可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法及其應(yīng)用。該方法包括以下步驟：在量子點表面偶聯(lián)抗體親和配體；以及以抗體親和配體作為橋接分子與抗體進行位點特異性自組裝標記，其中，抗體親和配體包括用于與抗體結(jié)合的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列、用于與量子點表面偶聯(lián)的標簽序列以及提供抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列與標簽序列之間空間間隔的間隔臂序列。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，用帶標簽序列和間隔臂序列的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽作為橋接分子偶聯(lián)量子點與抗體，連接方式簡單、快速、可控且位點特異性好，偶聯(lián)產(chǎn)物在大多數(shù)生物檢測環(huán)境條件下穩(wěn)定，且適用范圍廣。
【專利說明】可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]量子點(Quantum dot, QD)又稱半導(dǎo)體納米晶，是一種納米突光材料,多呈球形,半徑小于或接近激子波爾半徑，直徑一般在I?12nm。量子點作為熒光材料具有優(yōu)異的熒光特性:擁有窄而對稱的熒光發(fā)射光譜，發(fā)射波長隨材料及粒徑大小不同而不同，具有寬泛且連續(xù)的吸收光譜，斯托克斯位移較大，以上特性使量子點易于實現(xiàn)單波長激發(fā)多波長同時發(fā)射的多色標記功能。此外，相對于有機熒光染料，量子點具有很好的光穩(wěn)定性，耐光漂白，熒光效率高等優(yōu)點，且隨著量子點表面配基化學(xué)修飾技術(shù)的發(fā)展，量子點生物相容性及標記效率的進一步提高，使得相關(guān)量子點生物標記物在科研、檢測領(lǐng)域的應(yīng)用得到了進一步拓展。
[0003]量子點探針標記要實現(xiàn)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用，首先要解決量子點與生物活性分子高效偶聯(lián)的難題。其中可控、定向、定量是實現(xiàn)高效偶聯(lián)的基本原則。傳統(tǒng)的化學(xué)偶聯(lián)方法，是利用生物分子表面的化學(xué)基團如蛋白表面的氨基或羧基等與量子點表面配基的活性基團交聯(lián)。這種偶聯(lián)方式缺乏位點特異性，導(dǎo)致偶聯(lián)后生物分子活性下降、空間位阻、易聚沉等現(xiàn)象。取向性化學(xué)偶聯(lián)方法，利用生物分子表面特定的化學(xué)基團如抗體的糖基等與量子點表面配基的活性基團交聯(lián)。這種偶聯(lián)方式盡管改善了位點特異性，獲得了更高的偶聯(lián)效率，但操作步驟仍較繁瑣、條件難控制、易沉聚，不易重復(fù)，不能滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。此外使用化學(xué)偶聯(lián)方法，往往需要量子點表面配基帶有一定的活性基團如羧基或氨基等，這些基團通常容易與其它生物分子發(fā)生非特異結(jié)合而產(chǎn)生較高的背景信號，不利于高靈敏度檢測。而利用分子生物學(xué)技術(shù)，在抗體親和蛋白融合蛋白或合成的抗體結(jié)合肽基礎(chǔ)上，加入利于交聯(lián)的標簽如半胱氨酸標簽、組氨酸標簽或生物素標簽，獲得抗體親和配體，與表面含金屬離子或親和素修飾的量子點直接混合，即可實現(xiàn)蛋白與量子點高效、位點特異性自組裝偶聯(lián)。當利用金屬配位偶聯(lián)時，量子點表面可使用惰性配基修飾降低背景信號提高靈敏度。與采用分子生物學(xué)手段對每種目標蛋白分別進行遺傳操作不同，此方法適用于通用型免疫活性量子點探針的快速標記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中抗體與量子點偶聯(lián)缺乏位點特異性或操作步驟繁瑣且不能滿足規(guī)模化生產(chǎn)需要的技術(shù)問題。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法。該方法包括以下步驟:在量子點表面上偶聯(lián)抗體親和配體；以及以抗體親和配體作為橋接分子與抗體進行位點特異性自組裝標記，其中，抗體親和配體包括用于與抗體結(jié)合的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列、用于與量子點表面偶聯(lián)的標簽序列以及提供抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列與標簽序列之間空間間隔的間隔臂序列。
[0006]進一步地，抗體未和蛋白序列為蛋白G、蛋白A、蛋白A/G或蛋白L ;抗體結(jié)合妝序列為六肽HWRGWV。
[0007]進一步地，標簽序列包括含有4?12個組氨酸的組氨酸標簽、含有I?5個半胱氨酸的半胱氨酸標簽或含有生物素修飾的標簽。
[0008]進一步地,量子點表面帶有供與標簽序列連接的標簽序列配體。
[0009]進一步地，配體包括配位金屬離子或親和素蛋白。
[0010]進一步地，抗體源自大鼠、小鼠、兔、羊、馬、豬、牛或人。
[0011]進一步地，抗體包括通過免疫兔、羊、或鼠等動物產(chǎn)生的多抗、雜交瘤方法制備的單抗、異源表達的單抗或基因工程抗體。
[0012]進一步地,通過調(diào)節(jié)抗體的濃度控制抗體與抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽的連接數(shù)量，并用酶解的抗體片段封閉未結(jié)合抗體的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽的結(jié)合位點。
[0013]進一步地，抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽與量子點偶聯(lián)摩爾比為I?200:1。
[0014]進一步地,抗體與量子點偶聯(lián)摩爾比為0.5?100:1。
[0015]本發(fā)明還可提供一種可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的標記抗體在酶聯(lián)免疫吸附、側(cè)向免疫層析、細胞成像、流式細胞術(shù)、蛋白印跡中的應(yīng)用。
[0016]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，用帶標簽序列和間隔臂序列的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽作為橋接分子偶聯(lián)量子點與抗體，連接方式簡單、快速、可控且位點特異性好，偶聯(lián)產(chǎn)物在大多數(shù)生物檢測環(huán)境條件下穩(wěn)定，且不必對所獲得的抗體采取任何化學(xué)修飾或改造，只要其保守區(qū)與特定的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽有特異結(jié)合能力就可以進行自組裝偶聯(lián)，適用范圍廣，大大簡化了量子點與不同抗體偶聯(lián)的過程，利于系列抗體標記物的快速生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中:
[0018]圖1顯示一種可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法獲得的一種抗體與量子點橋接偶聯(lián)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0019]圖2顯示根據(jù)本發(fā)明實施例1和2中PEG惰性封端的量子點與PGHis和PGAsnHis不同摩爾比偶聯(lián)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，蛋白與量子點的摩爾比標識于各泳道上，分別為2、4、8倍，對PGAsnHis增加16倍摩爾比偶聯(lián)；
[0020]圖3顯示根據(jù)本發(fā)明實施例3中羧基末端修飾的量子點與PGHis和PGAsnHis不同摩爾比偶聯(lián)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，蛋白與量子點的摩爾比標識于各泳道上，分別為
2、4、8倍，對PGAsnHis增加16倍摩爾比偶聯(lián)；
[0021]圖4顯示根據(jù)本發(fā)明實施例4中8倍摩爾比交聯(lián)的PGAsnHis-量子點產(chǎn)物經(jīng)過N1-NTA柱純化的結(jié)果，左側(cè)為熒光顯色結(jié)果，右側(cè)為考馬斯亮藍染色結(jié)果，熒光顯色結(jié)果中的熒光條帶為交聯(lián)產(chǎn)物，考馬斯亮藍染色結(jié)果中箭頭所指為游離PGAsnHis的條帶，最右側(cè)為分子量標準，各條帶分子量(kDa)已標識；
[0022]圖5顯示根據(jù)本發(fā)明實施例4中8倍摩爾比交聯(lián)的PGAsnHis-量子點產(chǎn)物純化前后分別與兔源性IgG包被免疫層析試紙條的特異性結(jié)合反應(yīng)結(jié)果；
[0023]圖6顯示根據(jù)本發(fā)明實施例5中8倍摩爾比交聯(lián)的PGAsnHis-量子點純化后產(chǎn)物與小鼠、兔、羊、豬、人源性抗體包被免疫層析試紙條的結(jié)合反應(yīng)結(jié)果；
[0024]圖7顯示根據(jù)本發(fā)明實施例5中8倍摩爾比交聯(lián)的PGAsnHis-量子點純化后產(chǎn)物、蛋白A-量子點產(chǎn)物、蛋白A/G-量子點產(chǎn)物以及蛋白L-量子點產(chǎn)物與牛血清白蛋白(BSA，作為陰性對照)以及小鼠、兔、羊、豬和人等種屬源性多克隆抗體或單克隆抗體的斑點雜交實驗結(jié)果，每種抗體點樣量為10pg，點樣順序見圖示；
[0025]圖8顯示根據(jù)本發(fā)明實施例6中PGAsnHis-量子點連接產(chǎn)物與小鼠抗沙丁胺醇單克隆抗體的橋接偶聯(lián)產(chǎn)物檢測樣品中沙丁胺醇含量的熒光免疫層析試紙條結(jié)果；
[0026]圖9顯示根據(jù)本發(fā)明實施例7中PGAsnAvi (左)與PGAsnC2X2C2 (右)的量子點偶聯(lián)產(chǎn)物與小鼠、兔、羊、豬、人源性抗體包被免疫層析試紙條的結(jié)合反應(yīng)結(jié)果；
[0027]圖10顯示根據(jù)本發(fā)明實施例8中PEG惰性封端的量子點與蛋白A不同摩爾比偶聯(lián)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，蛋白與量子點的摩爾比標識于泳道上，分別為1、2、4、8倍；
[0028]圖11顯示根據(jù)本發(fā)明實施例9中PEG惰性封端的量子點與蛋白A/G不同摩爾比偶聯(lián)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，蛋白與量子點的摩爾比標識于泳道上，分別為1、2、4、8倍；
[0029]圖12顯示根據(jù)本發(fā)明實施例10中PEG惰性封端的量子點與蛋白L不同摩爾比偶聯(lián)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，蛋白與量子點的摩爾比標識于泳道上，分別為1、2、4、8倍；
[0030]圖13顯示根據(jù)本發(fā)明實施例11中8倍摩爾比交聯(lián)的PGAsnHis-量子點純化后產(chǎn)物用于兔抗微管蛋白抗體標記的細胞免疫熒光成像結(jié)果；
[0031]圖14顯示根據(jù)本發(fā)明實施例12中經(jīng)純化8倍摩爾比交聯(lián)的PGAsnHis(蛋白G)-量子點、蛋白A-量子點、蛋白A/G-量子點與一抗反應(yīng)后的斑點雜交結(jié)果，其中未加入一抗的樣品組為陰性對照，每組結(jié)果中出現(xiàn)的抗體斑點為陽性對照。
【具體實施方式】
[0032]需要補充說明的是，在不發(fā)生矛盾的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以組合應(yīng)用。下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0033]要實現(xiàn)量子點探針標記在生物領(lǐng)域的應(yīng)用，首先要解決量子點與生物活性分子高效偶聯(lián)的難題。因為，傳統(tǒng)的化學(xué)偶聯(lián)方法缺乏位點特異性，取向性化學(xué)偶聯(lián)方法操作步驟繁瑣、條件控制難、易沉聚，且不易重復(fù)，不能滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要，化學(xué)偶聯(lián)方法背景信號較高，不利于高靈敏度檢測。
[0034]針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明利用分子生物學(xué)方法表達抗體親和蛋白融合蛋白或合成抗體結(jié)合肽，加入利于連接的標簽如半胱氨酸標簽、組氨酸標簽或親和素標簽，與表面含金屬離子或生物素修飾的量子點直接混合，實現(xiàn)了蛋白與量子點高效、位點特異性自組裝偶聯(lián)。
[0035]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法。該抗體標記方法包括以下步驟:在量子點10表面上偶聯(lián)抗體親和配體30 ;以及以該抗體親和配體30作為橋接分子與抗體20進行位點特異性自組裝標記，其中，抗體親和配體30包括用于與抗體20片段結(jié)合的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列31、用于與量子點10表面偶聯(lián)的標簽序列33以及抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列31與提供標簽序列33之間空間間隔的間隔臂序列32 (如圖1所示)。
[0036]抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列31、標簽序列33以及間隔臂序列32之間可以不同方式組合以肽鍵相連。間隔臂序列是為了減少空間位阻，可以是含有5個氨基酸以上長度，可根據(jù)實驗與檢測要求設(shè)計間隔臂長度，剛性構(gòu)象可保證蛋白的固定取向，柔性多肽序列則使蛋白具有一定的自由度。用于與抗體結(jié)合的抗體親和蛋白序列優(yōu)選是密碼子使用頻率適于大腸桿菌工程菌表達的抗體親和蛋白序列，這樣能夠使該方法更加適應(yīng)于規(guī)?；a(chǎn)。
[0037]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，用帶標簽序列和間隔臂序列的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽作為橋接分子偶聯(lián)量子點與抗體，連接方式簡單、快速、可控且位點特異性好，偶聯(lián)產(chǎn)物在大多數(shù)生物檢測環(huán)境條件下穩(wěn)定，且不必對所獲得的抗體采取任何化學(xué)修飾或改造，只要其保守區(qū)與特定的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽有親和能力就可以進行自組裝偶聯(lián)，適用范圍廣，大大簡化了量子點與不同抗體偶聯(lián)的過程，利于快速開發(fā)系列產(chǎn)品。
[0038]經(jīng)優(yōu)選，抗體親和蛋白序列為蛋白G、蛋白A、蛋白A/G、蛋白L，抗體結(jié)合肽序列為HWRGWV。其中，蛋白G是一種鏈球菌表達的可特異性地與多種哺乳動物免疫球蛋白G(IgG)的Fe片段結(jié)合的蛋白。蛋白A是一種金黃色葡萄球菌的表達產(chǎn)物，與蛋白G功能相近，但其性質(zhì)和結(jié)合特異性與蛋白G稍有不同。蛋白A/G是人工合成蛋白，兼具蛋白G和蛋白A活性域的融合蛋白，對不同種屬源性的免疫球蛋白G (IgG)的Fe片段有更好的親和活性。免疫球蛋白G (IgG)，常用于特異性抗原的檢測，其Fe區(qū)不參與抗原識別與結(jié)合反應(yīng)，因此抗體親和蛋白與IgG Fe片段的結(jié)合并不影響抗體的免疫活性，即IgG偶聯(lián)位點可控。蛋白L是從大消化鏈球菌中分離出的蛋白，可特異性結(jié)合抗體kappa鏈，也不影響抗體的抗原結(jié)合活性，也可實現(xiàn)IgG位點可控偶聯(lián)量子點?？贵w結(jié)合肽是通過肽庫篩選的人工合成的一類具有結(jié)合抗體能力的多肽，如HWRGWV等。
[0039]上述抗體親和蛋白的抗體結(jié)合域分子量適中，且利用分子生物學(xué)技術(shù)表達易于純化，具有高穩(wěn)定性和高親和力?？贵w結(jié)合肽序列簡單，可通過化學(xué)合成批量制備。通過添加標簽序列抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽都可實現(xiàn)與量子點高效、位點特異性偶聯(lián)。因此利用上述經(jīng)改造的抗體親和配體(抗體親和配體包括用于與抗體結(jié)合的抗體親和蛋白序列、用于與量子點表面偶聯(lián)的標簽序列以及提供抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列與標簽序列之間空間間隔的間隔臂序列)作為抗體與量子點偶聯(lián)的橋接分子，預(yù)先連接于量子點表面，并利用這些抗體親和配體與多種屬源性抗體位點可控結(jié)合的特性偶聯(lián)抗體，可實現(xiàn)通用型量子點的抗體快速自組裝標記，利于系列產(chǎn)品的標記。
[0040]經(jīng)優(yōu)選，標簽序列包括含有4?12個組氨酸的組氨酸標簽、含有I?5個半胱氨酸的半胱氨酸標簽或含有生物素修飾的標簽，這樣可實現(xiàn)抗體親和蛋白與量子點快速偶聯(lián)。這些標簽序列具有不同的量子點結(jié)合速度及穩(wěn)定性，可位于蛋白N端、C端，或蛋白序列中，使抗體親和蛋白的抗體結(jié)合區(qū)處于最有利結(jié)合的取向，以適用于不同的實驗與檢測要求。
[0041]經(jīng)優(yōu)選，量子點表面帶有供與標簽序列連接的標簽序列配體，標簽序列配體包括配位金屬離子或親和素蛋白。本發(fā)明中使用的量子點主要為表面含有鋅離子等易于與標簽序列配位的量子點，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe，或用親和素修飾的表面配基。
[0042]本發(fā)明中的抗體源自多種屬源性抗體，如抗體是源自于大鼠、小鼠、兔、羊、馬、豬、?；蛉说人锌膳c抗體親和配體特異結(jié)合的抗體?？贵w包括各種具免疫活性的抗體，如針對完全抗原和小分子半抗原的抗體等。
[0043]在本發(fā)明的一種實施方式中，抗體包括采用不同方法制備的抗體，例如通過免疫兔、羊、或鼠等動物產(chǎn)生的多抗、雜交瘤方法制備的單抗、異源表達的單抗或基因工程抗體
坐寸ο
[0044]經(jīng)優(yōu)選,通過調(diào)節(jié)抗體的濃度控制抗體與抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽的連接數(shù)量，并用酶解的抗體片段封閉未結(jié)合抗體的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽的結(jié)合位點，使得該抗體標記方法更加靈敏可控。
[0045]蛋白與量子點偶聯(lián)摩爾比可以為I?200:1，優(yōu)選為I?30:1。在低至1:1偶聯(lián)比條件下，標記產(chǎn)品適用于需要長時間孵育的實驗，如細胞染色，ELISA等實驗，可以獲得高靈敏度。而在高至50:1的偶聯(lián)比條件下，量子點被蛋白飽和標記，產(chǎn)品經(jīng)過純化后可用于快速檢測實驗，如快檢試紙條，由于標記樣品含有多個結(jié)合位點，可提高結(jié)合效率。
[0046]抗體與量子點偶聯(lián)摩爾比可以為0.5?100:1。根據(jù)所選抗體結(jié)合蛋白的摩爾比確定，例如重組蛋白G含單個抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以與抗體上Fe區(qū)的兩個結(jié)合位點中的一個結(jié)合，則抗體與這種重組蛋白G橋接的量子點偶聯(lián)摩爾比為0.5?15:1。而當使用含有兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組蛋白A，則抗體與量子點偶聯(lián)摩爾比則為I?30:1，此次類推。
[0047]上述可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)方法標記的抗體可以應(yīng)用于在酶聯(lián)免疫吸附、側(cè)向免疫層析(免疫層析試紙條)、細胞成像、流式細胞術(shù)、蛋白印跡用等。
[0048]下面將結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的有益效果。
[0049]實施例1
[0050]I)帶有組氨酸標簽的蛋白G表達
[0051]根據(jù)公布的蛋白G序列β 2結(jié)構(gòu)域(數(shù)據(jù)庫編號GenBank:X04015.1)，由北京塞百盛基因技術(shù)有限公司進行全基因合成，并在基因上游添加NcoI酶切位點，在基因下游添加SacI及HindIII酶切位點。通過NcoI和HindIII酶切位點克隆到表達載體pET28a (Novagen)上構(gòu)建 pET28a-PG 質(zhì)粒。合成互補引物:His6SHf (SEQ ID NO:I):ccggtcaccaccaccaccaccactga及 His6SHr (SEQ ID NO:2):agcttcagtggtggtggtggtggtgaccggagct，體外退火后連接入pET28a-PG的SacI及HindIII位點之間，得到pET28a_PGHis質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (plysE)菌株表達。表達條件:500ml三角瓶中盛有已滅菌的150ml LB培養(yǎng)基，加入25 μ g/ml卡那霉素和15 μ g/ml氯霉素，接種2ml過夜培養(yǎng)的表達菌種。37攝氏度220rpm搖床培養(yǎng)2?3小時，至0D600達到約0.8?I時，加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)表達，并將培養(yǎng)溫度降低至30攝氏度，表達6小時后4攝氏度6000rpm離心收集菌體沉淀，-20攝氏度冷凍保存。
[0052]2)帶有組氨酸標簽的蛋白G純化
[0053]將冷凍保存的蛋白G取出融化后，加入緩沖液A(含30mM咪唑，500mM氯化鈉，20mMTris-HCl,pH8.0)超聲破碎至菌液澄清，4攝氏度15000rpm高速離心20分鐘棄去沉淀。上清通過0.2 μ m針頭濾器過濾后上樣N1-NTA金屬螯合層析重力柱，層析柱預(yù)先用緩沖液A平衡，樣品流完后繼續(xù)加入3倍柱體積的緩沖液A洗柱，之后用緩沖液B (含500mM咪唑，500mM氯化鈉，20mM Tris-HCl, pH8.0)洗脫結(jié)合在鎳填料上的PGHis蛋白，經(jīng)過截留分子量為3kDa的超濾管脫鹽及濃縮，可以得到純度95%以上的帶組氨酸標簽的蛋白G，即PGHis蛋白。
[0054]量子點由杭州納晶科技有限公司合成，CdSe/ZnS核殼結(jié)構(gòu)量子點，表面采用PEG惰性封端，在硼酸緩沖液(10mM，pH9.0)中與不同濃度的PGHis偶聯(lián)。PGHis:量子點摩爾比為2、4、8，瓊脂糖電泳中可發(fā)現(xiàn)交聯(lián)物泳動速度減慢，表明分子量顯著增加，且隨交聯(lián)摩爾比增加分子量逐漸越大(如圖2所示)。
[0055]實施例2
[0056]在pET28a_PG 質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，先用互補引物 AsnlOSSHf (SEQ ID NO:3):tgaacaacaacaacaataacaataacaacaacctgagctcctgaa及 AsnlOSSHr (SEQ ID NO:4):agctttcaggagctcaggttgttgttattgttattgttgttgttgttcaagct 體外退火后連接入 pET28a_PG 的 SacI 及HindIII位點之間，獲得pET28a-PGAsn質(zhì)粒。然后再用His6SHf和His6SHr體外退火后再連接入pET28a-PGAsn的SacI及HindIII位點之間，最終構(gòu)建成pET28a_PGAsnHis質(zhì)粒用于表達PGAsnHis蛋白。除交聯(lián)摩爾比增加16倍交聯(lián)外，其它操作步驟同實施例1。結(jié)果顯示添加了十個天冬酰胺殘基的柔性間隔臂的PGAsnHis蛋白比不添加間隔臂的PGHis蛋白更易于與量子點交聯(lián)，電泳條帶顯示的分子量更大(圖2)。
[0057]實施例3
[0058]量子點使用羧基末端修飾，其它操作步驟同實施例1及實施例2。電泳結(jié)果顯示，羧基末端修飾的量子點交聯(lián)后分子量相對于游離量子點分子量變化(圖3)小于PEG惰性封端的量子點(圖2)，說明PEG惰性封端的量子點比羧基末端修飾的量子點更適于組氨酸標簽配位偶聯(lián)。
[0059]實施例4
[0060]使用實施例2中8倍比例交聯(lián)的PGAsnHis-量子點偶聯(lián)物進行N1-NTA純化去除游離PGAsnHis蛋白，具體步驟為:使用緩沖液A平衡N1-NTA層析重力柱后，將偶聯(lián)產(chǎn)物小心加入柱中，之后繼續(xù)使用3倍柱體積緩沖液A沖洗，注意收集含有熒光物質(zhì)的穿透組分。然后用緩沖液B洗脫結(jié)合的未偶聯(lián)的游離PGAsnHis蛋白。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗檢查純化效果，結(jié)果顯示此法可回收90%以上的交聯(lián)產(chǎn)物(存在于流穿組分)，在電泳圖中已觀察不到游離PGAsnHis蛋白，而緩沖液B洗脫的組分中含有大量PGAsnHis蛋白(圖4，箭頭所指)。對純化前后的樣品進行活性測試，結(jié)果顯示純化后樣品信號強于未純化樣品(圖5)，說明該純化方法可有效去除游離PGAsnHis蛋白，可減少其對標記物的競爭，從而提高靈敏度。
[0061]實施例5
[0062]使用實施例4中的經(jīng)過純化的PGAsnHis-量子點標記產(chǎn)物與包被有鼠、兔、羊、豬、人源性IgG免疫層析試紙條進行結(jié)合測試，結(jié)果在檢測線上出現(xiàn)明顯的熒光信號(圖6)，表明偶聯(lián)產(chǎn)物有顯著的抗體結(jié)合能力。使用斑點雜交技術(shù)，檢測固化在硝酸纖維素膜上的鼠、兔、羊、豬、人的IgG (分別為10pg)，可見信號明顯(圖7)
[0063]實施例6
[0064]使用鼠源性抗沙丁胺醇單克隆抗體與按實施例4方法經(jīng)過純化的PGAsnHis-量子點標記產(chǎn)物按摩爾比2:1在25°C條件下震蕩lh，采用競爭法檢測樣品中的沙丁胺醇含量，在試紙條上可顯示競爭性抑制反應(yīng)，熒光讀卡儀檢測靈敏度可達lng/ml (圖8)。
[0065]實施例7[0066]月目 Av1-tag (SEQ ID NO:5) ggcctgaacgatatttttgaagcgcagaaaattgaatggcatgaa序列替換PGAsnHis的C末端His6_tag序列，克隆構(gòu)建表達后獲得PGAsnAvi蛋白，在其C末端帶有可被生物素連接酶BirA修飾的Av1-tag，使之帶有生物素修飾，可與親和素化的量子點偶聯(lián)。8倍偶聯(lián)產(chǎn)物活性免疫試紙條測試如圖9，聯(lián)接物具有結(jié)合鼠、兔、羊、豬、人源性IgG的能力。
[0067]用C2X2C2_tag (SEQ ID NO:6)tgttgtgttatttgttgt 序列替換 PGAsnHis 的 C 末端His6-tag序列，克隆構(gòu)建表達后獲得PGAsnC2X2C2蛋白，在其C末端帶有4個半胱氨酸，可通過巰基進行配位偶聯(lián)量子點。8倍偶聯(lián)產(chǎn)物活性測試如圖9，聯(lián)接物有結(jié)合鼠、兔、羊、豬、人源性IgG的能力。
[0068]實施例8
[0069]使用在大腸桿菌中表達含有C端His-tag的重組蛋白A (數(shù)據(jù)庫編號GenBank: JX912493.1)，參照實施例1中蛋白G的偶聯(lián)條件，采用I?8倍偶聯(lián)比，配位偶聯(lián)蛋白A與量子點，經(jīng)電泳檢測顯示條帶遷移率明顯隨偶聯(lián)比提高而降低，表明成功獲得偶聯(lián)(圖10)。對8倍偶聯(lián)比產(chǎn)物按照實施例4中的純化方式純化后進行斑點雜交活性測試，聯(lián)接物具有結(jié)合鼠、兔、羊、豬、人源性IgG的能力(圖7)。
[0070]實施例9
[0071]使用在大腸桿菌中表達含有C端His-tag的重組蛋白A/G，參照實施例1中蛋白G的偶聯(lián)條件，采用I?8倍偶聯(lián)比，配位偶聯(lián)蛋白A/G與量子點，經(jīng)電泳檢測顯示條帶遷移率明顯隨偶聯(lián)比提高而降低，表明成功獲得偶聯(lián)(圖11)。對8倍偶聯(lián)比產(chǎn)物按照實施例4中的純化方式純化后進行斑點雜交活性測試，聯(lián)接物具有結(jié)合鼠、兔、羊、豬、人源性IgG的能力(圖7)。
[0072]實施例10
[0073]使用在大腸桿菌中表達含有C端His-tag的重組蛋白L (數(shù)據(jù)庫編號EMBL:S50809.1)，參照實施例1中蛋白G的偶聯(lián)條件，采用I?8倍偶聯(lián)比，配位偶聯(lián)蛋白L與量子點，經(jīng)電泳檢測顯示條帶遷移率明顯隨偶聯(lián)比提高而降低，表明成功獲得偶聯(lián)(圖12)。對8倍偶聯(lián)比產(chǎn)物按照實施例4中的純化方式純化后進行斑點雜交活性測試，聯(lián)接物具有結(jié)合鼠、兔、羊、豬、人源性IgG的能力(圖7)。
[0074]實施例11
[0075]使用實施例4中經(jīng)純化的PGAsnHis-QD標記產(chǎn)物，與經(jīng)兔抗微管蛋白抗體孵育的細胞進行孵育，免疫熒光成像顯示細胞骨架結(jié)構(gòu)顯示清晰、完整(圖13)。
[0076]實施例12
[0077]使用實施例4、8、9中經(jīng)純化的蛋白G、蛋白A、蛋白A/G-QD偶聯(lián)產(chǎn)物進行斑點雜交二抗活性測試，結(jié)果表明，在不加入一抗的條件下，偶聯(lián)產(chǎn)物沒有非特異背景信號，而加入1000倍稀釋的一抗后用偶聯(lián)產(chǎn)物檢測，可檢出0.8ng的BSA，靈敏度高(圖14)。
[0078]通過上述實施例可以看出，本發(fā)明采用抗體親和蛋白與量子點偶聯(lián)，采用含間隔臂的標簽序列配位偶聯(lián)，高效、穩(wěn)定、易純化。偶聯(lián)產(chǎn)物抗體親和蛋白-量子點可與不同種屬抗體快速、有效地偶聯(lián)，實現(xiàn)多種高靈敏度熒光納米探針的制備。
[0079]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法，其特征在于，包括以下步驟:在量子點(10)表面偶聯(lián)抗體親和配體(30);以及以所述抗體親和配體(30)作為橋接分子與抗體(20)進行位點特異性自組裝標記，其中，所述抗體親和配體(30)包括用于與抗體(20)結(jié)合的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列(31)、用于與所述量子點(10)表面偶聯(lián)的標簽序列(33)以及提供所述抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列(31)與所述標簽序列(33)之間空間間隔的間隔臂序列(32)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體標記方法，其特征在于，所述抗體親和蛋白為蛋白G、蛋白A、蛋白A/G或蛋白L ;所述抗體結(jié)合肽為人工合成的經(jīng)肽庫篩選的與所述抗體(20)特異性結(jié)合的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體標記方法，其特征在于，所述標簽序列(33)包括含有4?12個組氨酸的組氨酸標簽、含有I?5個半胱氨酸的半胱氨酸標簽或含有生物素修飾的標簽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體標記方法，其特征在于，所述量子點(10)表面帶有供與所述標簽序列(33)偶聯(lián)的標簽序列配體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體標記方法，其特征在于，所述配體包括配位金屬離子或未和素蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體標記方法，其特征在于，所述抗體(20)源自大鼠、小鼠、兔、羊、馬、牛、豬或人。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體標記方法，其特征在于，所述抗體(20)包括通過免疫動物產(chǎn)生的多抗、雜交瘤方法制備的單抗、異源表達的單抗或基因工程抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體標記方法，其特征在于，通過調(diào)節(jié)所述抗體(20)的濃度控制所述抗體(20)與所述抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽的連接數(shù)量，并用酶解的所述抗體(20)片段封閉未結(jié)合的所述抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽的結(jié)合位點。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體標記方法，其特征在于，所述抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽與所述量子點(10)偶聯(lián)摩爾比為I?200:1。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體標記方法，其特征在于，所述抗體(20)與所述量子點(10)偶聯(lián)摩爾比為0.5?100:1。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的可控量子點位點特異性橋接偶聯(lián)的抗體標記方法在酶聯(lián)免疫吸附、側(cè)向免疫層析、細胞成像、流式細胞術(shù)、蛋白印跡中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/532GK103728447SQ201410003726
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】殷俊, 楊唐斌 申請人:北京晶泰美康生物科技有限公司