專利名稱：脂蛋白(a)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)檢測試劑盒，具體涉及一種運(yùn)用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測定人血清中脂蛋白(a)的試劑盒。
背景技術(shù)：
脂蛋白(a) (Lipoprotein (a), LP (a))是與低密度脂蛋白相似的一種脂蛋白，其核心部分除了含有和低密度脂蛋白組分相似的甘油三酯，磷脂，膽固醇，膽固醇酯等脂質(zhì)和載脂蛋白BlOO (Ap0BlOO)外，還含有低密度脂蛋白中沒有的載脂蛋白(a)(Apolipoprotein (a), Apo (a) )0因此，通常醫(yī)學(xué)上通過檢測載脂蛋白(a)的濃度來反應(yīng)脂蛋白(a)在血清中的含量。載脂蛋白(a)的cDNA序列在1993已經(jīng)被報(bào)道，從而推測出蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它的相對分子質(zhì)量為(250-800kDa)，含有4529個(gè)氨基酸。載脂蛋白(a)通過雙硫鍵聯(lián)結(jié)于載脂蛋白B100。研究發(fā)現(xiàn)脂蛋白(a)在個(gè)體血清中濃度相對穩(wěn)定，除遺傳因素外，幾乎不受年齡，性別，吸煙，飲食，脂代謝，藥物，環(huán)境等因素的影響。因此脂蛋白(a)是一種比較穩(wěn)定的生物標(biāo)記物，大量的基礎(chǔ)研究和臨床研究表現(xiàn)脂蛋白(a)與動(dòng)脈硬化性腦血管疾病的發(fā)生相關(guān)，是心腦血管疾病，糖尿病，肝膽疾病，終末期腎病及婦科等疾病的重要危險(xiǎn)因素。目前，已知的檢測脂蛋白(a)濃度的方法有酶聯(lián)免疫法，放射免疫法，熒光免疫測定法等檢測方法，上述的測定方法的操作比較復(fù)雜，檢測用時(shí)長，過度浪費(fèi)資源的缺點(diǎn)，不適合做常規(guī)檢測。中國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站上公開了一種脂蛋白(a)檢測試劑盒檢測，采用膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法，具有穩(wěn)定性好，檢測方便的優(yōu)點(diǎn)，但是人血清中含有的類風(fēng)濕因子對試劑盒檢測值易產(chǎn)生了干擾，使得個(gè)別類風(fēng)濕因子含量高的血清產(chǎn)生了測量值出現(xiàn)假陽性。此外現(xiàn)有的膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法通過物理吸附法把多克隆抗體標(biāo)記在不帶羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒上，該不帶羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒的穩(wěn)定性比較差，而且物理吸附的效果也不好，很容易會(huì)造成抗體從膠乳顆粒表面脫落。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種脂蛋白(a)檢測試劑盒，它通過化學(xué)交聯(lián)法把多克隆抗體標(biāo)記在表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒上的膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法，具有檢測靈敏度高，準(zhǔn)確度高，精密度好，檢測范圍內(nèi)線性好，穩(wěn)定性好，生產(chǎn)成本低，空白吸光度低且具有抗干擾性能的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種脂蛋白(a)檢測試劑盒，包括試劑R1、試劑R2及參考校準(zhǔn)品，其中試劑Rl為JEPES緩沖體系，包括:0.5 10g/LHEPES、2 20g/L氯化納、0.05 1.0ml/L吐溫-20、0.1 2g/L牛血清蛋白、5 25g/L聚乙二醇-6000、I 5g/L EDTA、0.1 2g/L Proclin300 ;試劑R2包括:采用化學(xué)交聯(lián)法制備得到的包被有抗人載脂蛋白(a)多克隆抗體的表面帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔?，0.5 10g/L HEPES緩沖液，阿斯巴甜，所述阿斯巴甜與試劑R2的重量體積比為0.01 0.5:100 (g/L);參考校準(zhǔn)品:為添加人重組載脂蛋白(a)的人血清或者類似血清基質(zhì)的液體，所述人重組載脂蛋白(a)蛋白由大腸桿菌或者酵母表達(dá)，經(jīng)過親和、離子交換純化后得到。上述類似血清基質(zhì)的液體即類似人血清基質(zhì)的溶液，如0.1%BSA, 0.9%NaCl，
0.2%NaN3,15mM 磷酸鹽緩沖液(pH7.5)。作為優(yōu)選，所述試劑Rl為I 5g/L HEPES、5 15g/L氯化納、0.1 0.5ml/L吐溫-20、0.5 1.5g/L 牛血清蛋白、10 20g/L 聚乙二醇 _6000、2 3g/L EDTA、0.2 Ig/L Proclin300o進(jìn)一步地，所述試劑Rl為1.5g/L HEPES、9g/L氯化納、0.2ml/L吐溫-20、lg/L牛血清蛋白、10g/L 聚乙二醇-6000、2.9g/L EDTA、0.9g/L Proclin300。進(jìn)一步地，所述HEPES的pH值為5.5 8.5。進(jìn)一步地，所述HEPES的pH值為7.0 7.8。 進(jìn)一步地，所述試劑Rl和試劑R2的容積比為4:1。進(jìn)一步地,所述試劑R2中聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锏钠骄綖?0 300nm。進(jìn)一步地，所述試劑R2中聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锏钠骄綖?00 200nm。進(jìn)一步地，所述試劑R2中阿斯巴甜與試劑R2的重量體積比為0.05 0.2:100(g/L)。更進(jìn)一步地，所述抗人載脂蛋白(a)多克隆抗體為羊抗人載脂蛋白(a)多克隆抗體。本發(fā)明中的試劑盒運(yùn)用了膠乳顆粒增強(qiáng)的免疫透射比濁法來測定血清中脂蛋白(a)的含量，其原理是將多克隆抗體通過化學(xué)交聯(lián)的方法包被在表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒上，多克隆抗體和生物樣本中(通常是指血液和尿液)相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合形成復(fù)合物后，使包被抗體的聚苯乙烯膠乳顆粒之間發(fā)生凝集。膠乳凝集的越多，越會(huì)阻礙光線的透過性，反應(yīng)液的吸光度就越大，反應(yīng)液吸光度的大小和膠乳顆粒凝集程度是成正比，即血液樣本中抗原的濃度是和反應(yīng)吸光度成正比。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明脂蛋白(a)檢測試劑盒的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:1.本發(fā)明的試劑盒采用化學(xué)交聯(lián)法把多克隆抗體標(biāo)記在表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒上。通過化學(xué)共價(jià)交聯(lián)，抗體和膠乳的結(jié)合力更強(qiáng)，包被了抗體的聚苯乙烯膠乳顆粒穩(wěn)定性更高。通過上述化學(xué)交聯(lián)方法制備的檢測試劑盒，具有靈敏度高，特異性好、準(zhǔn)確性高、抗干擾能力高及生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。2.本發(fā)明試劑盒中的試劑R2中含有阿司巴甜，從而可以減輕或者去除血清中類風(fēng)濕因子對試劑測值的干擾，避免對個(gè)別類風(fēng)濕因子含量高的血清產(chǎn)生測值假陽性的問題。


圖1所示的是本發(fā)明脂蛋白(a)檢測試劑盒的脂蛋白(a)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2所示的是本發(fā)明脂蛋白(a)檢測試劑盒的線性分析圖；圖3所示的是本發(fā)明脂蛋白(a)檢測試劑盒的相關(guān)性分析圖。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1脂蛋白(a)檢測試劑盒的制備和測定方法本發(fā)明的試劑盒涉及試劑的主要原材料如下:1.由本公司按照常規(guī)方法自制的羊抗人載脂蛋白(a)多克隆抗體，親和純化后采用間接ELISA法測定效價(jià)為1:100000，滿足本試劑的要求。該抗體特異性好，和其它抗原沒有交叉反應(yīng)。2.本發(fā)明僅采用帶羧基基團(tuán)的聚苯乙烯膠乳顆粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，相應(yīng)的檢測波長為600nmo3.重組載脂蛋白(a)由本公司自制，經(jīng)過大腸桿菌或者酵母表達(dá)，親和和離子交換純化后的載脂蛋白(a)，純度高，穩(wěn)定性好，用于作為本試劑的標(biāo)準(zhǔn)品。主要試劑和參考標(biāo)準(zhǔn)配制如下:試劑Rl為IOOmM HEPES緩沖液(pH7.5)。向該緩沖液中分別加入NaCl, BSA,吐溫-20，PEG6000, EDTA 和 Proclin300。各組分的終濃度分別為 0.9%NaCl,0.02% 吐溫-20，
0.1%BSA, 1%PEG6000和0.09%Proclin300。向緩沖液里添加完各組分后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值到 7.5。試劑R2:用IOOmM pH=6.0的MES (2_嗎啉乙磺酸緩沖液溶液)稀釋膠乳顆粒。該試劑為乳白色溶液。往膠乳溶液中加入EDAC，膠乳和EDAC的比例為10:1，混合均勻后，室溫下反應(yīng)15min，激活膠乳顆粒表面的羧基。反應(yīng)后離心去上清液后，用15mM磷酸鹽緩沖液(PH7.4)清洗膠乳顆粒。膠乳顆粒最終懸浮于15mM磷酸鹽緩沖液中。在室溫下，用15mM磷酸鹽緩沖液稀釋羊抗人載脂蛋白(a)多克隆抗體，最后加入到膠乳顆粒懸浮液中，將兩者混勻后在室溫下反應(yīng)3小時(shí)，抗體序列中的NH殘基和活化后的膠乳顆粒表面羧基進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，之后加入封閉液(含0.1%BSA甘氨酸緩沖液)封閉I小時(shí)，離心去上清，用IOmM HEPES緩沖液稀釋至濃度為0.5%，再加入0.1%阿斯巴甜后獲得試劑R2。脂蛋白(a)試劑參考標(biāo)準(zhǔn)品制備:純化好的重組載脂蛋白(a)蛋白，用相應(yīng)的類似人血清基質(zhì)的溶液(0.1%BSA,0.9%NaCl,0.2%NaN3,15mM磷酸鹽緩沖液pH7.5)進(jìn)行稀釋和過濾除菌，所述的脂蛋白(a)試劑盒校準(zhǔn)品中載脂蛋白(a)含量分別為0mg/L，112.5mg/L, 225mg/L, 450mg/L, 900mg/L,這些校準(zhǔn)品均為無色透明液體。以國外著名廠家的脂蛋白(a)試劑盒，分別對制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定和調(diào)整，調(diào)整合適后分別檢測20次，求出平均值達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品所要求的四個(gè)梯度的濃度，分別為112.5mg/L, 225mg/L, 450mg/L, 900mg/L，其中Omg/L為生理鹽水。脂蛋白(a)試劑測定方法是兩點(diǎn)終點(diǎn)法，檢測波長為600nm。試劑Rl和試劑R2的用量分別為240 ill和60 ill。樣本用量為4 ill ;反應(yīng)方向向上，測定溫度為37°C。樣本與試劑Rl混勻后，置37° C孵育5分鐘，之后加入試劑R2，即開始讀點(diǎn)，反應(yīng)5min后讀取另一點(diǎn)。使用日立7060自動(dòng)生化分析儀測得5種不同含量的脂蛋白(a)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示),其中X軸為脂蛋白(a)含量mg/1, Y軸為反應(yīng)吸光度。實(shí)施例2脂蛋白(a)檢測試劑盒在日立7060上各項(xiàng)性能指標(biāo)測試1.高值線性測定
添加重組載脂蛋白(a)于空白血清中，載脂蛋白(a)血清中的終濃度為IOOOmg/
I。用0.9%Nacl稀釋血清，得到5個(gè)含不同濃度載脂蛋白(a)的血清樣本。載脂蛋白(a)理論濃度分別為62.5mg/L, 125mg/L, 250mg/L, 500mg/L, 1000mg/L。把空白血清作為載脂蛋白(a)濃度為0的樣本。每個(gè)樣品用本發(fā)明中的脂蛋白(a)試劑盒測3次，取均值。對測定值進(jìn)行相關(guān)分析，從表I可見，本發(fā)明檢測試劑盒的最高檢測范圍可達(dá)到1000mg/L，見圖2，Y軸實(shí)測值，X軸理論值(載脂蛋白(a)的含量mg/L)，相關(guān)系數(shù)的R2=0.999，回歸方程Y=0.998x+l.514。說明本發(fā)明中脂蛋白(a)試劑盒線性好。表I
權(quán)利要求
1.一種脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，包括試劑R1、試劑R2及參考校準(zhǔn)品，其中 試劑Rl為ffiPES緩沖體系，包括:HEPES0.5 10g/L、氯化納2 20g/L、吐溫-200.05 1.0ml/L、牛血清蛋白 0.1 2g/L、聚乙二醇-60005_25g/L、EDTAl 5g/L、Proclin300 0.1 2g/L ； 試劑R2包括:采用化學(xué)交聯(lián)法制備得到的包被有抗人載脂蛋白(a)多克隆抗體的表面帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔铮?.5 10g/L HEPES緩沖液，阿斯巴甜，所述阿斯巴甜與試劑R2的重量體積比為0.01 0.5:100 (g/L);參考校準(zhǔn)品:為添加人重組載脂蛋白(a)的人血清或者類似血清基質(zhì)的液體，所述人重組載脂蛋白(a)蛋白由大腸桿菌或者酵母表達(dá)，經(jīng)過親和、離子交換純化后得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl為I 5g/L HEPES、5 15g/L 氯化納、0.1 0.5ml/L 吐溫 _20、0.5 1.5g/L 牛血清蛋白、10 20g/L 聚乙二醇-6000,2 3g/LEDTA、0.2 lg/L Proclin300。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑Rl為1.5g/L HEPES、9g/L 氯化納、0.2ml/L 吐溫-20、lg/L 牛血清蛋白、10g/L 聚乙二醇 _6000、2.9g/LEDTA、0.9g/L Proclin300o
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一權(quán)利要求所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述HEPES的pH值為5.5 8.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述HEPES的pH值為7.0 7.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl和試劑R2的容積比為4:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑R2中聚苯乙烯膠乳顆粒混合物的平均粒徑為60 300nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑R2中聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锏钠骄綖?00 200nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑R2中阿斯巴甜與試劑R2的重量體積比為0.05 0.2:100 (g/L)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述抗人載脂蛋白(a)多克隆抗體為羊抗人載脂蛋白(a)多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明為一種脂蛋白(a)檢測試劑盒，包括試劑R1、試劑R2及參考校準(zhǔn)品，其中試劑R1為HEPES緩沖體系，包括0.5～10g/L HEPES、2～20g/L氯化納、0.05～1.0ml/L吐溫-20、0.1～2g/L牛血清蛋白、5-25g/L聚乙二醇-6000、1～5g/L EDTA、0.1～2g/L Proclin300；試劑R2包括采用化學(xué)交聯(lián)法制備得到的包被有抗人載脂蛋白(a)多克隆抗體的表面帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔铮?.5～10g/L HEPES緩沖液，阿斯巴甜，所述阿斯巴甜與試劑R2的重量體積比為0.01～0.5100(g/L)。參考校準(zhǔn)品為添加人重組載脂蛋白(a)的人血清或者類似血清基質(zhì)的液體。本發(fā)明的試劑盒具有檢測靈敏度，準(zhǔn)確度高，精密度好，檢測范圍內(nèi)線性好，穩(wěn)定性好，生產(chǎn)成本低，空白吸光度低且具有抗干擾性能。
文檔編號(hào)G01N33/92GK103149370SQ201310061668
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月27日
發(fā)明者鄒炳德, 鄒繼華, 方亮, 劉獻(xiàn)文, 周海濱 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司