一種間接競爭酶連適配體檢測土霉素殘留的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測食品中土霉素殘留的間接競爭酶聯(lián)適配體分析方法（ELAA），屬于食品安全分析領域。利用人工合成的土霉素適配體代替抗體，建立了土霉素的間接競爭ELAA方法。標準曲線的線性范圍為0.5-50ng/mL，半數(shù)抑制量(IC50)為6.30ng/mL，靈敏度（IC90）0.5ng/mL。以禽肉、水產(chǎn)品、牛奶、奶粉和蜂蜜基質(zhì)添加不同濃度的土霉素后，用ELAA方法測定，加標回收率為62.1%-102%，變異系數(shù)（CV）<20%。本發(fā)明建立的方法不僅具有ELISA的操作簡單、檢測快速、分析容量大等優(yōu)點；而且又克服了抗體制備過程繁瑣、周期長、費用高的問題；適用于大批量樣本檢測和現(xiàn)場監(jiān)測，具有重要的實際應用意義。
【專利說明】一種間接競爭酶連適配體檢測土霉素殘留的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測食品中土霉素殘留的酶聯(lián)適配體分析方法（ELAA)，屬于食品 安全分析【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 土霉素（Oxytetracycline，0TC)，別名5-羥基四環(huán)素，地霉素，地靈霉素，氧四環(huán) 素等，是一種廣譜抗菌藥物，常作為牛、豬、家禽、魚等動物疾病的預防和感染的治療用藥， 且由于其廣譜抗菌活性和低費用常被用作畜禽的抗菌促生長添加劑。但目前一些養(yǎng)殖者盲 目追求利益，不遵守休藥期規(guī)定，造成畜禽和水產(chǎn)品中土霉素殘留嚴重，經(jīng)過食物鏈被人體 吸收后，可導致骨骼缺鈣和造成肝損害，最明顯的殘留毒性是誘導耐藥菌株。另外，土霉素 在畜禽體內(nèi)60%_90%以藥物原形或初級代謝產(chǎn)物的形式隨糞尿等排泄物進入環(huán)境，給對地 表水、農(nóng)田土壤甚至地下水造成污染，這將導致對人類公共健康產(chǎn)生嚴重威脅。許多國家對 抗生素殘留實行監(jiān)控，世界糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、歐盟及我國政府規(guī)定土霉素的殘留限 量不得高于l〇〇mg/kg。因此，加快對土霉素殘留的檢測的探究，建立高靈敏、準確、快速的檢 測方法，對保障我國食品安全和消費者健康具有重要意義。
[0003] 目前，檢測土霉素（Tetracyclines)的方法主要有高效液相色譜法（HPLC)、毛細 管電泳技術（CE)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS)、薄層色譜法（TCL)流動注射電化學發(fā) 光法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、膠體金免疫層析分析法（GICA)等。儀器分析方法雖然靈 敏度高、結(jié)果準確可靠等優(yōu)點，但設備昂貴、操作復雜，檢測時間長，不能滿足大批量樣品篩 選和現(xiàn)場快速檢測的需要?？焖贆z測方法通常采用抗原抗體特異相互作用識別模式，其中 以ELISA和GICA方法應用最多。但由于受到抗體易失活、制備依賴免疫動物和細胞、且繁 瑣費時、一些小分子物質(zhì)難以產(chǎn)生特異性抗體等因素的影響，在一定程度上限制了抗體在 快速檢測技術的應用。
[0004] 核酸適配體(Aptamer)技術的出現(xiàn)彌補了抗體在相關檢測領域中應用的不 足。Aptamer作為一種新型的識別分子，是采用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩 選出的能與靶物質(zhì)高特異性、高親和力結(jié)合的配體。其空間結(jié)構(gòu)的多樣性幾乎可以與所有 種類的靶分子(細胞因子、蛋白、生物毒素、金屬離子、小分子物質(zhì)、細胞、微生物等）發(fā)生結(jié) 合。與傳統(tǒng)的抗體相比，具有適應范圍廣；高親和力和特異性，不受免疫條件和免疫原性限 制；制備簡單，可體外人工合成；變性與復性可逆，性質(zhì)穩(wěn)定；易于標記，可反復使用和長期 保存等優(yōu)點。顯然，適配體的這些特點對于發(fā)展高靈敏、高選擇性、快速高通量的靶標分子 檢測十分重要，并日漸成為分析化學領域研究和應用的焦點。
[0005] 目前已有關于酶聯(lián)適配體檢測土霉素相關文獻的報道，如劉賓（暨南大學碩士論 文）建立了基于配適體的生物素-親和素酶聯(lián)檢測土霉素的分析方法，但檢測限低（I. 5g/ L)，高于世界糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、歐盟及我國政府對食品中土霉素殘留限量的規(guī)定 (100 mg/L)，不能滿足對土霉素檢測的需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足而提供一種檢測食品中土霉素含量的酶聯(lián) 適配體分析方法，其特點是以適配體代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體，基于抗原和適配體特異性結(jié)合而建立 的分析方法。該方法不需要制備抗體，操作簡便，靈敏度高，特異性強，能夠批量、快速檢測 食品中土霉素的殘留。
[0007] 本發(fā)明所提供的食品中土霉素殘留酶聯(lián)適配體（ELAA)檢測方法，通過以下步驟實 現(xiàn)。
[0008] I. BSA-土霉素包被原的制備：采用文獻（21^叩￥，1^5，1^111，6七&1.工 Agric. Food Chem. 2007，55，211-218)報道的鄰聯(lián)甲苯胺法將土霉素標準品通過同型 雙功能團試劑（〇-tolidine)與牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)得到包被原。將BSA或0VA、0TC和 偶聯(lián)產(chǎn)物，于波長190?600nm下進行掃描鑒定。
[0009] 2.間接競爭性ELAA方法。
[0010] (1)包被抗原：每孔加IOOu L 1600X稀釋的包被抗原0TC-BSA，4°C孵育過夜， PBST緩沖液洗滌液3?5次，拍干。
[0011] (2)封閉：每孔加入200 L的封閉液，37°C孵育2h，PBST洗滌后烘干備用。
[0012] (3)加樣：每孔依次加入50 ii L待測樣品或稀釋好的標品溶液，然后加入50 ii L 2nmol/L的適配體，37°C孵育lh，后洗滌液洗滌3?5次，拍干。
[0013] (4)酶標親和素：每孔加入IOOii L 4000X稀釋的酶標親和素（Avidin/HRP)， 37°C孵育lh，后洗滌液洗滌3?5次，拍干。
[0014] (5)顯色反應：每孔加入IOOiiL TMB底物顯色液，37°C避光反應15min。
[0015] (6)終止：每孔加入100 ii L終止液終止反應，酶標儀450nm測吸光值。
[0016] 3.標準曲線的繪制。
[0017] 以不同土霉素濃度的對數(shù)為橫坐標，以抑制率為縱坐標作圖，繪制標準曲線。 Btl :標準濃度為Ong/mL所對應的吸光度；B :其它標準濃度所對應的吸光度。
[0018] 4.樣品制備。
[0019] (1)溶液配制。
[0020] 三氯乙酸溶液（I. 25g/L):取三氯乙酸I. 25g，加超純水溶解并稀釋至1000mL。
[0021] 0? 05% Tween-20 :取 Tween-20 0? 5mL，加超純水稀釋至 1000mL。
[0022] 甲醇：分析純。
[0023] 提取液：將三氯乙酸溶液（I. 25g/L)、0? 05%Tween-20和甲醇以4:1:1體積比混合， 添加0. 05%巰基乙醇，使用前用超純水稀釋一倍。
[0024] PBS 緩沖液：2. 9g Na2HPO4 ? 12H20,0? 25g KH2PO4 ? 2H20,8g NaCl，0? 2g KCl，超純水 定容至 lOOOmL，調(diào) pH=7. 4。
[0025] ( 2 )組織樣品前處理方法。
[0026] 稱取Ig組織樣品于50mL離心管中，加入4mL提取液，潤旋lOmin，15000r/min離 心10min。取上清液50uL，加入450 ii L PBS緩沖液（pH 7. 4)，渦旋混勻，取IOOii L用于ELAA 分析。
[0027] ( 3 )牛奶前處理方法。
[0028] 量取牛奶樣品5. OmL,加提取液5. OmL,潤旋lOmin，15000r/min離心lOmin。棄去 脂肪層，吸取清液50 ii L加入950 ii L PBS緩沖液，渦旋混勻，取100 ii L用于ELAA分析。
[0029] (4)奶粉前處理方法。
[0030] 稱取Ig奶粉于50mL離心管中，加入IOmL提取液，潤旋lOmin，15000r/min離心 lOmin。取上清液50 iiL，加入450 ii L PBS緩沖液（pH 7. 4)，渦旋混勻，取IOOii L用于ELAA 分析。
[0031] (5)蜂蜜前處理方法。
[0032] 準確稱取0? 5g蜂蜜樣本于50mL旋蓋離心管中，加入IOmL PBS緩沖液（pH 7. 4)， 潤旋2min，超聲5min，取上清液100 ii L用于ELAA分析。
[0033] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有效效果：（1)不需要制備抗體，適配體可體外人工合 成，制備簡單；（2)靈敏度高，特異性強；（3)檢測成本低于傳統(tǒng)的免疫分析方法；（4)前處 理簡單；（5)適用于食品中土霉素殘留的檢測，并能同時測定大批量樣品，為土霉素殘留檢 測提供了快速高效的檢測手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1為土霉素-BSA包被原紫外掃描圖。
[0035] 圖2為土霉素的ELAA標準曲線。
[0036] 附圖標號說明：A :BSA，B :土霉素，C :0TC-0-〇lidine-BSA 復合物。

【具體實施方式】
[0037] 下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0038] 本發(fā)明實施例中所用的包被原是根據(jù)文獻（Zhang Y，Lu S，Liu W，et al. J. Agric. Food Chem. 2007，55，211-218)合成。適配體是根據(jù)文獻（Niazi J H.，Lee S J，GuMB. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008，16，7245-7253)報道，由上海生 物工程技術有限公司合成。
[0039] 實施例I : BSA-土霉素包被原的制備。
[0040] 稱取聯(lián)鄰甲苯胺（0-tolidine) 125mg，溶于 22. 5mL 的冰冷 HCl (0? 2mol/L)，然 后逐漸滴加NaNO2 (35mg/mL)溶液2. 5mL，4°C避光反應lh，得到A液備用。取鹽酸土霉素 0. 08mg，溶于0. 8mL的純水中；稱量BSA 0. 145mg，溶于IOmL硼砂緩沖液中（pH 8. 5)。將土 霉素溶液和A液同時加入到BSA溶液中,將反應液置于避光反應2h。將偶聯(lián)得到包被原溶 液用PBS緩沖液在0?4°C透析3?4天，每隔6?8 h換透析液，于波長190-600nm下進 行掃描鑒定(見圖1)。將透析袋內(nèi)的反應溶液10000 r/min離心IOmin,棄去沉淀，將上清 液冷凍干燥，獲得的土霉素包被原（OTC-0-olidine-BSA)，于-20°C保存。
[0041] 實施例2 :ELAA方法的建立。
[0042] 1.溶液的配置。
[0043] (1)磷酸緩沖液（PBS, 0.01 mol/L) NaCl 8. 0g，KCl 0? 2g，KH2PO4 0? 2g，Na2HPO4. 12H20 2. 9g，加超純水定容至 1000mL。
[0044] (2)包被緩沖液（0.05mol/L，pH 9.6) :Na2C03 1.59g，NaHCO3 2.93g，加超純水定 容至 lOOOmL。
[0045] (3)洗滌液（PBST):含 0? 05%Tween_20 的 PBS 溶液。
[0046] (4)封閉液：含有0? 1%BSA的包被緩沖液。
[0047] (5)適配體稀釋液：含0? 1%BSA的洗滌緩沖液。
[0048] (6)顯色液4液：似2冊04.121120 3.688，檸檬酸 0.9938，181^30%11202，加超純水至 100mL。B液：60mg TMB溶于100 mL乙二醇。使用前將A液和B液以5:1體積混合，現(xiàn)配現(xiàn) 用。
[0049] (7)終止液：2mol/L H2S04。
[0050] 2.間接競爭ELAA反應步驟。
[0051] (1)將包被原用碳酸鹽緩沖液稀釋包被于酶標板，IOOu L/孔，4°C孵育過夜，PBST 洗滌3?5次，拍干。
[0052] (2)用封閉緩沖液封閉酶標板，200 L/孔，37°C溫育2h，PBST洗滌后烘干備用。
[0053] (3)用PBS緩沖液土霉素標準品稀釋成0,0. 5,1，2, 5,10, 50 ng/mL系列濃度，將系 列標準品及處理好的樣品分別加入對應的酶標孔中，50 y L/孔，然后每孔加入50 y L的生 物素標記的適配體，37°C溫育Ih后洗滌、拍干。
[0054] (4)加入辣根過氧化物酶標記的親和素（Avidin/HRP)，每孔IOOii L，37°C作用Ih 后洗滌、拍干。
[0055] (5)加入 TMB 顯色液,每孔 100 ii L，37°C顯色 15min。
[0056] (6)加入終止液，每孔100 ii L，終止反應。酶標儀450nm測吸光值，根據(jù)標準曲線 對比計算出待測樣品的土霉素含量。
[0057] 3. ELAA條件的優(yōu)化。
[0058] 實驗對包被原濃度、封閉液、適配體和酶標親和素濃度等做了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為： 包被原稀釋度為1: 1600,適配體濃度為2 nmol/L，酶標親和素稀釋度為1: 4000,封閉液 選擇含0. 1%BSA的0. 05 nmol/L的碳酸鹽緩沖液。
[0059] 實施例3 :標準曲線及靈敏度。
[0060] 應用實施例2中的間接競爭ELAA法測定土霉素適配體對不同濃度土霉素的抑制 情況。土霉素的系列標準濃度為0,0. 5,1，2, 5,10, 50ng/mL，以不同土霉素濃度的對數(shù)值為 橫坐標，抑制率B/X為縱坐標（B: 土霉素標品各濃度對應的吸光值；Btl :土霉素標品濃度為 Ong/mL時所對應的吸光值)，繪制標準曲線，建立回歸方程，計算半數(shù)抑制量（即IC5tl值：抑 制率為50%所對應的藥物濃度)。圖1為6次ELAA測定的平均標準曲線，該標曲的IC 5tl值 為6. 30ng/mL，線性范圍為0. 5-50ng/mL，IC9tl即靈敏度(所得90%空白孔所對應的的標準品 濃度）為 〇? 5 ng/mL。
[0061] 實例4 :間接ELAA方法的評估。
[0062] 1.特異性。
[0063] 選擇結(jié)構(gòu)類似物金霉素、四環(huán)素和強力霉素為待測物，采用間接競爭ELAA程序檢 測各抑制物的IC 5tl值，計算交叉反應率（CR%)。交叉反應率越小，ELAA特異性越強，反之特 異性差。
[0064] 交叉反應率（CR%)= IC5tl (土霉素）/ IC5tl (測試物）X 100%。
[0065] 交叉結(jié)果見表1，對土霉素的交叉反應率為100%，與四環(huán)素、金霉素和強力霉素的 交叉反應率分別為12. 6%、7. 5%和2. 9%，結(jié)果表明，適配體對其他結(jié)構(gòu)類似物無明顯交叉反 應，說明適配體特異性好，可以確保對樣品中土霉素殘留測定結(jié)果的可靠性。

【權(quán)利要求】
1. 一種間接競爭酶連適配體檢測土霉素殘留的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步驟：步驟一：土霉素包被原的制備；步驟二：建立測定土霉素的酶聯(lián)適配體分析方法 (ELAA);步驟三：采用ELAA對加標樣品中土霉素含量的測定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間接競爭酶連適配體檢測土霉素殘留的方法，其 特征在于：所述的包被原是采用鄰聯(lián)甲苯胺法將土霉素標準品通過同型雙功能團試劑 (O-tolidine)與載體蛋白偶聯(lián)獲得的偶聯(lián)物，其載體蛋白可以是BSA，也可以是OVA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間接競爭酶連適配體檢測土霉素殘留的方法，其中 所述步驟二包括：（1).以碳酸鹽緩沖溶液稀釋包被抗原1 : 1600,加入酶標板中，每 孔100ii L，4°C孵育過夜，PBST緩沖液洗滌液3?5次，拍干；（2).每孔加入200ii L含 0. 1%BSA的上述碳酸鹽緩沖液作為封閉液，37°C孵育2h，PBST洗滌后烘干備用；（3).用PBS 緩沖液將土霉素標準品稀釋成〇, 〇. 5,1，2, 5,10, 50 ng/mL系列濃度，將上述稀釋后的標準 品及處理好的樣品，分別加入到各自的酶標孔中，加50 y L/孔；以適配體稀釋液將生物素 標記的適配體稀釋成2nmol/L，然后每孔加入50y L，37°C溫育lh，然后以PBST洗滌液洗 滌3?5次，拍干；（4)將辣根過氧化物酶標記的親和素（Avidin/HRP)用適配體稀釋液以 1 : 4000進行稀釋，然后每孔加入100iiL，37°C作用lh后以PBST洗滌液洗滌3?5次； 拍干；（5)每孔加入TMB顯色液100iiL，37°C顯色15min ;(6)加入終止液2mol/L硫酸溶 液，每孔100UL ;酶標儀450nm測吸光值，根據(jù)標準品制備的標準曲線對比計算出待測樣 品的土霉素含量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（3)中所述土霉素適配體的核苷酸序 為 5, -CGT ACG GAA TTC GCT AGC GGG CGG GGG TGC TGG GGG AAT GGA GTG CTG CGT GCT GCG GGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3'，并且所示序列5'端修飾了生物素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（1)中所述包被緩沖液為0.05mol/ L的碳酸鹽緩沖液（pH 9. 6);步驟（2)中的封閉液為含0. 1%BSA的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖 液；步驟（3)和（4)中的適配體稀釋液含0. 1%BSA的PBST溶液；步驟（6)終止液為2mol/L 的硫酸溶液；步驟（1)?（4)中PBST洗滌液為含0? 05% Tween-20的0? 01mol/L PBS溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種間接競爭酶連適配體檢測土霉素殘留的方法，其中所述 步驟三包括：（1)組織樣品前處理方法：稱取lg組織樣品于50mL離心管中，加入4mL提 取液，潤旋l〇min，15000r/min離心10min ;取上清液50uL，加入450 y L PBS緩沖液（pH 7. 4)，渦旋混勻，取100 ii L用于ELAA分析；（2)牛奶前處理方法：量取牛奶樣品5. OmL，加提 取液5. OmL，潤旋10min，15000r/min離心10min ;棄去脂肪層，吸取清液50 y L加入950 y L PBS緩沖液，渦旋混勻，取100 yL用于ELAA分析；（3)奶粉前處理方法：稱取lg奶粉于 50mL離心管中，加入10mL提取液，潤旋10min，15000r/min離心10min ;取上清液50iiL， 加入450 iiL PBS緩沖液（pH 7. 4)，渦旋混勻，取100 iiL用于ELAA分析；（4)蜂蜜前處理 方法：準確稱取0. 5g蜂蜜樣本于50mL旋蓋離心管中，加入10mL PBS緩沖液（pH 7. 4)，渦 旋2min，超聲5min，取上清液100 y L用于ELAA分析。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其中所述的提取液為三氯乙酸溶液（1.25g/L)、 Tween-20 (0. 05%)和甲醇以4:1:1體積比混合，添加0. 05%巰基乙醇，使用前用超純水稀釋 一倍。
【文檔編號】G01N33/543GK104374907SQ201310404954
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】盧春霞, 唐宗貴, 羅小玲, 劉長彬, 康立超, 李紅敏, 陳霞, 王靜, 劉成江, 李宇輝, 侯小林 申請人:新疆農(nóng)墾科學院