基于磁性分離和量子點標(biāo)記的汞中毒快速檢測方法與試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于磁性分離和量子點(QDs)標(biāo)記的液體生物樣品中汞的快速檢測方法，所述方法包括：1)制備抗汞單克隆抗體；2)將所述抗汞單克隆抗體與納米磁珠通過共價鍵偶聯(lián)，制備抗汞免疫納米磁珠；3)向所述液體生物樣品中加入雙功能螯合劑、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，進行溫育，之后加入所述抗汞免疫納米磁珠充分混合，之后進行磁分離，向磁分離得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗體和鏈霉親和素化的量子點(QDs)，使用熒光酶標(biāo)儀進行熒光檢測。本發(fā)明還提供一種用于液體生物樣品中汞的快速檢測的試劑盒。
【專利說明】基于磁性分離和量子點標(biāo)記的汞中毒快速檢測方法與試劑
合
Sl
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物與新醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點標(biāo)記技術(shù)快速檢測尿液中汞含量的方法以及一種用于快速檢測尿液中汞含量的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]汞(Hg)由于具有特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，其環(huán)境污染特征呈現(xiàn)持久性、遷移性、高毒性及生物蓄積性等四大顯著特點，對人體的危害程度極大。然而，盡管汞的毒性很強，由于當(dāng)前技術(shù)水平的限制，汞仍然被廣泛應(yīng)用于各種產(chǎn)品和工藝中，包括測壓表、溫度計、電氣開關(guān)、補牙劑、電池和電石法制聚氯乙烯等。目前，人為汞污染源已廣泛暴露，人類主要是通過飲食(尤其是食用魚類產(chǎn)品)攝入甲基汞，通過補牙劑和職業(yè)環(huán)境的暴露攝入汞元素。與此同時，一些日用品(如，化妝品)中汞含量嚴(yán)重超標(biāo)，進一步增加了汞中毒患者的數(shù)量。
[0003]目前，醫(yī)院主要通過檢測患者尿液中汞的含量，判斷病人是否汞中毒。尿汞的檢測方法主要有冷原子吸收分光光度法(AAS)和原子熒光光譜法(AFS)，盡管這些方法成熟，結(jié)果可信度高，但是樣品需要進行復(fù)雜的前處理，不適合快速檢測和大量樣品的篩選。
[0004]免疫分析法是檢測重金屬離子的一種新方法，檢測速度快、靈敏度高、選擇性強，迄今為止，已經(jīng)成功用于水中金屬離子的檢測。使用特異性的雙功能螯合劑，可以螯合重金屬離子并與載體蛋白偶聯(lián)，形成完整的免疫原，通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備特異性單克隆抗體，將抗重金屬的單克隆抗體連接到新型的Fe3O4磁性納米顆粒表面,可以使Fe3O4磁性納米顆粒具有靶向識別和磁性分離的雙重功能，從而實現(xiàn)重金屬的富集，提高檢測靈敏度。
[0005]量子點(QDs)，又稱為半導(dǎo)體納米微晶粒，是一種直徑在I?IOOnm能夠接收激發(fā)光產(chǎn)生熒光的納米顆粒。與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比，QDs具有量子產(chǎn)率高，光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易光解等優(yōu)良的光學(xué)特性。將量子點與抗體結(jié)合用于熒光免疫分析的報道越來越多，利用親和素修飾量子點后，量子點可以很容易的與生物素化的抗體結(jié)合，為抗體和量子點提供了一種分子連接的橋梁，應(yīng)用這種方法檢測毒素，可以達到用有機染料進行標(biāo)記的同等的檢測限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備汞單克隆抗體(HgMAb);活化的納米磁珠和QDs分別與HgMAb和二抗相連，制備免疫納米探針；利用免疫磁珠的可富集特性和QDs熒光信號的變化，以期建立多重信號協(xié)同放大、具有超高靈敏度的快速檢測人尿液中Hg含量的新方法，具有重要的科學(xué)意義和極廣闊的應(yīng)用前景。
[0007]技術(shù)問題:本發(fā)明的目的在于針對目前尚無的生物樣品中重金屬Hg的快速檢測方法，建立一種利用免疫磁珠高效分離與QDs熒光信號的變化，快速檢測尿液中Hg含量的分析方法。[0008]技術(shù)方案:本發(fā)明提供的基于磁性分離和量子點標(biāo)記的汞中毒快速檢測方法與試劑盒包括如下步驟:
[0009]l)Hg免疫抗原合成:Hg、雙功能螯合劑[(R)-2_硫氰基-3-(4-氨基苯基)丙基]-(S-S)環(huán)己烷-1，2 二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)、血藍(lán)蛋白(KLH)按照一定比例，在三乙胺(TEA)存在下，25°C振蕩反應(yīng)22h ;使用PBS緩沖液洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，并通過超濾管(30KD)濾掉未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；使用上述緩沖液稀釋抗原，備用。
[0010]2)Hg檢測抗原合成:將Hg、p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA與牛血清白蛋白(BSA)在TEA的作用下合成檢測抗原。
[0011]3)抗Hg單克隆抗體(HgMAb)的制備與純化:小鼠免疫后制備抗Hg雜交瘤細(xì)胞，然后大量制備腹水型HgMAb，最后使用飽和(NH4)2SO4沉淀法進行純化抗體，使用SephacryS-300進一步純化抗體。
[0012]4)抗Hg免疫磁珠(HgMAb-Fe3O4)制備:將HgMAb與Fe3O4納米磁珠偶聯(lián)，制備抗汞免疫磁珠(HgMAb-Fe3O4)。
[0013]5)檢測方法的效果評價:分別通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，檢出限，精密度，加標(biāo)回收率實驗以及與實際樣品使用原子熒光分光光度計的檢測結(jié)果對比，評價方法的準(zhǔn)確性與
可靠性。
[0014]有益效果:在我國汞污染嚴(yán)重，建立簡便、快速的汞中毒快速檢測方法不但對中毒病人的診斷、救治具有重要的理論意義和應(yīng)用價值，還將對提高我國公共衛(wèi)生管理水平和公共衛(wèi)生安全事件處置能力具有重要理論意義和現(xiàn)實意義。
[0015]本發(fā)明根據(jù)熒光免疫的雙抗體夾心原理，利用免疫磁珠分離速度快、效率高、操作簡便等優(yōu)點，結(jié)合QDs光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易光解等優(yōu)良的光學(xué)特性，分別以免疫磁珠和QDs為載體連接HgMAb和二抗，使得快速、準(zhǔn)確地檢測生物樣品中Hg的含量得以實現(xiàn)。
[0016]本發(fā)明僅用100 μ I尿，十幾微升的試劑，在少于Ih的時間內(nèi)即可實現(xiàn)對尿樣中汞含量的測定。由于使用的儀器為熒光酶標(biāo)儀，可以同時檢測96個樣品，成本低，省時高效。
[0017]更具體地，本發(fā)明提供以下各項:
[0018]1.用于液體生物樣品中汞的快速檢測的試劑盒，所述試劑盒包含:
[0019]抗汞免疫納米磁珠，所述抗汞免疫納米磁珠通過將抗汞單克隆抗體與納米磁珠經(jīng)由共價鍵偶聯(lián)制備；
[0020]雙功能螯合劑；
[0021]牛血清白蛋白(BSA)；
[0022]三乙胺(TEA)；
[0023]生物素化的BSA抗體；和
[0024]鏈霉親和素化的QDs。
[0025]2.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述納米磁珠是Fe3O4納米磁珠。
[0026]3.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述納米磁珠的粒徑為280nm。
[0027]4.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述雙功能螯合劑是p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA。
[0028]5.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述液體生物樣品選自尿液或血液。
[0029]6.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述液體生物樣品是尿液。
[0030]7.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述抗汞單克隆抗體利用汞免疫抗原制備，所述汞免疫抗原通過在三乙胺(TEA)的存在下將汞、雙功能螯合劑(優(yōu)選為p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)和血藍(lán)蛋白(KLH)混合來制備。
[0031]8.根據(jù)I所述的試劑盒，其中用于所述QDs的激發(fā)波長=488nm，并且用于所述QDs的發(fā)射波長=585nm。
[0032]9.基于磁性分離和量子點(QDs)標(biāo)記的液體樣品中汞的快速檢測方法，所述方法包括:
[0033]I)制備抗汞單克隆抗體；
[0034]2)將所述抗汞單克隆抗體與納米磁珠通過共價鍵偶聯(lián)，制備抗汞免疫納米磁珠；
[0035]3)向所述液體生物樣品中加入雙功能螯合劑(優(yōu)選為p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，進行溫育，之后加入所述抗汞免疫納米磁珠充分混合，之后進行磁分離，向磁分離得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗體和鏈霉親和素化的量子點(QDs)，使用熒光酶標(biāo)儀進行熒光檢測。
[0036]10.根據(jù)9所述的方法，其中所述納米磁珠是Fe3O4納米磁珠，其粒徑優(yōu)選為280nm。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1是本發(fā)明汞免疫抗原紫外光譜圖，圖2是本發(fā)明汞檢測抗原紫外光譜圖。從圖中可以看出吸收峰發(fā)生偏移，說明抗原合成成功。
[0038]圖3是本發(fā)明小鼠血清抗汞效價圖，圖4是本發(fā)明小鼠血清抗汞特異性圖。從圖中可以看出，小鼠血清抗汞效價為32000，抗汞的特異性為32000，表明小鼠免疫成功。
[0039]圖5是本發(fā)明抗汞雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清液效價圖。從圖中看出我們篩選出了一株抗汞特異性和效價均較高的細(xì)胞株。
[0040]圖6是本發(fā)明抗汞雜交瘤細(xì)胞腹水效價圖。圖7是本發(fā)明抗汞雜交瘤細(xì)胞腹水特異度圖。從圖中可以看出，小鼠雜交瘤細(xì)胞腹水抗汞效價和特異度均能達到25600，說明腹水中存在特異性的抗汞抗體。
[0041]圖8是經(jīng)純化的抗汞單克隆抗體效價圖。從圖中可以看出，經(jīng)純化后的抗汞單克隆抗體效價較高。
[0042]圖9是純化后抗汞單克隆抗體凝膠電泳圖。從圖中可以看出提取的抗體分子量為25KDa和50KDa，沒有異常條帶，純度較高。
[0043]圖10是納米磁珠與單克隆抗體反應(yīng)的示意圖。
【具體實施方式】
[0044]通過以下實施例進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的權(quán)利要求不僅限于實施例。
[0045]實施例1
[0046]I)Hg免疫抗原合成:將Hg(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，GSB04-1729-2004)、雙功能螯合劑[(R) _2_硫氰基-3-(4-氨基苯基)丙基]-(S-S)環(huán)己烷-1,2 二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA) (Macroyclics，美國)、血藍(lán)蛋白(KLH)(Sigma，美國，H7017)、三乙胺(TEA)按照 Hg:p-SCN-Bn-CHX_A " -DTPA:KLH:TEA=9:12:200:13(ff/ff/ff/ff)的比例，25°C振蕩反應(yīng)22h ;使用PBS緩沖液洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，并通過超濾管(30KD)濾掉未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；使用PBS緩沖液稀釋所獲得的Hg免疫抗原。
[0047]2) Hg 檢測抗原合成:將 Hg、p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA、牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，美國，A1933)和 TEA 按照 Hg:p-SCN-Bn-CHX_A " -DTPA:BSA: TEA=9:12:200:13 (ff/W/ff/ff)的比例合成檢測抗原。免疫抗原和檢測抗原的鑒定如圖1、2所示。
[0048]實施例2
[0049]抗Hg單克隆抗體(HgMAb)的制備與純化:
[0050]將1.0mg/ml的Hg免疫抗原與等體積弗氏完全佐劑(FCA)，通過注射器雙推法充分混勻，使其形成白色油包水乳狀物，即抗原乳化劑。使用多點免疫法，免疫6周齡雌性Balb/C小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，211)，每隔2周免疫I次，共免疫5次。在進行第2、3、4次免疫時，將Hg免疫抗原與等體積弗氏不完全佐劑(FIA)混合，以同樣劑量加強免疫，第5次免疫時,僅用Hg免疫抗原而不加佐劑。小鼠免疫后小鼠血清的效價與特異性如圖3-4所示。取抗血清效價最高的免疫小鼠制備脾細(xì)胞，按照參考文獻(Howard.G.C.，Kaser.M.R.的抗體制備與使用實驗指南[M].北京:科學(xué)出版社，2010.)將脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，KG075)融合，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞進行克隆，陽性率達到100%后將細(xì)胞擴大培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。將陽性細(xì)胞注射到小鼠腹腔，抽取腹水，評價腹水效價，結(jié)果如圖6、7所示。腹水分別使用飽和(NH4)2SO4沉淀法和Sephacry S-300柱層析法純化腹水中的PbMAb。將純化的抗體進行效價檢測和凝膠電泳實驗，結(jié)果分別如圖8和9所示。
[0051]實施例3`[0052]抗Hg免疫磁珠(HgMAb-Fe3O4)的制備:因為納米磁珠(Dynabeads?M-280Tosylactivated, lifetechnologies,美國，14203)背景值低，抗體與微珠表面共價連接，是使蛋白質(zhì)復(fù)合物免疫沉淀的極佳選擇。微珠磁性聚集溫和而快速并且孵育耗時極短。因此納米磁珠選用Dynabeads? M-280Tosylactivated,其粒徑為280nm?？笻g免疫磁珠合成步驟如下:
[0053](I)取165 μ L納米磁珠,磁分離Imin,去除上清；
[0054](2)加入100 μ g抗Hg單克隆抗體和0.1M pH7.4的磷酸緩沖液反應(yīng)使體積變?yōu)?50 μ L，渦旋震蕩；
[0055](3)加 100 μ L3M (NH4)2SO4^0.1M ρΗ7.4 的磷酸緩沖液渦旋震蕩；
[0056](4) 37°C搖動孵化 12_18h ；
[0057](5)磁分離2min,去除上清；
[0058](6)移除磁鐵，加入ImL0.5%BSA0.01M ρΗ7.4的磷酸緩沖液，37°C搖動孵化Ih ；
[0059](7)磁分離2min,去除上清；
[0060](8)移除磁鐵，加入ImL0.1%BSA0.01M pH7.4的磷酸緩沖液，渦旋振蕩5_10s。
[0061](9)磁分離2min,去除上清；
[0062](10)重復(fù)步驟 7-8 ；
[0063](11)用240 μ L0.1%BSA0.01M pH7.4的磷酸緩沖液重懸免疫磁珠。
[0064]納米磁珠與抗Hg單克隆抗體反應(yīng)原理如圖10所示。
[0065]實施例4
[0066]基于磁性分離和量子點標(biāo)記的汞中毒的快速檢測方法:[0067](I)向 0.1mL尿樣中加入，13 μ 110 μ g/ml p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA, I μ 12.17mg/ml BSA 和 I μ 14.6Χ1θΛοΤΕΑ, 37°C搖床反應(yīng) 15min。
[0068](2)加入2 μ L抗Hg免疫磁珠反應(yīng)15min后磁分離2min。
[0069](3)加入4μ L生物素化的BSA抗體(abcam，英國，ab7636)和I μ LlmM的鏈霉親和素化得量子點(Qdot? 585Streptavidin Conjugate, lifetechnologies,美國，Q10113MP)，37°C搖床反應(yīng)15min后磁分離2min。
[0070](4)用熒光酶標(biāo)儀進行結(jié)果檢測(Ex=488nm，Em=585nm)。
[0071]標(biāo)準(zhǔn)曲線測定:取健康人空白尿樣100μ L于200 μ L離心管中，加入不同濃度的Hg配制成濃度分別為1、10、100、500和1000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)尿樣。按本發(fā)明的快速檢測方法處理，以濃度(C)對吸光度(OD)進行線性回歸，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C=59.4910D-535.052，R=0.963。該檢測方法線性范圍為l-1000ng/ml，最低檢出限為lng/ml。
[0072]加標(biāo)回收率測定:將0.1mL病人血樣(北京朝陽醫(yī)院職業(yè)病與中毒醫(yī)學(xué)中心)分別加入50ng Hg然后將其按照快速檢測方法處理后檢測，通過測得量與加入量的比值，計算加標(biāo)回收率。加標(biāo)回收率為94.70%—101.18%。
[0073]精密度測定:配制Hg低、中、高3種濃度的尿樣，按照本發(fā)明的快速檢測方法處理，進樣測定。I天內(nèi)平行操作5次，計算日內(nèi)精密度。結(jié)果如表1所示。
[0074]表1:尿樣中汞含量測定精密度(n=5)
【權(quán)利要求】
1.用于液體生物樣品中汞的快速檢測的試劑盒，所述試劑盒包含: 抗汞免疫納米磁珠，所述抗汞免疫納米磁珠通過將抗汞單克隆抗體與納米磁珠經(jīng)由共價鍵偶聯(lián)制備； 雙功能螯合劑； 牛血清白蛋白(BSA)； 三乙胺(TEA)； 生物素化的BSA抗體；和 鏈霉親和素化的QDs。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述納米磁珠是Fe3O4納米磁珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述納米磁珠的粒徑為280nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述雙功能螯合劑是p-SCN-Bn-CHX-A" -DTPA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述液體生物樣品選自尿液或血液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述液體生物樣品是尿液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述抗汞單克隆抗體利用汞免疫抗原制備，所述汞免疫抗原通過在三乙胺(TEA)的存在下將汞、雙功能螯合劑(優(yōu)選為p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)和血藍(lán)蛋白(KLH)混合來制備。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中用于所述QDs的激發(fā)波長=488nm，并且用于所述QDs的發(fā)射波長=585nm。
9.基于磁性分離和量子點(QDs)標(biāo)記的液體樣品中汞的快速檢測方法，所述方法包括: 1)制備抗萊單克隆抗體； 2)將所述抗汞單克隆抗體與納米磁珠通過共價鍵偶聯(lián)，制備抗汞免疫納米磁珠； 3)向所述液體生物樣品中加入雙功能螯合劑(優(yōu)選為p-SCN-Bn-CHX-A" -DTPA)、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，進行溫育，之后加入所述抗汞免疫納米磁珠充分混合，之后進行磁分離，向磁分離得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗體和鏈霉親和素化的量子點(QDs)，使用熒光酶標(biāo)儀進行熒光檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述納米磁珠是Fe3O4納米磁珠，其粒徑優(yōu)選為280nm。
【文檔編號】G01N33/533GK103698526SQ201410014482
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】黃沛力, 孫湖泊, 王萌萌, 王吉龍 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)