基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的人呼吸道合胞病毒快速檢測方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人 呼吸道合胞病毒抗原的快速檢測方法及檢測試劑盒，以及該檢測試劑盒的制備及使用方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV)是一種RNA病毒，屬副粘 液病毒科。該病經(jīng)空氣飛沫和密切接觸傳播。多見于新生兒和6個月以內(nèi)的嬰兒。潛伏期 3~7日。嬰幼兒癥狀較重，可有高熱、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表現(xiàn)為細(xì)支氣管炎及肺炎。 少數(shù)病兒可并發(fā)中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年長兒童感染后，主要表現(xiàn)為上呼吸道 感染。
[0003] WHO數(shù)據(jù)顯示，全球每年的呼吸道合胞病毒感染者約有6400萬例，16萬例死亡。近 十年來合胞病毒肺炎及毛細(xì)支氣管炎占我國嬰幼兒病毒性肺炎第一位，其癥狀與副流感病 毒肺炎、輕癥流感病毒肺炎及輕癥腺病毒肺炎臨床上幾乎無法區(qū)別，不做病原學(xué)檢查，很難 確診呼吸道合胞病毒感染。因此建立簡便、快速、可行、能早期診斷呼吸道合胞病毒感染的 方法非常必要。
[0004] 目前呼吸道合胞病毒的檢測方法主要有3類：一是分離培養(yǎng)法，其是證實(shí)感染的 "金標(biāo)準(zhǔn)"，但由于培養(yǎng)周期較長，操作步驟較多，導(dǎo)致該法在臨床上不能進(jìn)行快速診斷；二 是血清學(xué)方法，即采用酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗(yàn)等，檢 測被檢者血清中呼吸道合胞病毒抗體水平，可間接提示呼吸道合胞病毒感染的存在。然而， 血清學(xué)試驗(yàn)只能提供一種回顧性的診斷，而且有時需要雙份血清。另外，抗體出現(xiàn)的時機(jī) 不易掌握，兒童、青少年與成人之間又存在呼吸道合胞病毒特異性抗體的差異，故現(xiàn)有血清 學(xué)方法的檢測質(zhì)量受到一定限制；三是利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測呼吸道合胞病毒DNA的存 在，其中最常用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，該方法快速、靈敏、特異，是目前研究人呼吸道 合胞病毒感染的重要手段，但由于PCR對實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及操作要求較高，且易出現(xiàn)假陽性，在 我國還不能作為常用的臨床診斷方法。因此，建立人呼吸道合胞病毒特異性抗原診斷方法 十分必要。目前，已公開報道的檢測人呼吸道合胞病毒抗原的方法主要為雙抗夾心ELISA 法、膠體金免疫層析法、間接免疫熒光法等，但這些方法或存在操作步驟繁多、檢測時間長， 或存在檢測靈敏度低、檢測成本高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對【背景技術(shù)】中存在的這些技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn) 標(biāo)記的能簡便、快速、高靈敏度的檢測人呼吸道合胞病毒抗原的檢測方法和試劑盒，以及該 試劑盒的制備及使用方法。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人呼吸道合胞病毒抗原的方法，其特征在 于：所述該方法包括以下步驟：
[0008] 1)兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體的制備；
[0009] 2)鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體的制備；
[0010] 3)將步驟1)制備得到的兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體與納米磁珠通 過共價偶聯(lián)，制備抗人呼吸道合胞病毒免疫納米磁珠；
[0011] 4)將步驟2)制備得到的鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體與納米量子點(diǎn) 通過共價偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人呼吸道合胞病毒納米探針；
[0012] 5)取人呼吸道分泌物樣本（包括但不限于咽拭子），用樣品處理液溶解后，加入 步驟3)制備得到的抗人呼吸道合胞病毒免疫納米磁珠，充分混合，反應(yīng)10-45min后進(jìn)行 磁分離，以 PBST 緩沖液（8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1. 44g/L Na2HPO4,0.3g/ L NaN3,0. 5ml/L Tween-20 ;pH7. 4)洗滌2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備 得到的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人呼吸道合胞病毒納米探針，反應(yīng)l〇_45min后進(jìn)行磁分離，以PBST 緩沖液洗滌2遍后，使用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光值；所述樣品處理液中各組分含量分別為Sg/ L NaCL,0. 2g/LKCl,0. 24g/L KH2PO4,1. 44g/L Na2HPO4,0. 3g/L NaN3,5ml/L Nonidet P-40, 5ml/L Triton X-100,所述樣品處理液的pH = 7. 4 ;
[0013] 6)根據(jù)步驟1)-步驟5)的方法分別檢測四份經(jīng)臨床確定為人呼吸道合胞病毒陰 性的人群的呼吸道分泌物樣品，讀取熒光值；所述人呼吸道合胞病毒陰性的人群的呼吸道 分泌物樣品簡稱人呼吸道合胞病毒陰性對照樣品；所述四份人呼吸道合胞病毒陰性對照樣 品的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為⑶T-OFF值；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本 的檢測熒光值大于⑶T-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人呼吸道合胞病毒抗原為 陽性；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測熒光值小于⑶T-OFF值，則判斷為人呼吸道 分泌物樣本中人呼吸道合胞病毒抗原為陰性。
[0014] 一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人呼吸道合胞病毒抗原的試劑盒，其特征 在于：所述基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人呼吸道合胞病毒抗原的試劑盒由具有富集 人呼吸道合胞病毒抗原功能的抗人呼吸道合胞病毒免疫納米磁珠、量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人呼吸 道合胞病毒納米探針、質(zhì)控品、樣品處理液以及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì)控品包括陽性 質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；所述陽性質(zhì)控品由滅活的人呼吸道合胞病毒干燥結(jié)合到拭子上而 成；所述陰性質(zhì)控品是經(jīng)臨床確定為人呼吸道合胞病毒陰性的人群的咽拭子。
[0015] -種用于制備基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人呼吸道合胞病毒抗原的試劑 盒的方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：
[0016] 1)抗人呼吸道合胞病毒免疫納米磁珠的制備：
[0017] I. 1)兔及鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0018] I. I. 1)重組NP-His融合蛋白的制備、純化：
[0019] I. I. I. 1)對人呼吸道合胞病毒核蛋白NP進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取其保守結(jié)構(gòu) 域中抗原表位最為豐富的肽段；
[0020] I. I. 1. 2)找到步驟I. I. I. 1)中所得到肽段對應(yīng)的基因編碼序列，根據(jù)大腸桿菌 中密碼子的偏好性，對步驟1. 1. 1. 1)中所得到基因編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化；
[0021] I. I. 1. 3)在步驟I. I. 1. 2)中所得到的基因序列的5'端及3'端引入酶切位點(diǎn)并 化學(xué)合成全基因序列，同時標(biāo)記記為np ;其基因序列如序列表所示；
[0022] I. I. 1. 4)將步驟I. I. 1. 3)中所得到的np按分子生物學(xué)方法克隆入表達(dá)載體 pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組NP-His融合蛋白；所述重組NP-His融合蛋白以包 涵體表達(dá)方式存在于菌體中；
[0023] I. I. 1. 5)用鎳柱純化步驟I. I. 1. 4)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測其純度后， 以Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度為0. 2mg/mL后備用；
[0024] I. 1. 2)兔及鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0025] I. 1. 2. 1)以步驟I. I. 1. 5)中所得到的重組NP-His融合蛋白為完全抗原，分別免 疫新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白抗血清及鼠抗人呼吸道 合胞病毒NP蛋白抗血清；所述兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白抗血清及鼠抗人呼吸道合胞 病毒NP蛋白抗血清的間接ELISA效價均大于I X IO5 ;
[0026] I. 1. 2. 2)采用Protein G親和層析柱分別純化兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白抗 血清及鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG ;
[0027] I. 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定步驟I. 1. 2. 2)所得到的二種 多克隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為lmg/mL后備用；
[0028] 1. 2)免疫納米磁珠的包被：
[0029] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用Iml MES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離 后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為1150nm的羧基磁珠；所述MES緩 沖液是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代）乙磺酸；所述MES緩沖液的pH = 6. 0 ;所述納米 磁分離器的磁性強(qiáng)度是〇. 4T ;
[0030] 1. 2. 2)依次加入用步驟L 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除 上清，用Iml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0031] 1.2. 3)取5個離心管，在每個離心管中加入200 μ L步驟1.2. 2)所得到的活化 后的磁珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液 稀釋的濃度為50-200 μ g/ml的由步驟I. 1)所制備的兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克 隆抗體IgG溶液各lml，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁分離 器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入1ml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以 15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中 各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1. 44g/L Na2HPO4，所述 PBS 緩沖 液的 pH = 7. 4 ;
[0032] I. 2. 4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移 除上清，各用Iml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/L NaCL， 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2P04，1.44g/L Na2HP04,0.5ml/L Tween-20,所述洗滌緩沖液的pH = 7.4 ；
[0033] I. 2. 5)向各個離心管中分別加入1ml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)?用；所述保存緩沖液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/L Na2HPO 4,0. 3g/L NaN3, 5g/L牛血清白蛋白（BSA)，所述保存緩沖液的pH = 7. 4 ;
[0034] 2)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人呼吸道合胞病毒納米探針的制備：
[0035] 其具體制備方法包括：
[0036] 2. 1)向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、300nmol N-羥基琥珀酰 亞胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，混合溶液，37°C反 應(yīng)30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及E：DC，得到活化后的量子點(diǎn)；所述 磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉； 所述磷酸鹽緩沖液的pH = 7. 4 ;
[0037] 2. 2)在步驟2. 1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入4_12nmol的步驟I. 1)中所制備 的鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙二醇 PEG2000-NH2至終濃度為1%，封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)Ih ;
[0038] 2. 3)用0. 2 μ m PES濾器過濾除去步驟2. 2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn)移到 50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和 反應(yīng)中的副產(chǎn)物；
[0039] 2. 4)收集步驟2. 3)中超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗