豬流行性腹瀉病毒elisa檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒及其制備方法。所述豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒包括：酶標(biāo)板、檢測抗體和酶標(biāo)二抗，其中所述酶標(biāo)板上包被有抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體，所述檢測抗體為抗豬流行性腹瀉病毒的多克隆抗體，所述酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記且抗檢測抗體的抗體。所述豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒以腹瀉豬的嘔吐物和糞便中的PEDV為檢測對象，能夠及早發(fā)現(xiàn)PEDV感染豬，同時降低檢測的操作難度。
【專利說明】 豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及豬流行性腹瀉病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種檢測試劑盒及其制備方法，特別涉及一種豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬病毒性腹灣的病原包括豬流行性腹灣病毒(porcine epidemic diarrheavirus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)和豬輪狀病毒(Porcine rota virus，PRV)，其中PEDV在我國呈現(xiàn)爆發(fā)趨勢。豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由PEDV引起的一種高致死率、急性、高度傳播性的腸道疾病，該病以急性腸炎、嘔吐、伴有脫水的水樣腹瀉為主要特征，各年齡豬均易感，尤其是哺育仔豬，發(fā)病率為100%，死亡率為80%-100%。近幾年來，由豬流行性腹瀉引起的爆發(fā)性疾病日漸增多，在2010年冬季至2011年春季全國各地豬場的豬群中先后爆發(fā)了由流行性腹瀉病毒引起的腹瀉，該次發(fā)病流行范圍廣，流行時間長，死亡率高，給各地養(yǎng)殖戶均帶來重大的經(jīng)濟損失。
[0003]目前豬流行性腹瀉疾病尚缺乏有效的針對性的根治手段，主要靠預(yù)防監(jiān)控和隔離處理。在檢測豬流行腹瀉病毒方面目前主要通過病毒分離培養(yǎng)、間接免疫熒光、原位雜交以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等。這些方法都存在不同程度的耗時時間長、所需儀器昂貴等缺點，不便于普遍開展監(jiān)測工作。目前基于免疫吸附原理的檢測試劑盒由于具有方便快捷、操作簡單和所需儀器簡單的特點越來越受到研究者重視。現(xiàn)有的商品化檢測試劑盒(我國尚無商品化檢測試劑盒)以及相關(guān)專利均是以抽血檢測抗體為共同特點，這種檢測一方面存在從病原侵襲到抗體產(chǎn)生的滯后性，另一方面抽血也在一定程度上存在復(fù)發(fā)感染和傳染的可能性，同時會對豬產(chǎn)生一定的應(yīng)急，也會增加一定程度上的操作難度。另外，目前較多豬場均有針對性地進行滅活苗的免疫措施，這也會導(dǎo)致體內(nèi)抗體的檢測并不能說明是免疫后產(chǎn)生的抗體還是因為感染病毒后產(chǎn)生的抗體。
[0004]流行性腹瀉病毒存在于腸絨毛上皮細胞和腸系膜淋巴結(jié)，主要隨嘔吐物和糞便排出體內(nèi)，因此本領(lǐng)域需要一種針對流行性腹瀉豬的嘔吐物和糞便中的PEDV病原進行檢測的試劑盒產(chǎn)生，以能夠方便的從嘔吐物和糞便中檢測到PEDV，以便及早發(fā)現(xiàn)PEDV感染豬，同時降低檢測的操作難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒及其制備方法，該ELISA檢測試劑盒以腹瀉豬的嘔吐物和糞便中的PEDV病原為檢測對象，特異性卵黃多克隆抗體提高檢測靈敏度，能夠及早發(fā)現(xiàn)PEDV感染豬，避免PEDV抗體檢測試劑盒的假陽性現(xiàn)象，同時降低檢測的操作難度。
[0006]本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0007]在第一方面，本發(fā)明提供一種豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒，包括:酶標(biāo)板、檢測抗體和酶標(biāo)二抗，其中所述酶標(biāo)板上包被有抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體，所述檢測抗體為抗豬流行性腹瀉病毒的多克隆抗體，所述酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記且抗檢測抗體的抗體。
[0008]本發(fā)明的ELISA檢測試劑盒包括酶標(biāo)板、檢測抗體和酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)板上包被有抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體用于特異性捕獲腹瀉豬的嘔吐物和糞便中的PEDV ；檢測抗體為抗豬流行性腹瀉病毒的多克隆抗體，用于與被捕獲的PEDV結(jié)合，并提供酶標(biāo)二抗的結(jié)合位點；酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記且抗檢測抗體的抗體，用于與檢測抗體結(jié)合，并通過酶促發(fā)光顯不信號。
[0009]作為ELISA檢測試劑盒，酶標(biāo)板、檢測抗體和酶標(biāo)二抗是其核心成分，只要有這三種成分就能實現(xiàn)基本的抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)。至于輔助成分，比如樣品稀釋液、洗滌液、酶底物溶液、終止液、陽性對照和陰性對照，可以與上述三種成分配套組裝在一個ELISA檢測試劑盒中，也可以單獨提供，因此本發(fā)明中ELISA檢測試劑盒可以包括這些輔助成分，也可以不包括，本發(fā)明優(yōu)選包括這些輔助成分，以方便使用。
[0010]本發(fā)明中，檢測抗體可以是來源于各種哺乳動物的抗豬流行性腹瀉病毒的多克隆抗體，比如來源于兔、鼠、羊、馬或驢的抗豬流行性腹瀉病毒的多克隆抗體，優(yōu)選鼠抗豬流行性腹瀉病毒的多克隆抗體。
[0011]本發(fā)明中制備多克隆抗體的方法，是目前比較成熟的技術(shù)，具體地，可以用純化的病毒或者重組表達的病毒蛋白免疫動物，分離血清或卵黃，并通過沉淀離心、層析等方法從血清或卵黃中提取抗體。本發(fā)明中的特異性卵黃抗體是將PEDV病原免疫蛋雞后通過硫酸銨沉淀法和親和層析方法得到。
[0012]本發(fā)明中，在親和層析柱上偶聯(lián)的豬流行性腹瀉病毒蛋白有多種，包括但不限于M蛋白、N蛋白和SI蛋白，本發(fā)明優(yōu)選SI蛋白。因此，本發(fā)明的酶標(biāo)板上包被的抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體是利用偶聯(lián)了豬流行性腹瀉病毒的SI蛋白的親和層析柱純化得到的特異性抗體。
[0013]本發(fā)明中，對酶標(biāo)二抗不作特別限定，具體根據(jù)所使用的檢測抗體的來源確定。當(dāng)檢測抗體來源于鼠時，酶標(biāo)二抗可以是羊抗鼠抗體、兔抗鼠抗體或馬抗鼠抗體等；當(dāng)檢測抗體來源于兔時，可以是鼠抗兔抗體或羊抗兔抗體等。本發(fā)明優(yōu)選酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體。
[0014]本發(fā)明中，所述酶標(biāo)二抗中的標(biāo)記酶可以是本領(lǐng)域常用的各種標(biāo)記酶，比如:辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)，本發(fā)明優(yōu)選采用辣根過氧化物酶標(biāo)記酶標(biāo)二抗。
[0015]本發(fā)明中，所述ELISA檢測試劑盒還可以包括:樣品稀釋液，用于稀釋豬嘔吐物或糞便等樣品。本發(fā)明的樣品稀釋液可以是各種適宜的緩沖液，比如Tris-Cl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、氨基酸緩沖液或硼酸鹽緩沖液等，也可以是生理鹽水，但是優(yōu)選PH7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液。
[0016]本發(fā)明中，所述ELISA檢測試劑盒還可以包括:洗滌液，用于樣品與酶標(biāo)板反應(yīng)后的清洗及檢測抗體反應(yīng)后的清洗，也用于酶標(biāo)二抗反應(yīng)后的清洗。本發(fā)明的洗滌液可以是添加各種表面活性劑的適宜的緩沖液，比如添加TWeen-20、NP-40或Bri j-35等的磷酸鹽緩沖液，本發(fā)明優(yōu)選含0.05% (v/v)Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
[0017]本發(fā)明中，所述ELISA檢測試劑盒還可以包括:酶底物溶液，用于提供酶標(biāo)二抗的反應(yīng)底物。當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，酶底物溶液可以包含鄰苯二胺(o-Phenylenediamine, OPD)或 3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine, TMB)，優(yōu)選3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酶時，酶底物溶液可以包含對硝基酚憐酸二鈉(P-Nitrophenyl Phosphate Disodium, pNPP)。
[0018]本發(fā)明中，所述ELISA檢測試劑盒還可以包括:終止液，用于終止反應(yīng)。本發(fā)明中，所述終止液優(yōu)選為硫酸溶液。
[0019]本發(fā)明中，所述ELISA檢測試劑盒還可以包括:陽性對照和陰性對照；其中，所述陽性對照為包含滅活純化后的豬流行性腹瀉病毒的溶液；所述陰性對照為牛血清白蛋白溶液。
[0020]在第二方面，本發(fā)明提供一種制備如第一方面所述的豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒的方法，包括:
[0021](I)用豬流行性腹瀉病毒免疫蛋雞后提取抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體；
[0022](2)用所述特異性卵黃抗體包被空白酶標(biāo)板，得到包被的酶標(biāo)板；
[0023](3)將所述包被的酶標(biāo)板與檢測抗體和酶標(biāo)二抗組合成ELISA檢測試劑盒；
[0024]任選地，還包括將樣品稀釋液、洗滌液、酶底物溶液、終止液、陽性對照和陰性對照組合到ELISA檢測試劑盒中。
[0025]本發(fā)明中，所述 步驟(1)具體包括:
[0026]( la)培養(yǎng)并純化豬流行性腹瀉病毒；
[0027]( Ib)用所述豬流行性腹瀉病毒免疫蛋雞；
[0028]( Ic)分離蛋黃，然后通過硫酸銨沉淀法粗提抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體；
[0029](Id)通過豬流行性腹瀉病毒蛋白偶聯(lián)的親和層析柱親和層析純化得到抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體。
[0030]優(yōu)選地，所述豬流打性腹?與病毒蛋白選自M蛋白、N蛋白和SI蛋白，更優(yōu)選SI蛋白。
[0031]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的ELISA檢測試劑盒以豬流行性腹瀉病毒抗原作為檢測對象，采用豬的嘔吐物和糞便作為檢測樣本，相比檢測血清中的抗體的方法，其操作簡單；并且由于抗原出現(xiàn)早于抗體，因此能夠及早發(fā)現(xiàn)PEDV感染豬。此外，本發(fā)明采用抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體包被酶標(biāo)板用于捕獲PEDV，通過親和層析分離得到的特異性卵黃抗體作為包被抗體有利于避免PEDV以外蛋白在酶標(biāo)板結(jié)合，從而避免了酶標(biāo)二抗與一些雜蛋白的結(jié)合，減少假陽性發(fā)生率，提高最終檢測結(jié)果的特異性；檢測抗體采用鼠抗PEDV的多克隆抗體，通過HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)二抗來進一步增加反應(yīng)的靈敏度，同時降低檢測抗體的用量和成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為PEDV病毒免疫蛋雞并提取抗PEDV特異性卵黃抗體的工藝流程圖。
[0033]圖2為純化的抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果圖。
[0034]圖3為使用PEDV檢測試劑盒檢測樣本的操作方法流程圖?！揪唧w實施方式】
[0035]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，以下實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換或改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0036]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。
[0037]實施例1:PEDV病毒免疫蛋雞后提取抗PEDV特異性卵黃抗體
[0038]按照圖1所示的流程制備抗PEDV特異性卵黃抗體:
[0039](I)PEDV培養(yǎng)及純化:商購的非洲綠猴腎(vero)細胞用含10%新生牛血清的DMEM生長液(PH值為7.2)于37°C培養(yǎng)，待細胞培養(yǎng)48h鋪滿培養(yǎng)瓶后，輕輕倒掉上清，用不含血清的DMEM維持液洗細胞3次，接種1/50體積的PEDV病毒(PEDV CV777株(由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心惠贈))，吸附細胞lh，再補加IOmL無新生牛血清(FBS)、無胰酶的維持液，將細胞培養(yǎng)瓶置于37°C，含5%C02孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待80%以上細胞出現(xiàn)病變時，-20°C至37°C反復(fù)凍融三次,3000rpm離心15min,取上清,然后再8000rpm高速離心30分鐘后取上清。27000rpm超速離心2h，將沉淀用少量STE溶液(0.1M NaCl, IOmMTris-Cl (pH8.0),lmM EDTA (pH8.0))溶解。在超速離心管中加入5_8mL的超速離心所獲取的含病毒樣品的溶解液，然后在離心管中依次加入30%、45%、60%的蔗糖，27000rpm離心
2.5h，用長針頭將30%與45%以及45%與60%之間的明亮帶吸取至離心管中，用STE緩沖液適量稀釋純化的病毒，然后27000rpm離心3h，去上清，用少量PBS (根據(jù)沉淀的量決定加入多少)緩沖液把沉淀懸起，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040](2)免疫蛋雞:測定純化后PEDV的濃度，用PBS將純化后的PEDV的濃度調(diào)整至
0.01?0.lmg/mL,將調(diào)整后的病毒液與佐劑按照1:1比例相混合后免疫蛋雞，蛋雞品種為白萊杭雞，免疫程序見表1:
[0041]表I蛋雞免疫程序
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒，包括:酶標(biāo)板、檢測抗體和酶標(biāo)二抗，其中所述酶標(biāo)板上包被有抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體，所述檢測抗體為抗豬流行性腹瀉病毒的多克隆抗體，所述酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記且抗檢測抗體的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體為鼠抗豬流行性腹瀉病毒的多克隆抗體； 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)二抗是用辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，優(yōu)選用辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)二抗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒，其特征在于，還包括:樣品稀釋液； 優(yōu)選地，所述樣品稀釋液為PH7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒，其特征在于，還包括:洗漆液； 優(yōu)選地，所述洗滌液為含表面活性劑的磷酸鹽緩沖液； 更優(yōu)選地，所 述表面活性劑為Tween-20，其含量為0.05% (v/v)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒，其特征在于，還包括:酶底物溶液； 優(yōu)選地，所述酶底物溶液包含鄰苯二胺或3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺，優(yōu)選3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒，其特征在于，還包括:終止液； 優(yōu)選地，所述終止液為硫酸溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒，其特征在于，還包括:陽性對照和陰性對照； 優(yōu)選地，所述陽性對照為包含滅活純化后的豬流行性腹瀉病毒的溶液； 優(yōu)選地，所述陰性對照為牛血清白蛋白溶液。
9.一種制備如權(quán)利要求1-8任一項所述的豬流行性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒的方法，包括: (1)用豬流行性腹瀉病毒免疫蛋雞后提取抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體； (2)用所述特異性卵黃抗體包被空白酶標(biāo)板，得到包被的酶標(biāo)板； (3)將所述包被的酶標(biāo)板與檢測抗體和酶標(biāo)二抗組合成ELISA檢測試劑盒； 任選地，還包括將樣品稀釋液、洗滌液、酶底物溶液、終止液、陽性對照和陰性對照組合到ELISA檢測試劑盒中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體包括: (Ia)培養(yǎng)并純化豬流行性腹瀉病毒； (Ib)用所述豬流行性腹瀉病毒免疫蛋雞； (Ic)分離蛋黃，然后通過硫酸銨沉淀法粗提抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體； (Id)通過豬流行性腹瀉病毒蛋白偶聯(lián)的親和層析柱親和層析純化得到抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體；優(yōu)選地，所述豬 流行性腹瀉病毒蛋白選自M蛋白、N蛋白和SI蛋白，更優(yōu)選SI蛋白。
【文檔編號】G01N33/569GK103777010SQ201410041062
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】祁振強, 盧超 申請人:深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司