōu)選I. Oml/min,檢測波長為280nm ；標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備分別取雜質(zhì)A、C、D、G及左亞葉酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，加水制成每Iml溶液中分別含雜質(zhì)A、C、D、G及左亞葉酸鈣各O. 005 O. Olmg的混合溶液；精密量取10 μ I所述混合溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，校定檢測系統(tǒng)至左亞葉酸鈣主峰與相鄰雜質(zhì)G的峰的分離度應(yīng)大于I. 5，理論板數(shù)按左亞葉酸鈣計(jì)算應(yīng)不低于 5000 ；其中，所述A是(2S)-2_[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊ニ酸，C是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲?；鵠氨基]戊ニ酸，D是(2S)-2-[[4-[ [(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氫-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲?；鵠氨基]戊ニ酸，G是2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4，7，8-四氫_6_蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸。(2)制備供試品溶液和對照溶液取左亞葉酸鈣待測樣品，加水制成濃度為lmg/ml的溶液，作為供試品溶液；量取所述供試品溶液，加水制成濃度為O. O lmg/ml的溶液，作為對照溶液；(3)通過高效色譜測定待測樣品中的左亞葉酸鈣及相關(guān)物質(zhì)的含量以對照溶液注入經(jīng)上述步驟(I)校定后的液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，再將供試品溶液注入液相色譜儀，在步驟(I)所述的色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜，記錄色譜圖至左亞葉酸鈣主峰保留時(shí)間的2. 5倍，其中供試品溶液色譜中各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對照溶液主峰面積的2倍； (4)計(jì)算待測樣品中各雜質(zhì)的含量。進(jìn)ー步地，上述的梯度洗脫中，流動相A比例的變化范圍為于O 20分鐘，線性梯度洗脫，流動相A的比例從90%變化為66%，流動相B的比例從10%變化為34%;于20 42分鐘，等度洗脫，流動相A的比例保持66%不變，流動相B的比例保持34%不變；于42 43分鐘，線性梯度洗脫，流動相A的比例從66%變化為90%，流動相B的比例從34%變化為10% ;于43 50分鐘，流動相A和B回到初始比例，色譜柱重新平衡。進(jìn)ー步地，上述磷酸鹽選自磷酸氫ニ鈉、磷酸氫ニ鉀、磷酸氫ニ銨的ー種或多種。進(jìn)ー步地，上述磷酸鹽緩沖液包括O. 01mol/L磷酸氫ニ鈉、O. 08%四丁基氫氧化銨，pH值為7. 8 8.0。進(jìn)ー步地，上述左亞葉酸鈣待測樣品包括左亞葉酸鈣原料、左亞葉酸鈣中間體、注射用左亞葉酸鈣和左亞葉酸鈣注射液。本發(fā)明通過使用高效液相色譜梯度法測定左亞葉酸鈣及相關(guān)物質(zhì)，通過對色譜條件的探索，確定了可以有效分離左亞葉酸鈣及相關(guān)物質(zhì)的色譜條件，克服了以往方法主峰理論板數(shù)低、主峰與相鄰雜峰分離度差、靈敏度低、色譜柱不耐用的缺點(diǎn)。傳統(tǒng)方法常用高效液相色譜等度法測定本品的有關(guān)物質(zhì)，但由于色譜柱不耐用及靈敏度低的缺點(diǎn)，難以在合成左亞葉酸鈣及制劑生產(chǎn)過程中有效控制有關(guān)物質(zhì)，本發(fā)明方法有效提高了靈敏度、相鄰雜峰與主峰之間的分離度，大大延長了色譜柱的使用壽命，從原來只能進(jìn)樣幾十針提升至幾千針。本發(fā)明方法適用于左亞葉酸鈣中間體、左亞葉酸鈣原料及含左亞葉酸鈣的相關(guān)制齊U，如凍干粉針以及注射液。本發(fā)明檢測方法準(zhǔn)確，操作簡單，靈敏度高，精密度好，可以充分滿足有關(guān)物質(zhì)檢查與分解產(chǎn)物測定的要求，較好地控制樣品中的特定雜質(zhì)與非特定雜質(zhì)，保證產(chǎn)品質(zhì)量，在實(shí)際工作中實(shí)用性強(qiáng)。


圖I是左亞葉酸鈣以及雜質(zhì)A、C、D、G標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖；其中，I為雜質(zhì)A，2為左亞葉酸鈣主峰，3為雜質(zhì)G，4為雜質(zhì)D，5為雜質(zhì)C。圖2是左亞葉酸鈣原料供試品溶液的色譜圖(批號20120301)。
具體實(shí)施例方式儀器Agilent 1100系列高效液相色譜儀，試劑磷酸氫ニ鈉(分析純)，10%四丁基氫氧化銨(分析純)，甲醇(色譜純，Merk公司)色譜柱ThermoODS 柱(250 X 4. Omm, 5 μ m)標(biāo)準(zhǔn)品的來源左亞葉酸鈣自制，純度99. 6%，批號20120101 ;其制備方法取左亞葉酸鈣原料經(jīng)こ醇-水重結(jié)晶，干燥，即得。雜質(zhì)A:
化學(xué)名(2S) -2- [ (4-氨基苯甲酰)氨基]戊ニ酸來源sigma，批號BCBD6281雜質(zhì)C 化學(xué)名(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲?；鵠氨基]戊ニ酸來源sigma，批號107K0741V雜質(zhì)D 化學(xué)名(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氫-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲?；鵠氨基]戊ニ酸來源EP，批號00AZJ3雜質(zhì)G 化學(xué)名(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4，7，8-四氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸來源sigma，批號028K5007V左亞葉酸鈣原料及中間體參照公開號為CN 1401647A、名稱為《高比旋度的左旋亞葉酸鈣及拆分方法》中的方法制得。注射用左亞葉酸鈣參照公開號為CN 1456162A、名稱為《左亞葉酸鈣的注射藥劑及制備方法》中的方法制得。左亞葉酸鈣注射液參照美國專利號US2006/0058312A1，名稱為《Stabilizedaqueous preparation for injection))中的方法制得。實(shí)施例I高效液相色譜梯度法的條件篩選I、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)I. I流動相的選擇參照相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合試驗(yàn)具體情況，先后選用甲醇-水、甲醇-磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L磷酸氫ニ鈉，0. 08 %四丁基氫氧化銨，用磷酸調(diào)pH值為7. 8)、こ腈-水、乙腈-磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L磷酸氫ニ鈉，0. 08 %四丁基氫氧化銨，用磷酸調(diào)pH值為
7.8)，甲醇-水-冰醋酸，こ腈-水-冰醋酸，甲醇-水-三氟醋酸，こ腈-水-三氟醋酸等作為流動相的組成，以左亞葉酸鈣主峰與最難分離雜質(zhì)G的分離度與左亞葉酸鈣主峰的理論板數(shù)和對稱度作為評價(jià)指標(biāo)，最后確定以磷酸鹽緩沖液(0. Olmol/L磷酸氫ニ鈉，0. 08%四丁基氫氧化銨，用磷酸調(diào)PH值為7.0 8. 0)為流動相A，以磷酸鹽緩沖液(O.Olmol/L磷酸氫ニ鈉，O. 08%四丁基氫氧化銨，用磷酸調(diào)pH值為7. O 8. O)-甲醇(40 60)為流動相B，磷酸鹽緩沖液(O. Olmol/L磷酸氫ニ鈉，O. 08%四丁基氫氧化銨)的最佳pH值為7.8左右，照下表I進(jìn)行梯度洗脫。流動相選擇結(jié)果見下表2。表I.流動相與洗脫時(shí)間
權(quán)利要求
1.一種高效液相譜梯度法檢測左亞葉酸鈣待測樣品中有關(guān)物質(zhì)的方法，其特征在干，該檢測方法包括以下步驟 (1)制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液在下述色譜條件下進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，校定檢測系統(tǒng)； 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠(250X4. Omm, 5 μ m)為填充劑，以磷酸鹽緩沖液為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40 60)為流動相B，梯度洗脫，柱溫為35 40°C，流速為O. 9 I. lml/min,檢測波長為280nm ； 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備分別取雜質(zhì)A、C、D、G及左亞葉酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，加水制成每Iml溶液中分別含雜質(zhì)A、C、D、G及左亞葉酸鈣各O. 005 O. Olmg的混合溶液，精密量取10μ I所述混合溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，校定檢測系統(tǒng)至左亞葉酸鈣主峰與相鄰雜質(zhì)G的峰的分離度應(yīng)大于I. 5，理論板數(shù)按左亞葉酸鈣峰計(jì)算應(yīng)不低于5000 ； 其中，所述A是(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊ニ酸，C是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4_氧代-1，4-ニ氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸，D是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氫-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲?；鵠氨基]戊ニ酸，G是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸。
(2)制備供試品溶液和對照溶液 取左亞葉酸鈣待測樣品，加水制成濃度為lmg/ml的溶液，作為供試品溶液； 量取所述供試品溶液，加水制成濃度為O. O lmg/ml的溶液，作為對照溶液； (3)通過高效液相色譜測定待測樣品中的相關(guān)物質(zhì)的含量 以對照溶液注入經(jīng)上述步驟(I)校定后的液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，再將供試品溶液注入液相色譜儀，在步驟(I)所述的色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜測定，記錄色譜圖至左亞葉酸鈣主峰保留時(shí)間的2. 5倍，其中供試品溶液色譜中各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對照溶液主峰面積的2倍； (4)計(jì)算待測樣品中各雜質(zhì)的含量。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述的梯度洗脫中，流動相A比例的變化范圍為于O 20分鐘，線性梯度洗脫，流動相A的比例從90%變化為66%，流動相B的比例從10%變化為34% ;于20 42分鐘，等度洗脫，流動相A的比例保持66%不變，流動相B的比例保持34 %不變；于42 43分鐘，線性梯度洗脫，流動相A的比例從66 %變化為90 %，流動相B的比例從34%變化為10% ;于43 50分鐘，流動相A和B回到初始比例，色譜柱重新平衡。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述磷酸鹽選自磷酸氫ニ鈉、磷酸氫ニ鉀、磷酸氫ニ銨的ー種或多種。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液包括O.01mol/L磷酸氫ニ鈉、O.08%四丁基氫氧化銨，pH值為7.8 8. O。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在干，所述色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠(250 X 4. 0mm，5 μ m)為填充劑，以磷酸鹽緩沖液為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40 60)為流動相B，梯度洗脫，柱溫為40°C，流速為l.Oml/min，檢測波長為280nm。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述左亞葉酸鈣待測樣品包括左亞葉酸鈣原料、左亞葉酸鈣中間體、注射用左亞葉酸鈣和左亞葉酸鈣注射液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種左亞葉酸鈣的高效液相色譜分析法，具體是以十八烷基硅烷鍵合硅膠(250×4.0mm，5μm)為填充劑，以磷酸鹽緩沖液為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40∶60)為流動相B，梯度洗脫；取左亞葉酸鈣或左亞葉酸鈣制劑，加水制成含左亞葉酸鈣1mg/ml的溶液，作為供試品溶液，并用水稀釋制成每1ml中約含0.01mg的溶液，作為對照溶液。分別進(jìn)樣，供試品溶液的色譜圖中各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的2倍。本發(fā)明的方法克服了以往方法主峰理論板數(shù)低、主峰與相鄰雜峰的分離度差、靈敏度低、色譜柱不耐用的缺點(diǎn)?？煽焖贉?zhǔn)確的檢測出左亞葉酸鈣的雜質(zhì)及降解產(chǎn)物，操作簡單，重現(xiàn)性好，靈敏度高，可較好地控制左亞葉酸鈣產(chǎn)品質(zhì)量。
文檔編號G01N30/36GK102841169SQ20121029442
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者劉小柔, 高媛, 李勇, 嚴(yán)啟新, 馬春銘, 王麗麗, 湛常娟, 馮漢林 申請人:深圳海王藥業(yè)有限公司