專利名稱：用于酶抑制的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于酶抑制的化合物和方法。本發(fā)明特別涉及基于酶抑制作用的治療方法。
背景技術(shù)：
在真核生物中，蛋白質(zhì)的降解主要是通過泛蛋白途徑介導(dǎo)的，其中需要破壞的靶蛋白與76個氨基酸多肽泛蛋白相連接。一旦與靶蛋白連接，泛蛋白化蛋白質(zhì)就充當(dāng)26S蛋白酶體的底物，26S蛋白酶體是一種多催化功能蛋白酶，通過其三種主要的蛋白水解活性將蛋白質(zhì)切割成為短肽。盡管蛋白酶體介導(dǎo)的降解在胞內(nèi)蛋白質(zhì)更新中具有基本功能，但是 它在I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)呈遞、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂和NF-κ B激活等許多過程中都具有關(guān)鍵性作用。20S蛋白酶體是一種700kDa圓柱形多催化功能蛋白酶復(fù)合體，由28個亞基組成，這28個亞基構(gòu)成4個環(huán)，在細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、I類主要組織相容性復(fù)合體呈遞、細(xì)胞凋亡、抗原加工、NF- K B激活和促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的作用。在酵母和其它真核生物中，7個不同的α亞基構(gòu)成外環(huán)，7個不同的β亞基構(gòu)成內(nèi)環(huán)。α亞基用作19S(PA700)和11S(PA28)調(diào)節(jié)復(fù)合體的結(jié)合位點(diǎn)，還用作2個β亞基環(huán)構(gòu)成的內(nèi)部蛋白水解腔的物理屏障。因此，一般認(rèn)為蛋白酶體在體內(nèi)以26S顆粒(“26S蛋白酶體”)存在。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，抑制20S形式的蛋白酶體，很容易與抑制26S蛋白酶體聯(lián)系起來。在顆粒形成期間，切割β亞基氨基端前序列后，用作催化親核基團(tuán)的氨基端蘇氨酸殘基被暴露出來。因此，蛋白酶體中負(fù)責(zé)催化活性的亞基具有氨基端親核殘基，這些亞基屬于N端親核(Ntn)水解酶家族(例如，親核N端殘基為Cys、Ser, Thr和其它親核部分)。該家族包括例如青霉素G?；D(zhuǎn)移酶(PGA)、青霉素V?；D(zhuǎn)移酶(PVA)、谷氨酰胺PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶(GAT)和細(xì)菌糖基天冬酰胺酶。高等脊椎動物除了具有普遍表達(dá)的β亞基以外，還具有三種Y-干擾素-誘導(dǎo)性β亞基(LMP7、LMP2和MECL1)，它們分別替代其正常對應(yīng)物X、Y和Ζ，由此改變蛋白酶體的催化活性。通過利用不同的肽底物，已定義了真核生物20S蛋白酶體的三種主要蛋白水解活性胰凝乳蛋白酶樣活性(CT-L)，它在大的疏水殘基后切割；胰蛋白酶樣活性(T-L)，它在堿性殘基后切割；肽基谷氨酰肽水解活性(PGPH)，它在酸性殘基后切割。蛋白酶體還有另外兩個次要的特征性活性=BrAAP活性，它在支鏈氨基酸后切割；SNAAP活性，它在小的中性氨基酸后切割。蛋白酶體的主要蛋白水解活性似乎是受益于不同的催化位點(diǎn)，因?yàn)橐种苿?、β亞基中的點(diǎn)突變以及Y干擾素誘導(dǎo)性β亞基互換使這些活性發(fā)生不同程度的變化。雖然有多種用于抑制蛋白酶體活性的小分子實(shí)例，但是這些化合物通常缺乏開發(fā)利用細(xì)胞水平和分子水平上的蛋白酶體作用所必需的特異性、穩(wěn)定性或功效。因此，需要合成位點(diǎn)特異性增加、穩(wěn)定性和溶解性改善以及功效提高的小分子抑制劑，以研究細(xì)胞水平和分子水平上的蛋白酶體作用。
發(fā)明概沭本發(fā)明涉及通常稱為肽α ’，β ’ -環(huán)氧化物和肽α ’，β ’ -氮丙啶的分子。我們認(rèn)為母體分子可有效地、不可逆地、選擇性地與N端親核(Ntn)水解酶結(jié)合，并且可以特異性地抑制具有多催化活性的酶的某些特殊活性。曾經(jīng)認(rèn)為，蛋白酶體僅僅負(fù)責(zé)破壞變性蛋白和錯折疊蛋白，但是現(xiàn)在認(rèn)為蛋白酶體是組成型蛋白水解機(jī)器，通過信號依賴性方式的降解作用來調(diào)節(jié)各種胞內(nèi)蛋白水平。因此，非常有益的是，鑒定出能夠特異性干擾蛋白酶體活性和其它Ntn水解酶活性的試劑，從而用作探針以研究這些酶在生物過程中的作用。本文描述、合成并研究了靶向Ntn水解酶的化合物。本文公開了能夠有效地、選擇性地、不可逆地抑制特定蛋白酶體活性的肽環(huán)氧化物和肽氮丙啶，并且要求保護(hù)這些化合物。與其它幾種基于肽的抑制劑不同，本文描述的肽環(huán)氧化物和肽氮丙啶在高達(dá)50 μ M的濃度下不會明顯抑制非蛋白酶體的蛋白酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶B、木瓜蛋白酶和鈣蛋白酶。在更高濃度時(shí)，可能會觀察到抑制作用，但是如果所述抑 制劑僅僅與底物競爭，將是競爭性的且可逆的抑制。新的肽環(huán)氧化物和肽氮丙啶還可抑制NF-κ B激活以及穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)物中的ρ53水平。此外，這些化合物具有抗炎活性。因而，這些化合物可以是獨(dú)特的多功能分子探針，用于研究Ntn酶在正常生物過程及病理過程中的功能。一方面，本發(fā)明提供含有三元雜環(huán)的抑制劑。這些抑制劑在約50 μ M以下的濃度時(shí)，可以抑制N端親核水解酶(例如20S蛋白酶體或26S蛋白酶體)的催化活性。關(guān)于20S蛋白酶體，特定的水解酶抑制劑在約5μΜ以下的濃度時(shí)，抑制20S蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性，而不會抑制20S蛋白酶體的胰蛋白酶樣活性或PGPH活性。所述水解酶抑制劑可以是例如肽α ’，β ’ -環(huán)氧酮或α ’，β 氮丙啶酮，所述肽可以是四肽。所述肽可以包含支鏈或直鏈的側(cè)鏈，例如氫、C1^6烷基、CV6羥基烷基、C1^6烷氧基烷基、芳基、C1^6芳烷基、C1-S燒基酸胺、Cu燒基胺、CV6竣酸、Cu竣基酷、CV6燒基硫醇或CV6燒基硫釀，例如異丁基、
I-萘基、苯基甲基和2-苯基乙基。α’，β’-環(huán)氧酮或α’，β’-氮丙啶酮的α’-碳可以為手性碳原子，例如(R)或β構(gòu)型的碳，正如本文定義的手性碳原子。另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其中包含藥學(xué)上可接受的載體和藥用有效量的水解酶抑制劑，它改善神經(jīng)變性性疾病(例如阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease))、肌肉萎縮病、癌癥、慢性傳染病、發(fā)熱、肌肉廢用、去神經(jīng)、神經(jīng)損傷、禁食和免疫相關(guān)性疾病等的效應(yīng)。另一方面，本發(fā)明提供抗炎組合物。另一方面，本發(fā)明提供以下的方法抑制或減輕患者的HIV感染；影響患者的病毒基因表達(dá)水平；改變生物體的蛋白酶體產(chǎn)生的各種抗原肽；測定生物體的細(xì)胞、發(fā)育或生理過程或輸出量是否由特定Ntn水解酶的蛋白水解活性調(diào)節(jié)；治療患者的阿爾茨海默??；降低細(xì)胞的肌肉蛋白降解速率；降低細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白降解速率；降低細(xì)胞的P53蛋白降解速率；抑制患者的P53相關(guān)性癌生長；抑制細(xì)胞的抗原呈遞；抑制患者的免疫系統(tǒng)；抑制生物體的ΙκΒ-α降解；減少細(xì)胞、肌肉、器官或患者的NF-κ B含量；影響細(xì)胞周期蛋白依賴性真核細(xì)胞周期；治療患者的增殖性疾病；影響細(xì)胞的癌基因蛋白的蛋白酶體依賴性調(diào)節(jié)；治療患者的癌生長；治療患者的Ρ53相關(guān)性細(xì)胞凋亡；篩選細(xì)胞的N端親核水解酶加工的蛋白。所有上述方法都包括對患者、細(xì)胞、組織、器官或生物體給予或使其接觸有效量的含有本文公開的水解酶抑制劑的組合物。根據(jù)下面的發(fā)明詳述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將會是顯而易見的。發(fā)明詳沭本發(fā)明涉及可用作酶抑制劑的化合物。這些化合物通?？捎糜谝种圃贜端具有親核基團(tuán)的酶。例如，含有在側(cè)鏈具有親核基團(tuán)的N端氨基酸(例如蘇氨酸、絲氨酸或半胱氨酸)的酶或酶亞基的活性，可以被本文描述的酶抑制劑成功地抑制。在N端具有非氨基酸親核基團(tuán)(例如保護(hù)基或糖基)的酶或酶亞基的活性，也可以被本文描述的酶抑制劑成功地抑制。
雖然不希望受任何具體理論的束縛，但是認(rèn)為Ntn的N端親核基團(tuán)與本發(fā)明酶抑制劑的環(huán)氧官能團(tuán)形成共價(jià)加合物。例如，在20S蛋白酶體的β 5/Pre2亞基中，一般認(rèn)為，N端蘇氨酸在與下文描述的肽環(huán)氧化物或肽氮丙啶反應(yīng)后，不可逆地形成嗎啉代或哌嗪基加合物。以上加合物形成過程將涉及環(huán)氧化物或氮丙啶的開環(huán)裂解。在含有連接至α ’碳的基團(tuán)的實(shí)施方案中，α 碳(構(gòu)成環(huán)氧環(huán)或氮丙啶環(huán)部分的碳)的立體化學(xué)構(gòu)型可以是(R)或(S)。本發(fā)明在某種程度上基于本文公開的結(jié)構(gòu)-功能信息，這些信息表明了下述的優(yōu)選立體化學(xué)關(guān)系。注意，優(yōu)選的化合物可能含有多個立體中心，這些立體中心具有所指出的上-下關(guān)系(或者關(guān)系，其中圖示的β在紙平面之上)或(R)-(S)關(guān)系(即不需要化合物中所有立體中心都符合指出的優(yōu)選狀態(tài))。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，α ’碳的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)是(R)，即X原子為β或在分子平面之上。關(guān)于立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，遵循測定絕對立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的Cahn-Ingold-Prelog規(guī)則。例如，QrRanic Chemistry (Fox 和 Whitesell ；Jones and Bartlett Publishers, Boston,MA(1994);第5-6節(jié)，第177-178頁，該節(jié)內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)介紹了這些規(guī)則。肽類可以具有重復(fù)的主鏈結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈從主鏈單元延伸出來。通常，每個主鏈單元都有與其連接的側(cè)鏈，雖然在某些情況下，側(cè)鏈?zhǔn)菤湓?。在其它?shí)施方案中，并不是所有主鏈單元都連接有側(cè)鏈?？捎糜陔沫h(huán)氧化物或肽氮丙啶的肽具有兩個以上的主鏈單元。在某些可用于抑制蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣(CT-L)活性的實(shí)施方案中，存在2-8個主鏈單元，而在某些可用于CT-L抑制的優(yōu)選實(shí)施方案中，存在2-6個主鏈單元。從主鏈單元伸出的側(cè)鏈可包括天然脂族或芳族氨基酸側(cè)鏈，例如氫(甘氨酸)、甲基(丙氨酸)、異丙基(纈氨酸)、仲丁基(異亮氨酸)、異丁基(亮氨酸)、苯基甲基(苯丙氨酸)以及構(gòu)成氨基酸脯氨酸的側(cè)鏈。側(cè)鏈還可以是其它支鏈或直鏈的脂族或芳族基團(tuán)，例如乙基、正丙基、正丁基、叔丁基和芳基取代的衍生基團(tuán)，例如I-苯基乙基、2-苯基乙基、(1_萘基)甲基、(2-萘基)甲基、1_(1_萘基)乙基、1_(2_萘基)乙基、2_(1_萘基)乙基、2-(2-萘基)乙基和類似組合基團(tuán)。所述芳基可以被以下基團(tuán)進(jìn)一步取代支鏈或直鏈CV6烷基、取代的烷基、乙酰基等，或者其它芳基或取代的芳基(例如苯甲?；?。雜芳基也可用作側(cè)鏈取代基。雜芳基包括含氮、氧和硫的芳基，例如噻吩基、苯并噻吩基、萘并噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、異苯并呋喃基、苯并吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、噴噪基、嘿吟基、喧琳基等。在某些實(shí)施方案中，極性或帶電殘基可以被引入肽環(huán)氧化物或肽氮丙啶。舉例來講，可以引入天然存在的氨基酸，例如含羥基氨基酸(Thr、Tyr, Ser)或含硫氨基酸(Met、Cys)，以及非必需氨基酸，例如氨基乙磺酸、肉堿、瓜氨酸、胱氨酸、鳥氨酸和正亮氨酸等。也可以包含非天然存在的含帶電或極性部分的側(cè)鏈取代基，例如含一個或多個羥基、短鏈烷氧基、硫基、硫代、竣基、酷基、_■氧憐基、酸胺基或氣基的CV6燒基或C6_12芳基，或者被一個或多個鹵素原子取代的上述取代基。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，在肽部分的側(cè)鏈上存在至少一個芳基。在部分實(shí)施方案中，主鏈單元為酰胺單元[_NH-CHR-C( = O)-]，其中R為側(cè)鏈。這樣的表示方法沒有排除天然存在的氨基酸脯氨酸或其它非天然存在的環(huán)狀仲氨基酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解這一點(diǎn)。在其它實(shí)施方案中，主鏈單元為N-烷基化酰胺單元(例如N-甲基等)、烯烴類似物(其中一個或多個酰胺鍵被烯鍵置換)、四唑類似物(其中四唑環(huán)使主鏈呈順式構(gòu)型)、或者這些主鏈鍵的組合。在另外一些實(shí)施方案中，氨基酸α-碳被α-烷基取代修飾，例如氨基異丁酸。在另外一些實(shí)施方案中，側(cè)鏈被局部修飾，例如通過ΛΕ或Az脫氫修飾，其中雙鍵位于側(cè)鏈的α和β原子之間，或者例如通過ΛΕ或ΛΖ環(huán)丙基修飾，其中 環(huán)丙基位于側(cè)鏈的α和β原子之間。在另外一些利用氨基酸基團(tuán)的實(shí)施方案中，可以使用D-氨基酸。其它實(shí)施方案可以包括側(cè)鏈與主鏈環(huán)化、形成二硫鍵、形成內(nèi)酰胺、形成偶氮鍵以及下述文獻(xiàn)闡述的其它修飾Hruby和Boteju :“PeptideS and Mimics, Designof Conformationally Constrained”，Robert A. Meyers 主編,Molecular Biology andBiotechnology A Comprehensive Desk Reference”，VCH Publishers(1995),第 658-664頁，通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明一方面涉及具有結(jié)構(gòu)式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
權(quán)利要求
1.一種具有下式(III)結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
2.權(quán)利要求I的化合物，其中X為OA1、! 2和R3獨(dú)立選自Cu烷基和CV6芳烷基；R7和R8獨(dú)立選自氫和C1^烷基。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中R1和R3均為C^6烷基；R2為CV6芳烷基；R7和R8獨(dú)立選自氫和甲基。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中R1和R3均為異丁基、R2為苯基甲基，R7和R8均為氫。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中R5為氫，L為C=O或SO2,R6為Ar-Y-0
6.權(quán)利要求5的化合物，其中各個Ar獨(dú)立選自苯基、吲哚基、苯并呋喃基、萘基、喹啉基、喹諾酮基、噻吩基、吡啶基和吡唑基。
7.權(quán)利要求I的化合物，其中Ar被Ar-Q-取代，Q選自化學(xué)鍵、-O-和C^6烷基。
8.權(quán)利要求5的化合物，其中Z為Cu烷基。
9.權(quán)利要求8的化合物，其中Z被Ar取代。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中Ar為苯基。
11.權(quán)利要求4的化合物，其中R5為氫，L為C=O或S02，Z不存在，R6選自Ar-Y和雜環(huán)基。
12.權(quán)利要求11的化合物，其中R5選自色酮基、苯并二氫吡喃基、嗎啉代和哌啶基。
13.權(quán)利要求11的化合物，其中R6為Ar-Y，Ar選自苯基、吲哚基、苯并呋喃基、萘基、喹啉基、喹諾酮基、噻吩基、吡啶基和吡唑基。
14.權(quán)利要求4的化合物，其中R5為氫，L為C=O或SO2,Z不存在，R6為C1^6烯基。
15.權(quán)利要求14的化合物，其中Cm烯基為取代的乙烯基。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中所述取代基為芳基或雜芳基。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中所述取代基為任選被1-4個取代基取代的苯基。
18.—種藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物以及藥學(xué)上可接 受的載體。
19.一種抑制N端親核水解酶的方法，其中所述抑制劑在約5 μ M以下的濃度時(shí)，所述抑制劑抑制所述20S蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性，而不會抑制所述20S蛋白酶體的胰蛋白酶樣活性或肽基谷氨酰肽水解(PGPH)活性。
20.一種治療炎癥的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
21.—種抑制或減輕HIV感染的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
22.—種治療神經(jīng)變性性疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
23.一種治療肌肉萎縮病的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
24.一種治療癌癥的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
25.一種治療慢性傳染病的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
26.一種治療過度增殖性疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
27.一種治療肌肉廢用的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
28.一種治療免疫相關(guān)性疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
29.一種影響患者病毒基因表達(dá)水平的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
30.一種改變生物體的蛋白酶體產(chǎn)生的各種抗原肽的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的化合物。
全文摘要
含有三元雜環(huán)、基于肽的化合物能有效地選擇性抑制特異性N端親核(Ntn)水解酶活性。所述化合物能夠不同程度地抑制具有多種活性的Ntn的各種活性。例如，本發(fā)明化合物可以選擇性抑制20S蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性。所述基于肽的化合物包括環(huán)氧化物或氮丙啶，并且在N端官能化。所述基于肽的化合物除了具有其它治療用途以外，還具有抗炎特性和細(xì)胞增殖抑制作用。
文檔編號C07K5/06GK102875642SQ20121036101
公開日2013年1月16日 申請日期2005年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月10日
發(fā)明者M.S.史密斯, G.J.萊迪, R.T.博爾查德特, B.A.布寧, C.M.克魯斯, J.H.穆塞爾, K.D.申克, P.A.拉德爾 申請人:普羅特奧里克斯公司