一種以碳納米材料為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以水溶性的上轉換熒光納米材料為熒光供體，以碳納米材料為熒光受體熒光共振能量轉移檢測方法，具體步驟為：（1）制備水溶性上轉換熒光納米材料并對其進行表面標記，得到熒光供體溶液；（2）制備碳納米材料，得到熒光受體溶液；（3）將熒光供體溶液和熒光受體溶液混合，孵育后，測定熒光強度，得到熒光猝滅曲線；（4）將一定濃度的熒光供體溶液和熒光受體溶液混合，孵育后，加入不同濃度的目標物，繼續(xù)孵育后，測定熒光強度，繪制標準曲線；（5）根據(jù)標準曲線計算實際樣品中目標物的濃度。本方法可以避免生物樣本本底熒光的干擾，可以直接實現(xiàn)對血清或全血樣品中目標物的檢測，無需洗滌分離過程，檢測速度快，成本低廉。
【專利說明】一種以碳納米材料為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于上轉換熒光共振能量轉移檢測【技術領域】，具體涉及一種以碳納米材料為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法。
【背景技術】
[0002]目前生物樣品中的生物分子的檢測方法主要有異相分析和均相分析兩種，現(xiàn)有的異相分析方法主要有酶聯(lián)免疫分析、化學發(fā)光免疫分析和放射性免疫分析等。其中酶聯(lián)免疫分析是在抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記的基礎上進行的分析，加入酶反應的底物后，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，通過產(chǎn)物的量與受檢物的關系進行定性或定量分析?，F(xiàn)有的均相分析方法主要有時間分辨熒光免疫測定、下轉換熒光免疫和上轉換熒光共振能量轉移檢測。下轉換熒光共振能量轉移是一種基于供受體在距離足夠近時的偶極-偶極相互作用的非輻射躍遷過程，是一種均相檢測方法，可以克服異相分析所需的洗滌分離過程，操作簡單，目前已經(jīng)被用于疾病相關的生物分子的檢測。時間分辨熒光免疫測定是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。上轉換熒光共振能量轉移利用上轉換熒光納米材料作為熒光共振能量轉移體系的供體材料的均相分析方法，可以克服生物樣品背景熒光的干擾，可用于復雜生物樣品的檢測，現(xiàn)有的基于上轉換熒光共振能量轉移的檢測方法所采用的受體材料主要有有機染料、金納米粒子。
[0003]但是這些方法都存在一定的缺陷:
[0004](I)酶聯(lián)免疫分析是一種異相分析方法，需要洗滌分離過程，操作繁瑣、耗時，同時，酶聯(lián)免疫分析還需要使用抗原抗體等蛋白，價格昂貴，檢測成本高；
[0005](2)下轉換熒光免疫可以克服異相分析需要洗滌分離的缺點，但是卻無法避免生物樣品的背景干擾和光散射，限制其在復雜血液樣本分析中的應用；
[0006](3)時間分辨熒光免疫分析不僅可以克服異相分析分析需要洗滌分離的缺點，同時也可以避免生物樣品的背景干擾和光散射，可用于復雜血液樣本的分析檢測，但是時光分辨熒光免疫分析的儀器價格昂貴，檢測成本高；
[0007](4)目前基于上轉換熒光共振能量轉移的檢測方法所使用的受體材料主要是有機染料、金納米粒子，其中有機染料作為猝滅劑時的猝滅能力較低，影響分析檢測的靈敏度；金納米粒子作為猝滅劑時需要進行表面標記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種以碳納米顆粒為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法。
[0009]一種以碳納米材料為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法，其特征在于以水溶性的上轉換熒光納米材料為熒光供體，以碳納米材料為熒光受體，按下列步驟操作:
[0010](I)制備水溶性的上轉換熒光納米材料并在其表面標記單鏈核酸、多肽或蛋白，將帶有表面標記的上轉換熒光納米材料分散于緩沖液中，得到熒光供體溶液；
[0011](2)制備碳納米材料，將碳納米材料分散于溶劑中，得到熒光受體溶液；
[0012](3)將熒光供體溶液、熒光受體溶液和緩沖液按不同體積比混合后，得到熒光供體濃度相同、熒光受體濃度不同的各混合液，置于20~30°C孵育60~120min，在980nm激光器下測定各混合液的上轉換熒光強度，得到熒光猝滅效率最大的混合液中所對應的熒光供體濃度和熒光受體濃度；
[0013](4)標準曲線繪制:取熒光供體濃度和熒光受體濃度分別為熒光猝滅效率最大時所對應的濃度的混合液7組，置于20~30°C孵育60~120min后，以其中一組混合液為空白樣，向其余各組混合液中分別加入已知濃度的目標物，再置于37°C孵育90~120min ;在980nm激光器下測定各組混合液的上轉換熒光強度，空白樣的熒光強度為Ftl，加入目標物的各組混合液的熒光強度為F，以(F-Fci)/^為縱坐標，目標物在混合液中的濃度為橫坐標，繪制標準曲線；
[0014](5)取步驟(4)所述熒光供體濃度和熒光受體濃度分別為熒光猝滅效率最大時所對應的濃度的混合液，20~30°C孵育60~120min，加入未知濃度的目標物樣品，再置于37°C孵育90~120min后，測定混合液的熒光強度Fx，計算(Fx-Ftl)/FQ的值，代入步驟(4)得到的標準曲線，再計算得到樣品中目標物的濃度。
[0015]上述方案中，所述水溶性上轉換熒光納米材料為粒徑30~IOOnm的球形納米材
料，其表面修飾有氨基或羧基。
[0016]上述方案中，所述碳納 米材料為碳納米顆粒、還原型氧化石墨烯、氧化石墨烯、或殼聚糖修飾的氧化石墨烯。
[0017]上述方案中，所述目標物為單鏈核酸、糖類、或蛋白等所有可以與上轉換熒光納米材料表面標記物發(fā)生作用使供受體距離產(chǎn)生變化的物質(zhì)。
[0018]上述方案中，所述目標物為血清或全血中的單鏈核酸、糖類、或蛋白等所有可以與上轉換熒光納米材料表面標記物發(fā)生作用使供受體距離產(chǎn)生變化的物質(zhì)。
[0019]上述方案中，所述水溶性的上轉換熒光納米材料由如下方法制備得到:
[0020](I)配制稀土硝酸鹽溶液，所述稀土硝酸鹽溶液中，稀土離子摩爾比為釔離子:鐿離子:鉺離子為(60~90): (5~35): (0.5~10);
[0021](2)向步驟(1)所得稀土硝酸鹽溶液中加入低級醇、及水溶性稀土離子配體水溶液，混勻，所述低級醇為乙醇、正丙醇或正丁醇，所述水溶性稀土離子配體為聚丙烯酸、氨基乙基膦酸、或聚乙烯亞胺，所述稀土硝酸鹽與水溶性稀土離子配體的質(zhì)量比為0.162~1.01:1 ；
[0022](3)向步驟(2)所得溶液中加入氟化鈉水溶液，得到均勻的混合液體；所得混合液體中，所述氟離子與總的稀土離子摩爾比為(5~16):1，所述低級醇的體積占所述混合液體的體積的1/3~1/2 ;
[0023](4)將步驟(3)所得混合液體于200~240°C水熱反應10~24小時；
[0024](5)冷卻至室溫后，分離純化固體產(chǎn)物，得到上轉換熒光納米材料。
[0025]本發(fā)明的有益效果:[0026](I)與傳統(tǒng)的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法相比，該體系采用碳納米材料(包括碳納米顆粒、還原型氧化石墨烯和氧化石墨烯)作為熒光受體，碳納米材料的碳源易得，制備方法簡單，成本低廉，具有優(yōu)良的猝滅能力，分析檢測的靈敏度高，且在大多數(shù)檢測模型中無需進行生物標記，同時也可通過對其進行生物標記來實現(xiàn)對目標物的檢測。
[0027](2)與使用碳材料為熒光受體的其他檢測體系相比，上轉換熒光共振能量轉移檢測可以避免生物樣品本底熒光的干擾，可以用于檢測單鏈核酸、糖類、或蛋白，也可以實現(xiàn)對血清或全血樣本中的單鏈核酸、糖類、或蛋白的檢測，操作簡單，具有重要的臨床意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是以碳納米材料為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法的原理圖，其中I為水溶性上轉換熒光納米材料(UCPs)，2為單鏈核酸、多肽或蛋白，3為碳納米材料(碳納米顆粒、還原型氧化石墨烯或氧化石墨烯)，4為目標物。
[0029]圖2是水熱法制備的水溶性上轉換熒光納米材料的表征譜圖，其中A為XRD譜圖，B為透射電鏡圖。
[0030]圖3是碳納米顆粒的表征譜圖，其中A為透射電鏡圖，B為紫外-可見吸收光譜圖。
[0031]圖4是實施例1中的熒光檢測情況，其中A為上轉換熒光光譜圖，B為標準曲線(熒光恢復程度與目標物濃度線性關系圖)。
[0032]圖5是實施例2中的熒光檢測情況，其中A為上轉換熒光光譜圖，B為標準曲線(突光恢復程度與目標物濃度線性關系圖)。
[0033]圖6是實施例3中的熒光檢測情況，其中A為上轉換熒光光譜圖，B為標準曲線(突光恢復程度與目標物濃度線性關系圖)。
[0034]圖7是實施例4中的熒光檢測情況，其中A為上轉換熒光光譜圖，B為標準曲線(突光恢復程度與目標物濃度線性關系圖)。
【具體實施方式】
[0035]為了更好地理解本發(fā)明，下面結合附圖、附表及實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實例。
[0036]以下實施例中，所述水溶性上轉換熒光納米材料按如下方法制備得到:
[0037](I)制備稀土硝酸鹽溶液:按照稀土硝酸鹽中稀土離子摩爾比為釔離子:鐿離子:鉺離子為(60?90):(5?35):(0.5?10)稱取0.4238?0.6356g氧化釔、0.0616?0.4317g氧化鐿和0.0060?0.1200g氧化鉺，向其中加入4?8ml質(zhì)量分數(shù)為65?68%的濃硝酸，將混合溶液加熱到65°C，攪拌4?12h，形成無色透明的稀土硝酸鹽溶液，將反應溫度升高到140°C，繼續(xù)攪拌6?18h，蒸干水分和硝酸，得到稀土硝酸鹽粉末，用25ml超純水溶解稀土硝酸鹽粉末，配成0.25mol/L的稀土硝酸鹽溶液，過濾后備用。
[0038](2)取2ml0.25mol/L稀土硝酸鹽溶液(稀土硝酸鹽的質(zhì)量為0.1458g，各稀土離子摩爾比為釔離子:鐿離子:鉺離子=80:18:2)，向其中加入18ml無水乙醇，再加入含0.9g聚丙烯酸(稀土硝酸鹽與聚丙烯酸的質(zhì)量比為0.162:1)或0.34g聚乙烯亞胺(稀土硝酸鹽與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為0.429:1)的水溶液8ml，攪拌IOmin ;然后加入含0.21g氟化鈉(F_/Ln3+摩爾比為10: I)或0.126g氟化鈉(F_/Ln3+摩爾比6:1)的水溶液8ml，攪拌20min后，置于高壓反應釜中，在攪拌條件下于200°C反應IOh ;停止加熱并保持攪拌冷卻至室溫，離心分離出固體產(chǎn)物，用無水乙醇和超純水各洗3次，室溫下真空干燥12h得到固體上轉換熒光材料，稱重后加入適量的高純水分散得到20mg/ml的上轉換熒光納米材料水分散液。制備得到的水溶性上轉換熒光納米材料的表征譜圖見圖2，其中A為XRD譜圖，B為透射電鏡圖，由圖A可以看出制得的上轉換熒光納米材料由立方晶相和六方晶相的混合晶相構成，由圖B可以看出其粒徑為50nm。
[0039]以下實施例中，所述水溶性上轉換熒光納米材料的表面標記按如下方法進行:取5mg聚丙烯酸或者是聚乙烯亞胺修飾的上轉換突光納米材料溶于2?5ml2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖溶液(10mM，pH5.5)或者是羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)緩沖溶液(10mM，pH7.4)中，加入0.8?3.2mgl-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl),2.2?6.6mg N-羥基琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)或者是I?5mg4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(sulfo-SMCC)，在30°C、輕微振蕩條件下孵育0.5?2h以活化上轉換熒光納米材料表面的羧基或氨基。活化完成后離心分離得到活化的聚丙烯酸或聚乙烯亞胺修飾的上轉換熒光納米材料，將其用高純水洗三次。洗完的沉淀分散于2?5mlHEPES緩沖液(10mM，pH7.2)中，向其中加入1.5?4uM的單鏈DNA或I?3mg的多肽或I?5mg蛋白，在30°C、輕微振蕩條件下孵育2?24h后加入50mg三輕甲基氨基甲烷(Tris)以封閉過量的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。離心分離，將得到的沉淀用高純水洗三次以除去過量的單鏈DNA、多肽或蛋白，洗完后分散于2.5ml三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)緩沖溶液(10mM，150mM NaCl, pH7.4)中，得到2mg/ml的上轉換熒光納米材料-表面標記物溶液，所述上轉換熒光納米材料-表面標記物為上轉換熒光納米材料-單鏈核酸(UCPs-ssDNA)、上轉換熒光納米材料-多肽(UCPs-peptide)、上轉換熒光納米材料-伴刀豆球蛋白(UCPs-conA)或上轉換熒光納米材料-鏈霉親和素(UCPs-SA)。
[0040]以下實施例中所述碳納米材料按如下方法制備:
[0041 ] (I)碳納米顆粒的制備:稱取Smg蠟燭灰分散于20ml混合溶劑(乙醇和水的體積比為1:1)中，超聲5h, 3000rpm離心2min以除去大尺寸顆粒,收集上清,6000rpm離心6min得到2mg黑色沉淀，即為碳納米顆粒，其表征譜圖見圖3，其中A為透射電鏡圖，B為紫外-可見吸收光譜圖df2mg碳納米顆粒分散于20ml溶劑中，超聲分散2h得到質(zhì)量分數(shù)為0.1mg/ml的黑色碳納米顆粒溶液。
[0042](2)氧化石墨烯(GO)的制備:取50mL濃硫酸(濃度大于或等于70%)加熱至90°C，向其中加入IOg K2S2O8和IOg P2O5,降溫至80°C，待K2S2O8和P2O5完全溶解后緩慢加入12g石墨粉(30min內(nèi)加完)，80°C條件下反應4?5h，然后加入2L水，靜置一夜后過濾，離心洗滌以除去酸，干燥后得到預氧化石墨烯；取460mL濃硫酸(濃度大于或等于70%)置于冰水浴中，加入預氧化石墨烯并攪拌，然后緩慢加入60g高錳酸鉀(使反應液溫度不超過10°C)，于35°C反應2h后緩慢加入IL蒸餾水(使其溫度不超過50°C )，繼續(xù)攪拌2h后加入3L去離子水和50mL30%H202，靜置一天后棄去上清液，殘留液先用10%HC1洗再用蒸餾水洗，得到氧化石墨烯，將得到的氧化石墨烯進行干燥；將干燥后產(chǎn)物稱重并用適量高純水分散，繼續(xù)超聲2h，使氧化石墨烯逐漸剝落成層狀氧化石墨烯，得到濃度為1.5mg/ml的氧化石墨烯水溶液。
[0043](3)殼聚糖修飾的氧化石墨烯(CS-GO)按如下方法制備:取3mg氧化石墨烯(GO)分散在12mL Tris-HCl (10mM，pH=7.4)緩沖溶液中，向其中加入3mgl_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)并在室溫條件下攪拌lh，然后向其中加入Img殼聚糖(CS)反應12h，最后用半透膜透析以除去過量的EDC和CS，得到殼聚糖修飾的氧化石墨烯(CS-GO)，將其分散在2ml高純水中，得到1.5mg/ml殼聚糖修飾的氧化石墨烯水溶液。
[0044]實施例1
[0045]取2mg/ml的上轉換熒光納米材料-單鏈核酸(UCPs-ssDNA)溶液6uL，向其中加入不同體積的0.lmg/mL的0.02% (wt)十二烷基苯磺酸鈉分散的碳納米顆粒水溶液(SDBS-CNPs)，補加 Tris-HCl (IOmM, 150mM NaCl, ρΗ7.4)緩沖液至總體積為 400uL，得到8組混合液，各混合液中UCPs-ssDNA濃度為0.03mg/mL, SDBS-CNPs濃度分別為0，0.006，0.012，0.02，0.03，0.036，0.04，0.05mg/mL，25°C孵育 1.5h 后在 980nm 激光器下測其上轉換熒光強度，當SDBS-CNPs濃度為0.036mg/ml時所對應的混合液的熒光猝滅效率達到最大。取 6 組含 0.03mg/ml UCPs-ssDNA,0.036mg/ml SDBS-CNPs 的混合液在 25°C孵育 1.5h,然后以其中一組為空白樣，向其余6組加入不同體積的凝血酶和血清的混合物，使得凝血酶在混合液中的濃度分別為0，0.5,2,5,10，15，20nM，血清為40倍稀釋，在37°C孵育2h后在980nm激光器下測7組混合液的上轉換熒光強度，得到的上轉換熒光光譜圖見圖4A，計算加入了凝血酶和血清混合物的混合液的熒光強度F與空白樣的熒光強度Ftl的比值，以凝血酶在混合液中的濃度對(F-FtlVFtl的比值作圖得到標準曲線，標準曲線見圖4B。對于未知目標物濃度的血清樣品，加入UCPs-ssDNA、SDBS-CNPs的Tris-HCl溶液，該溶液中UCPs-ssDNA、SDBS-CNPs濃度分別為0.03mg/mL、0.036mg/mL, 37°C孵育2h后，測定混合液的熒光強度，計算其與空白樣的熒光強度Ftl的比值，然后代入標準曲線，計算得到樣品中目標物的濃度。
[0046]圖4A表明本發(fā)明方法建立的檢測方法能夠?qū)σ欢舛确秶鷥?nèi)的凝血酶有所響應，凝血酶的濃度越大，熒光強度也越高。圖4B表明在一定濃度范圍內(nèi)熒光恢復的程度與凝血酶的濃度呈現(xiàn)良好的線性關系。圖4A和圖4B的結果表明，本實施例的檢測方法可以實現(xiàn)對血清中凝血酶的濃度的檢測。
[0047]實施例2
[0048]取2mg/ml的上轉換熒光納米材料-多肽(UCPs-ρ印tide)溶液5.6uL，向其中加入不同體積的0.lmg/mL0.05% (wt)曲拉通分散的碳納米顆粒水溶液(TritonX-100-CNPs),補加 TCNB(pH7.5，50mM Tris, IOmM CaCl2, 150mM NaCl, 0.05%Bri j)緩沖液至總體積為 400uL，得到8組混合液,各混合液中UCPs-peptide濃度為0.028mg/mL, Triton Χ-100-CNPs濃度分別為 O, 0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07 和 0.08mg/mL，20°C孵育 2h 后在 980nm 激光器下測其上轉換熒光強度，當Triton X-100-CNPs濃度為0.05mg/ml時所對應的混合液熒光粹滅效率達到最大。取 7 組含 0.028mg/ml UCPs-peptide、0.05mg/ml Triton X-100-CNPs的混合液在25°C孵育1.5h，然后以其中一組為空白樣，向其余6組加入不同體積的人基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2)，使得MMP-2在混合液中的濃度分別為0，10, 50,80, 100, 200,和500pg/mL，在37°C孵育1.5h后在980nm激光器下測7組混合液上轉換熒光強度，計算加入了 MMP-2的混合液的熒光強度F與空白樣的熒光強度Ftl的比值，得到的上轉換熒光光譜圖見圖5A，以MMP-2在混合液中的濃度對(F-Fci)ZiFci的比值作圖得到標準曲線，標準曲線見圖5B。對于未知目標物濃度的樣品，加入UCPs-p印tide、Triton X-100-CNP的TCNB溶液，該溶液中 UCPs-p印tide、TritonX-100-CNPs 濃度分別為 0.028mg/mL、0.05mg/mL，37°C孵育 1.5h后，測定混合液的熒光強度，計算其與空白樣的熒光強度Ftl的差值，然后代入標準曲線，計算得到樣品中目標物的濃度。
[0049]圖5A表明本發(fā)明方法建立的檢測方法能夠?qū)σ欢舛确秶鷥?nèi)的人基質(zhì)金屬蛋白酶-2有所響應，人基質(zhì)金屬蛋白酶-2的濃度越大，熒光強度也越高。圖5B表明在一定濃度范圍內(nèi)熒光恢復的程度與人基質(zhì)金屬蛋白酶-2的濃度呈現(xiàn)良好的線性關系。圖5A和圖5B的結果表明，本實施例的檢測方法可以實現(xiàn)對人基質(zhì)金屬蛋白酶-2的濃度的檢測。
[0050]對于血清或全血樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶-2的檢測，利用加標回收實驗來驗證其可行性。取五份人基質(zhì)金屬蛋白酶濃度已知的實際樣品(其中包含三份血清樣品和兩份全血樣品)，向其中各加入一定濃度的人基質(zhì)金屬蛋白酶-2溶液，加入UCPs-peptide, SDBS-CNPs的Tris-HCl溶液，補加TCNB緩沖至總體積為400ul，使得該溶液中UCPs-peptide、SDBS-CNPs濃度分別為0.028mg/mL、0.05mg/ml,加入的人基質(zhì)金屬蛋白酶-2的濃度為100pg/ml，實際樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶-2的原始濃度見表1，37°C孵育1.5h后，測定混合液的熒光強度，計算其與空白樣的熒光強度Ftl的比值，然后代入標準曲線，計算得到樣品中目標物的濃度，從而計算回收率，具體實驗結果見表1，從表1的結果看，回收率可以達到92.8%~106.7%，相對標準偏差約為5%，表明本實施例的檢測方法可以實現(xiàn)對血清或全血樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶-2的檢測。
[0051]表1血清或全血樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶-2檢測的加標回收實驗
[0052]
【權利要求】
1.一種以碳納米材料為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法，其特征在于以水溶性的上轉換熒光納米材料為熒光供體，以碳納米材料為熒光受體，按下列步驟操作: (1)制備水溶性的上轉換熒光納米材料并在其表面標記單鏈核酸、多肽或蛋白，將帶有表面標記的上轉換熒光納米材料分散于緩沖液中，得到熒光供體溶液； (2)制備碳納米材料，將碳納米材料分散于溶劑中，得到熒光受體溶液； (3)將熒光供體溶液、熒光受體溶液和緩沖液按不同體積比混合后，得到熒光供體濃度相同、熒光受體濃度不同的各混合液，置于20~30°C孵育60~120min，在980nm激光器下測定各混合液的上轉換熒光強度，得到熒光猝滅效率最大的混合液中所對應的熒光供體濃度和熒光受體濃度； (4)標準曲線繪制:取熒光供體濃度和熒光受體濃度分別為熒光猝滅效率最大時所對應的濃度的混合液7組，置于20~30°C孵育60~120min后，以其中一組混合液為空白樣，向其余各組混合液中分別加入已知濃度的目標物，再置于37°C孵育90~120min ;在980nm激光器下測定各組混合液的上轉換熒光強度，空白樣的熒光強度為Ftl，加入目標物的各組混合液的熒光強度為F，以(F-Fci)/^為縱坐標，目標物在混合液中的濃度為橫坐標，繪制標準曲線； (5)取步驟(4)所述熒光供體濃度和熒光受體濃度分別為熒光猝滅效率最大時所對應的濃度的混合液，20~30°C孵育60~120min，加入未知濃度的目標物樣品，再置于37°C孵育90~120min后，測定混合液的熒光強度Fx，計算(Fx-F0) /F0的值，代入步驟(4)得到的標準曲線，再計算得到樣品中目標物的濃度。
2.根據(jù)權利要求1所述的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法，其特征在于所述水溶性上轉換熒光納米材料為粒徑30~IOOnm的球形納米材料，其表面修飾有氨基或羧基。
3.根據(jù)權利要求1所述的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法，其特征在于所述碳納米材料為碳納米顆粒、還原型氧化石墨烯、氧化石墨烯、或殼聚糖修飾的氧化石墨烯。
4.根據(jù)權利要求1所述的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法，其特征在于所述目標物為單鏈核酸、糖類、或蛋白。
5.根據(jù)權利要求1所述的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法，其特征在于所述目標物為血清或全血中的單鏈核酸、糖類、或蛋白。
6.根據(jù)權利要求1所述的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法，其特征在于所述水溶性的上轉換熒光納米材料由如下方法制備得到: (1)配制稀土硝酸鹽溶液，所述稀土硝酸鹽溶液中，稀土離子摩爾比為釔離子:鐿離子:鉺離子為(60~90): (5~35):(0.5~10)； (2)向步驟(1)所得稀土硝酸鹽溶液中加入低級醇、及水溶性稀土離子配體水溶液，混勻，所述低級醇為乙醇、正丙醇或正丁醇，所述水溶性稀土離子配體為聚丙烯酸、氨基乙基膦酸、或聚乙烯亞胺，所述稀土硝酸鹽與水溶性稀土離子配體的質(zhì)量比為0.162~1.01:1 ; (3)向步驟(2)所得溶液中加入氟化鈉水溶液，得到均勻的混合液體；所得混合液體中，所述氟離子與總的稀土離子摩爾比為(5~16):1，所述低級醇的體積占所述混合液體的體積的1/3~1/2 ； (4)將步驟(3)所得混合液體于200~240°C水熱反應10~24小時； (5)冷卻至室溫后，分離純化固體產(chǎn)物，得到上轉換熒光納米材料。
【文檔編號】G01N21/64GK103487418SQ201310428463
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權日:2013年9月18日
【發(fā)明者】劉志洪, 楊利, 何夢媛, 吳正俊, 湯志愷, 王宇輝 申請人:廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司