專利名稱：一種激光掃描位相顯微成像方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種光學成像方法及系統(tǒng)，特別是關(guān)于一種適用于透明生物組織成像的激光掃描位相顯微成像方法及系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
激光掃描共聚焦顯微技術(shù)是利用置于探測器前的針孔，有效屏蔽非焦面光對樣品成像質(zhì)量的影響，實現(xiàn)點掃描、點探測的成像過程，但是由于其并不具有將樣品位相信息轉(zhuǎn)變?yōu)閺姸刃畔⒌哪芰Γ虼瞬荒軐ν该魃飿悠愤M行非熒光標記的結(jié)構(gòu)成像，需要與其它顯微成像方法融合才能對透明生物樣品實現(xiàn)逐點掃描/探測方法。現(xiàn)有技術(shù)中生物組織顯微成像方法主要包括1、微分干涉相差顯微成像方法利用兩塊渥拉斯頓棱鏡(Wollaston Prism),起偏器(Polarizer)和檢偏器(Analyzer),基 于寬場偏振光對透明生物組織進行成像，成像結(jié)果可以呈現(xiàn)生物組織的浮雕狀結(jié)構(gòu)，但是上述顯微成像方法需要在光路中額外添加偏振元件產(chǎn)生偏振光，并利用兩束偏振光形成的剪切角進行位相差分探測，所使用的元件價格昂貴且不能對具有雙折射特性的樣品進行探測。同時，寬場成像需要使用CCD相機進行數(shù)據(jù)采集，因此不利于與采用點探測器的激光掃描共聚焦顯微技術(shù)融合。2、斜射照明顯微成像方法是利用霍夫曼光學調(diào)制器(HoffmanModulator)和狹縫光闌(Slit Stop)，基于寬場斜入射的光源對透明生物組織進行成像，成像結(jié)果可以呈現(xiàn)生物組織的浮雕狀結(jié)構(gòu)，但是由于上述顯微成像方法的光路中需要插入光學調(diào)制器和狹縫光闌，因此在實驗過程中不利于不同模態(tài)間的切換，同時也因為寬場成像需要使用CCD相機進行數(shù)據(jù)采集，所以不利于與采用點探測器的激光掃描共聚焦顯微技術(shù)融合。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種可以實現(xiàn)對透明生物樣品的無標記成像，不僅能夠方便不同模態(tài)之間切換，而且成像對比度和信噪比均比較高的激光掃描位相顯微成像方法及系統(tǒng)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種激光掃描位相顯微成像方法，包括以下步驟1)設(shè)置一包括有熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描系統(tǒng)和光電探測系統(tǒng)的激光掃描位相顯微成像系統(tǒng)；其中，所述熒光顯微鏡包括有物鏡、管鏡和掃描鏡；所述激光共聚焦掃描系統(tǒng)包括有激光器、二向色鏡、X方向掃描振鏡、Y方向掃描振鏡、濾波片、會聚透鏡和針孔；2)將激光共聚焦掃描系統(tǒng)放置在熒光顯微鏡的入光孔處，將光電探測系統(tǒng)放置在激光共聚焦掃描系統(tǒng)的出光方向，使激光器出射激發(fā)光的高度與熒光顯微鏡入光孔中軸線的高度相當；3)調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度，使成像系統(tǒng)滿足光學顯微系統(tǒng)的物象共軛關(guān)系；4)將一樣品切片放置在熒光顯微鏡的試驗臺上，所述樣品切片包括蓋玻片、生物樣品以及載玻片；5)在載玻片上添加突光介質(zhì)；6)激光器發(fā)射激發(fā)光經(jīng)二向色鏡進行分光，出射的激發(fā)光依次經(jīng)X方向掃描振鏡和Y方向掃描振鏡掃描成光柵面，并將其經(jīng)掃描鏡和管鏡聚焦擴束后發(fā)射到物鏡，并經(jīng)蓋玻片聚焦在生物樣品上；7)聚焦在生物樣品的激發(fā)光透過生物樣品照射熒光介質(zhì)，熒光介質(zhì)被激發(fā)光激發(fā)發(fā)射熒光；8)熒光照射并透過生物樣品沿著原光路返回，即依次經(jīng)物鏡、管鏡、掃描鏡、Y方向掃描振鏡、X方向掃描振鏡發(fā)射到二向色鏡進行分光，出射的熒光發(fā)射到濾波片并經(jīng)會聚透鏡聚焦進入針孔，經(jīng)針孔出射的熒光由光電探測系統(tǒng)接收處理得到生物樣品的浮雕狀結(jié)構(gòu)。所述步驟3)中調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度具體操作為調(diào)節(jié)X方向掃描振鏡與物鏡之間的角度，使進入物鏡前的激發(fā)光光軸方向與物鏡中軸線之間的角度為θ，α ! ( Θ〈Ci2，其中，\為激發(fā)光掃描視場角，％為物鏡的數(shù)值孔徑角。所述步驟3)中調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度具體操作為調(diào)節(jié)X方向掃描振鏡與物鏡之間的角度，使進入物鏡前的激發(fā)光光軸方向與物鏡的中軸線重合，并調(diào)節(jié)會聚透鏡與針孔之間的位置，使經(jīng)會聚透鏡聚焦的熒光與針孔中軸線之間的角度為β，αι· Y (β〈α 2 · Y，其中，Y為角放大率，α 為激發(fā)光掃描視場角，α 2為物鏡的數(shù)值孔徑角。所述步驟3)中調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度具體操作為調(diào)節(jié)X方向掃描振鏡與物 鏡之間的角度，使進入物鏡前的激發(fā)光光軸方向與物鏡的中軸線之間的角度為S 17同時調(diào)節(jié)會聚透鏡與針孔之間的位置，使經(jīng)會聚透鏡聚焦的熒光與針孔中軸線之間的角度為δ 2，其中，δ J 0，δ 2〉0，α ( δ j+ δ 2/ y ( α 2, γ為角放大率，α ι為激發(fā)光掃描視場角，α 2為物鏡的數(shù)值孔徑角。實現(xiàn)所述方法的一種激光掃描位相顯微成像系統(tǒng)，其特征在于它包括突光顯微鏡、激光共聚焦掃描系統(tǒng)和光電探測系統(tǒng)，所述熒光顯微鏡包括物鏡、管鏡和掃描鏡；所述激光共聚焦掃描系統(tǒng)包括激光器、二向色鏡、X方向掃描振鏡、Y方向掃描振鏡、濾波片、會聚透鏡和針孔；所述激光共聚焦掃描系統(tǒng)設(shè)置在所述熒光顯微鏡的入光孔處，所述光電探測系統(tǒng)設(shè)置在所述針孔的出光方向，所述激光器發(fā)射激發(fā)光到所述二向色鏡進行分光，經(jīng)所述二向色鏡出射的激發(fā)光依次經(jīng)所述X方向掃描振鏡和Y方向掃描振鏡沿X方向和Y方向掃描成光柵面，光柵面經(jīng)所述掃描鏡聚焦進入所述熒光顯微鏡，并依次經(jīng)所述管鏡和物鏡聚焦于生物樣品并照射熒光介質(zhì)，經(jīng)激發(fā)光激發(fā)的熒光照射并透過生物樣品，沿著所述物鏡、管鏡和掃描鏡射出，并依次通過所述Y方向掃描振鏡和X方向掃描鏡發(fā)射到所述二向色鏡進行分光，經(jīng)所述二向色鏡出射的熒光經(jīng)所述濾波片和會聚透鏡聚焦進入所述針孔，并經(jīng)所述針孔出射到所述光電探測系統(tǒng)上完成生物樣品的熒光成像。進入所述物鏡前的激發(fā)光光軸方向與所述物鏡中軸線之間的角度為θ，且α丨θ〈α2，其中，\為激發(fā)光掃描視場角，％為物鏡的數(shù)值孔徑角。進入所述物鏡前的激發(fā)光光軸方向與所述物鏡中軸線重合，且經(jīng)所述會聚透鏡聚焦的熒光光軸與所述針孔中軸線之間的角度為( β〈α2· Y,其中，Y為角放大率，\為激發(fā)光掃描視場角，Ci2S物鏡的數(shù)值孔徑角。進入所述物鏡前的激發(fā)光光軸方向與所述物鏡的中軸線之間的角度為S1，且經(jīng)所述會聚透鏡聚焦的熒光與所述針孔中軸線之間的角度為S2，其中，S1) 0，δ2)0, Q1(δ 1+ δ 2/ Y (α2, Y為角放大率，a i為激發(fā)光掃描視場角，α 2為物鏡的數(shù)值孔徑角。本發(fā)明由于采取以上技術(shù)方案，其具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明由于設(shè)置有熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描系統(tǒng)和光電探測系統(tǒng)，且在載玻片上(樣品后方)設(shè)置有熒光介質(zhì)，對待測的生物樣品進行激光掃描位相顯微成像時，激發(fā)光激發(fā)熒光照射生物樣品并通過調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度，可以完成透明生物樣品結(jié)構(gòu)的浮雕狀成像，實現(xiàn)了對透明生物樣品的無標記成像。2、本發(fā)明由于利用設(shè)置在樣品后方的熒光介質(zhì)激發(fā)的熒光照射生物樣品，實現(xiàn)透明樣品的結(jié)構(gòu)浮雕狀成像，且也可以利用生物樣品本身標記的熒光，實現(xiàn)傳統(tǒng)熒光成像，因此可以在掃描光學成像中完成對生物樣品結(jié)構(gòu)成像或熒光成像，切換過程簡單易行，極大方便了不同模態(tài)之間切換。3、本發(fā)明由于采用激光共聚焦掃描/探測方式，因此只接收位于物鏡焦面上的樣品信息，有效地屏蔽了非焦面光對成像質(zhì)量的影響，成像對比度高，信噪比高，使得逐點掃描/探測方法能夠適用于透明生物樣品的成像。4、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于不需要微分干涉相差顯微成像技術(shù)和斜射照明顯微成像技術(shù)中特有的光學元件，因此大大降低了顯微成像系統(tǒng)的復雜性，避免了光路中插入的光學元件使實驗系統(tǒng)以及實驗過程復雜化。本發(fā)明可以廣泛應用于生物樣品 的成像過程中。


圖I是本發(fā)明的激光掃描位相顯微成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明在激光斜入射時的角度放大剖面示意圖；圖3是本發(fā)明的針孔斜接收時角度放大剖面示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。如圖I所不,本發(fā)明的激光掃描位相顯微成像系統(tǒng)包括一突光顯微鏡I、一激光共聚焦掃描系統(tǒng)2和一光電探測系統(tǒng)3 ;突光顯微鏡I包括物鏡11、管鏡12和掃描鏡13 ;激光共聚焦掃描系統(tǒng)2包括激光器21、二向色鏡22、X方向掃描振鏡23、Y方向掃描振鏡24、濾波片25、會聚透鏡26和針孔27 ;激光共聚焦掃描系統(tǒng)2位于突光顯微鏡I的入光孔處，光電探測系統(tǒng)3位于針孔27的出光方向，用于接收經(jīng)生物樣品透射的熒光。激光器21發(fā)射激發(fā)光到二向色鏡22發(fā)生反射或透射(分光)，經(jīng)二向色鏡22反射的激發(fā)光發(fā)射到X方向掃描振鏡23將激發(fā)光掃描成光柵線(線光源),并將其發(fā)射到Y(jié)方向掃描振鏡24將光柵線掃描成光柵面(面光源)，光柵面經(jīng)掃描鏡13聚焦進入熒光顯微鏡1，并依次經(jīng)管鏡12和物鏡11聚焦于生物樣品，經(jīng)激發(fā)光激發(fā)的熒光沿著物鏡11、管鏡12和掃描鏡13射出熒光顯微鏡1，并依次通過Y方向掃描振鏡24和X方向掃描鏡23發(fā)射到二向色鏡22發(fā)生透射或反射，透射的熒光經(jīng)濾波片25和會聚透鏡26聚焦進入針孔27，并經(jīng)針孔27出射到光電探測系統(tǒng)3上完成生物樣品的熒光成像。上述實施例中，光電探測系統(tǒng)3可以根據(jù)實際需要選擇具有光電探測功能的光學元件，在此不作限定。上述各實施例中，濾波片25根據(jù)所采用的熒光介質(zhì)所激發(fā)的熒光的波長對應進行選擇。上述各實施例中，二向色鏡22的作用是分光，可以采用反射激發(fā)光透射熒光，也可以采用透射激發(fā)光反射熒光，在具體實驗中可以根據(jù)實際需要進行設(shè)定。如圖I所示，實際對生物樣品進行熒光成像時，熒光顯微鏡I可以采用正置熒光顯微鏡或倒置熒光顯微鏡的方式完成成像，兩者的區(qū)別僅是將光路進行上下翻轉(zhuǎn)，本發(fā)明以倒置式熒光顯微鏡I為具體實施例詳細說明激光掃描位相顯微成像系統(tǒng)對待測的生物樣品進行激光掃描位相顯微成像方法，包括以下步驟I)將激光共聚焦掃描系統(tǒng)2放置在熒光顯微鏡I的入光孔處，將光電探測系統(tǒng)3放置在激光共聚焦掃描系統(tǒng)2的出光方向，且保證激光器21的出射激光的高度與突光顯微鏡I入光孔中軸線的高度相當(近似相等)，使激發(fā)光能夠通過入光孔進入熒光顯微鏡I對生物樣品進行照射。2)根據(jù)實際需要，調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度，使成像系統(tǒng)滿足光學顯微系統(tǒng)的物象共軛關(guān)系。3)將樣品切片4放置在熒光顯微鏡I的試驗臺上，樣品切片4自下而上依次為蓋玻片41、生物樣品42以及載玻片43。4)在載玻片43的頂部添加突光介質(zhì)5,該突光介質(zhì)5是可以被入射激發(fā)光有效激發(fā)的熒光材料。
5)激光器21發(fā)出激發(fā)光經(jīng)二向色鏡22進行分光，經(jīng)二向色鏡22出射的激發(fā)光依次經(jīng)X方向掃描振鏡23和Y方向掃描振鏡24沿X方向和Y方向掃描成光柵面,并將其經(jīng)掃描鏡13和管鏡12聚焦擴束后發(fā)射到物鏡11，并經(jīng)蓋玻片41聚焦在生物樣品42上，完成對生物樣品的激光掃描。6)由于生物樣品本身是接近透明狀，因此聚焦在生物樣品42的激發(fā)光大部分透過生物樣品42照射在熒光介質(zhì)5上，熒光介質(zhì)5被激發(fā)光激發(fā)發(fā)射熒光，為生物樣品42提供照明。7)熒光照射并透過生物樣品42沿著原光路返回，即依次經(jīng)物鏡11、管鏡12、掃描鏡13、Y方向掃描振鏡24、X方向掃描振鏡23發(fā)射到二向色鏡22進行分光，由于突光的波長與激發(fā)光的波長不同，因此熒光經(jīng)二向色鏡22出射到濾波片25并經(jīng)會聚透鏡26聚焦進入針孔27，經(jīng)針孔27出射的熒光由光電探測系統(tǒng)3接收并經(jīng)現(xiàn)有的圖像處理方法進行處理形成生物樣品的浮雕狀結(jié)構(gòu)。如圖2所示，上述實施例中，為了使生物樣品的成像結(jié)果可以呈現(xiàn)生物組織的浮雕狀結(jié)構(gòu)，因此可以采用熒光為生物樣品提供寬場斜射光源，步驟2)中調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度具體操作為調(diào)節(jié)X方向掃描振鏡23與物鏡11之間的角度，使進入物鏡11前的激發(fā)光光軸方向與物鏡11的中軸線之間的角度為Θ，且α 〈 θ〈 α 2，a i為激發(fā)光掃描視場角(與樣品掃描范圍對應的激發(fā)光偏轉(zhuǎn)角度)，α2為物鏡11的數(shù)值孔徑角，其中，Sina2=ΝΑ/η，NA為物鏡的數(shù)值孔徑，η為介質(zhì)折射率。 如圖3所示，上述實施例中，根據(jù)光學成像的物象共軛關(guān)系可知，步驟2 )中調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度具體操作為調(diào)節(jié)X方向掃描振鏡23與物鏡11之間的角度，使進入物鏡11前的激發(fā)光光軸方向與物鏡11的中軸線重合時(激發(fā)光的光軸方向與物鏡11的中軸線之間的角度為0)，調(diào)節(jié)會聚透鏡26與針孔27之間的位置，使經(jīng)會聚透鏡26聚焦的熒光光軸與針孔中軸線之間的角度為β，變化范圍為a i · γ〈 β ( α 2 · y ,根據(jù)光學系統(tǒng)的放大率關(guān)系，角放大率Y = f/f2, f為物鏡11的焦距，f2為會聚透鏡26的焦距，因此，當激光正入射時，通過設(shè)置經(jīng)會聚透鏡聚焦26的熒光光軸與針孔27中軸線之間的角度，也可以使生物樣品的成像結(jié)果呈現(xiàn)生物組織的浮雕狀結(jié)構(gòu)。上述實施例中，步驟2)中調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度具體操作也可以為調(diào)節(jié)X方向掃描振鏡23與物鏡11之間的角度，使進入物鏡11前的激發(fā)光光軸方向與物鏡11的中軸線之間的角度為S1 (S1)O),同時調(diào)節(jié)會聚透鏡26與針孔27之間的位置，使經(jīng)會聚透鏡26聚焦的熒光光軸與針孔27中軸線之間的角度為δ 2 ( δ 2〉0)，當滿足α 〈 δ 1+ δ 2/Y〈 α 2時，也可以使得生物樣品的成像結(jié)果呈現(xiàn)生物組織的浮雕狀結(jié)構(gòu)。上述各實施例中，針孔27的直徑可以采用微米量級，目的為了更好的避免來自非焦面光進入光電探測系統(tǒng)3。上述各實施例中，本發(fā)明的所有光學器件在使用過程中均可以采用相應的外部支架進行定位，本發(fā)明對每一光學元件的具體位置不作限定，可以根據(jù)具體實驗要求進行調(diào)整，但是所有的光學元件組合形成的光路傳播必須與本發(fā)明的光路傳播一致，滿足本發(fā)明對生物樣品的照射和檢測要求。
上述各實施例僅用于說明本發(fā)明，其中各光學元件的位置、實施方法的步驟等都是可以有所變化的，凡是在本發(fā)明技術(shù)方案的基礎(chǔ)上進行的等同變換和改進，均不應排除在本發(fā)明的保護范圍之外。
權(quán)利要求
1.一種激光掃描位相顯微成像方法，包括以下步驟 1)設(shè)置一包括有突光顯微鏡、激光共聚焦掃描系統(tǒng)和光電探測系統(tǒng)的激光掃描位相顯微成像系統(tǒng)；其中，所述熒光顯微鏡包括有物鏡、管鏡和掃描鏡；所述激光共聚焦掃描系統(tǒng)包括有激光器、二向色鏡、X方向掃描振鏡、Y方向掃描振鏡、濾波片、會聚透鏡和針孔； 2)將激光共聚焦掃描系統(tǒng)放置在熒光顯微鏡的入光孔處，將光電探測系統(tǒng)放置在激光共聚焦掃描系統(tǒng)的出光方向，使激光器出射激發(fā)光的高度與熒光顯微鏡入光孔中軸線的高度相當； 3)調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度，使成像系統(tǒng)滿足光學顯微系統(tǒng)的物象共軛關(guān)系； 4)將一樣品切片放置在熒光顯微鏡的試驗臺上，所述樣品切片包括蓋玻片、生物樣品以及載玻片； 5)在載玻片上添加突光介質(zhì)； 6)激光器發(fā)射激發(fā)光經(jīng)二向色鏡進行分光，出射的激發(fā)光依次經(jīng)X方向掃描振鏡和Y方向掃描振鏡掃描成光柵面，并將其經(jīng)掃描鏡和管鏡聚焦擴束后發(fā)射到物鏡，并經(jīng)蓋玻片聚焦在生物樣品上； 7)聚焦在生物樣品的激發(fā)光透過生物樣品照射熒光介質(zhì)，熒光介質(zhì)被激發(fā)光激發(fā)發(fā)射熒光； 8)熒光照射并透過生物樣品沿著原光路返回，即依次經(jīng)物鏡、管鏡、掃描鏡、Y方向掃描振鏡、X方向掃描振鏡發(fā)射到二向色鏡進行分光，出射的熒光發(fā)射到濾波片并經(jīng)會聚透鏡聚焦進入針孔，經(jīng)針孔出射的熒光由光電探測系統(tǒng)接收處理得到生物樣品的浮雕狀結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求I所述的一種激光掃描位相顯微成像方法，其特征在于所述步驟3)中調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度具體操作為調(diào)節(jié)X方向掃描振鏡與物鏡之間的角度，使進入物鏡前的激發(fā)光光軸方向與物鏡中軸線之間的角度為θ，α I〈 Θ (a 2，其中，α 為激發(fā)光掃描視場角，％為物鏡的數(shù)值孔徑角。
3.如權(quán)利要求I所述的一種激光掃描位相顯微成像方法，其特征在于所述步驟3)中調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度具體操作為調(diào)節(jié)X方向掃描振鏡與物鏡之間的角度，使進入物鏡前的激發(fā)光光軸方向與物鏡的中軸線重合，并調(diào)節(jié)會聚透鏡與針孔之間的位置，使經(jīng)會聚透鏡聚焦的熒光與針孔中軸線之間的角度為( β〈α2· Y,其中，Y為角放大率，^為激發(fā)光掃描視場角，％為物鏡的數(shù)值孔徑角。
4.如權(quán)利要求I所述的一種激光掃描位相顯微成像方法，其特征在于所述步驟3)中調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度具體操作為調(diào)節(jié)X方向掃描振鏡與物鏡之間的角度，使進入物鏡前的激發(fā)光光軸方向與物鏡的中軸線之間的角度為S 17同時調(diào)節(jié)會聚透鏡與針孔之間的位置，使經(jīng)會聚透鏡聚焦的熒光與針孔中軸線之間的角度為S2，其中，S1) O，δ2)0,Q1 ( δ 1+ δ 2/ y (α2, y為角放大率，α 為激發(fā)光掃描視場角，α 2為物鏡的數(shù)值孔徑角。
5.實現(xiàn)如權(quán)利要求I或2或3或4所述方法的一種激光掃描位相顯微成像系統(tǒng)，其特征在于它包括突光顯微鏡、激光共聚焦掃描系統(tǒng)和光電探測系統(tǒng)，所述突光顯微鏡包括物鏡、管鏡和掃描鏡；所述激光共聚焦掃描系統(tǒng)包括激光器、二向色鏡、X方向掃描振鏡、Y方向掃描振鏡、濾波片、會聚透鏡和針孔；所述激光共聚焦掃描系統(tǒng)設(shè)置在所述熒光顯微鏡的入光孔處，所述光電探測系統(tǒng)設(shè)置在所述針孔的出光方向，所述激光器發(fā)射激發(fā)光到所述二向色鏡進行分光，經(jīng)所述二向色鏡出射的激發(fā)光依次經(jīng)所述X方向掃描振鏡和Y方向掃描振鏡沿X方向和Y方向掃描成光柵面，光柵面經(jīng)所述掃描鏡聚焦進入所述突光顯微鏡，并依次經(jīng)所述管鏡和物鏡聚焦于生物樣品并照射熒光介質(zhì)，經(jīng)激發(fā)光激發(fā)的熒光照射并透過生物樣品，沿著所述物鏡、管鏡和掃描鏡射出，并依次通過所述Y方向掃描振鏡和X方向掃描鏡發(fā)射到所述二向色鏡進行分光，經(jīng)所述二向色鏡出射的熒光經(jīng)所述濾波片和會聚透鏡聚焦進入所述針孔，并經(jīng)所述針孔出射到所述光電探測系統(tǒng)上完成生物樣品的熒光成像。
6.如權(quán)利要求5所述的一種激光掃描位相顯微成像系統(tǒng),其特征在于進入所述物鏡前的激發(fā)光光軸方向與所述物鏡中軸線之間的角度為Θ，且a i〈 Θ ( α 2，其中，α 為激發(fā)光掃描視場角，％為物鏡的數(shù)值孔徑角。
7.如權(quán)利要求5所述的一種激光掃描位相顯微成像系統(tǒng)，其特征在于進入所述物鏡前的激發(fā)光光軸方向與所述物鏡中軸線重合，且經(jīng)所述會聚透鏡聚焦的熒光光軸與所述針孔中軸線之間的角度為β，α工· Y ( β〈 α 2 · γ，其中，γ為角放大率，a i為激發(fā)光掃描視場角，％為物鏡的數(shù)值孔徑角。
8.如權(quán)利要求5所述的一種激光掃描位相顯微成像系統(tǒng)，其特征在于進入所述物鏡前的激發(fā)光光軸方向與所述物鏡的中軸線之間的角度為S i，且經(jīng)所述會聚透鏡聚焦的熒光與所述針孔中軸線之間的角度為S2，其中，δ^Ο, δ2)0, Q1 (δ1+δ2/γ〈α2，Υ為角放大率，^為激發(fā)光掃描視場角，％為物鏡的數(shù)值孔徑角。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種激光掃描位相顯微成像方法及系統(tǒng)，它包括有熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描系統(tǒng)和光電探測系統(tǒng)；將激光共聚焦掃描系統(tǒng)放置在熒光顯微鏡入光孔，將光電探測系統(tǒng)放置在激光共聚焦掃描系統(tǒng)的出光方向；調(diào)節(jié)各光學元件之間的角度；將樣品切片放置在試驗臺上；在載玻片的頂部添加熒光介質(zhì)；激光器發(fā)出激發(fā)光經(jīng)二向色鏡、X方向掃描振鏡、Y方向掃描振鏡、掃描鏡和管鏡聚焦擴束后發(fā)射到物鏡，并聚焦在生物樣品上；聚焦在生物樣品的激發(fā)光透過生物樣品照射在熒光介質(zhì)上，熒光介質(zhì)被激發(fā)光激發(fā)發(fā)射熒光；熒光照射并透過生物樣品沿著原光路返回，出射的熒光發(fā)射到濾波片并經(jīng)會聚透鏡聚焦進入針孔，經(jīng)針孔出射的熒光由光電探測系統(tǒng)接收處理得到生物樣品的浮雕狀結(jié)構(gòu)。本發(fā)明可以廣泛應用于生物樣品成像過程中。
文檔編號G01N21/64GK102841083SQ20121033870
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者丁翼晨, 謝浩, 席鵬 申請人:北京大學