專利名稱：：豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及弱毒疫苗株，尤其涉及豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株及其應(yīng)用，屬丁生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豬流行性腹瀉(PorcineEpidemicDiarrhea，PED)是一種急性、高度接觸性的傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和新生仔豬的高死亡率為特征。本病70年代初首先發(fā)現(xiàn)于英國和比利時(shí)。1976年，暴發(fā)了類似TGE的急性腹瀉，已排除了TGEV作為病原的可能，也不是其它已知腸致病性病原，Wood把這次暴發(fā)的腹瀉稱為腹瀉II型，以便與70年代初發(fā)生的腹瀉(稱為l型)區(qū)別。1978年P(guān)ensaert等發(fā)現(xiàn)一種類冠狀病毒的病原與II型腹瀉暴發(fā)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明I型和II型腹瀉的發(fā)生是由相同的冠狀病毒引起的，即豬流行性腹瀉病毒(PorcineEpidem!cDiarrheaVirus，PEDV)故把這種腹瀉稱為豬流行性腹瀉。1973年先后在我國上海、遼寧、吉林、黑龍江、四川等地分離到TGE和PED病毒抗原。TGE和PED在病毒抗原形態(tài)，臨床癥狀，流行病學(xué)極其相似，唯免疫學(xué)和血清學(xué)相互沒有交叉反應(yīng)。PED是獨(dú)立的豬的急性腸道傳染病。病豬是主要的傳染源，流行主要發(fā)生在冬季，也有發(fā)生于夏季或春秋季節(jié)。病毒存在于腸絨毛上皮和腸系膜淋巴結(jié)，PEDV隨糞便排出后，污染周圍環(huán)境、車輛、衣服、鞋、用具等而散播傳染。PEDV主要通過被感染豬只排出的糞便或污染物經(jīng)口途徑自然感染。哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100%，尤以哺乳仔豬受害最為嚴(yán)重，母豬發(fā)病率為15-90%。PED單一發(fā)生或PED和TGE混合感染發(fā)病。病豬表現(xiàn)嘔吐，迅速腹瀉脫水，腹瀉糞便呈水樣，黃色或灰黃色，體溫暴本正常，仔豬頻死前體溫下降。嘔吐多是發(fā)生在吃食和吃奶之后。中豬、肥豬和成豬常成精神委頓、厭食和持續(xù)3-7天的腹瀉，恢復(fù)后容易造成生長發(fā)育不良。輛變t嬰在小腸，小腸充血，腸壁變薄發(fā)亮，內(nèi)充滿黃色的液體。腸系膜充血，腸淋巴結(jié)充血、水腫。實(shí)驗(yàn)室診斷可采取豬小腸粘膜作抹片，進(jìn)行熒光抗體染色，發(fā)病豬小腸各段f'T發(fā)現(xiàn)多量的熒光細(xì)胞。小腸病變開始與空腸，而后波及整個(gè)小腸段。臨床出現(xiàn)腹瀉后6小時(shí)達(dá)到高峰，主要是上皮細(xì)胞變性、壞死和脫落。感染的上皮細(xì)胞、電鏡觀察可見絨毛減少或縮短，細(xì)胞漿破裂，在胞槳的空泡內(nèi)或滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可見到病毒粒子。免疫接種是防治該病的最有效手段。由哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的豬流行腹瀉組織滅活疫苗及豬胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗和—二聯(lián)活疫苗(已商品化)，具有較好的免疫預(yù)防效果，但其預(yù)防效果還有待加強(qiáng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的豬流行性腹瀉病毒(Porcinediarrheavirus，PEDV)弱毒疫苗株，用該弱毒疫苗株所制備的疫苗對于豬流行性腹瀉病毒具有良好的保護(hù)效力。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實(shí)現(xiàn)的豬流行性腹瀉病毒(Porcinediarrheavirus，PEDV)弱毒疫苗株，其保藏號是CCTCC—V200608;分類命名豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株CV777;保藏時(shí)間是2006年12月13日；保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址湖北省武漢巿武漢大學(xué)。本發(fā)明PEDV弱毒株的培育用PEDVCV777株(由比利時(shí)的Peresent教授饋贈)強(qiáng)毒適應(yīng)Vero細(xì)胞系，傳代毒83代轉(zhuǎn)向仔豬腎(PK)原代細(xì)胞培養(yǎng)，從90代起進(jìn)行5次克隆純化，頭2次選群斑，后3次選單斑，其中83-7-斑5株繼續(xù)傳代為147代，以克隆后35代毒(總代次134代)進(jìn)行6代次返祖試驗(yàn)，對不吃初乳的仔豬均無致病性，證明傳代弱毒毒力是穩(wěn)定的。本發(fā)明弱毒株的形態(tài)學(xué)觀察病毒細(xì)胞培養(yǎng)物上清離心后，將收獲的病毒懸液5000rpm離心30min，取上清，然后上清液15000rpm超速離心，4。C離心2h，沉淀用適境pH7.0PBS溶液懸浮，磷鴇酸負(fù)染電鏡檢査。結(jié)果可見到典型的冠狀病毒粒子的照片，病毒粒子呈球形，大小100180nm，具"纖突。通過對本發(fā)明毒株的基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了本疫苗毒株的特有基因序列特征，其特有基因序列特征如卜ORF3基因序列總L(:度為626bp(SEQIDNO:2)。與PEDVCV777株ORF3的序列相比，本發(fā)明弱毒株與CV777株ORF3的序列同源性為97.9%，本發(fā)明弱毒株從ORF3序列的ATG開始的第245位到293位共缺失了49個(gè)核苷酸，具體缺失的核苷酸序列為SEQIDNO:3所小。與PEDVBrl/87株ORF3的序列相比，本發(fā)明弱毒株與Brl/87株ORF3的序列同源性為97.8%，本發(fā)明弱毒株從ORF3序列的ATG開始的第245位到293位共缺失了49個(gè)核苷酸，具體缺失的核苷酸序列為SEQIDNO:4所示。本發(fā)明弱毒株的適應(yīng)細(xì)胞比較廣泛，例如，可以是Vero、E6等細(xì)胞。將本發(fā)明弱毒株被動免疫(接種母豬，通過母乳保護(hù)仔豬)保護(hù)率為95.92%，主動免疫(直接保護(hù)接種豬只)保護(hù)率為％.2%，表明本發(fā)明TGEV弱毒株對于豬流行性腹瀉病毒具有良好的免疫保護(hù)率。本發(fā)明弱毒株的安全性好，安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明弱毒株對妊娠母豬、仔豬等各年齡豬只均安全、無副反應(yīng)。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種新的疫苗，該疫苗由本發(fā)明弱毒株和佐劑組成選用生長良好的PK或PK15細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液后，換以含5%病毒種子液的新鮮培養(yǎng)液(乳漢液或)，置37。C繼續(xù)培養(yǎng)。接本發(fā)明弱毒株后，每日觀察。發(fā)現(xiàn)生長異常、污染的細(xì)胞應(yīng)廢棄。培養(yǎng)2-3日后，約有80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變，并與對照細(xì)胞差異顯著時(shí)，即可收獲，經(jīng)3次凍融后，置-2(TC保存。將收獲的兩種病毒每5瓶毒液為一組分別取樣，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。效價(jià)均應(yīng)20^TCID50/ml。將檢驗(yàn)合格的豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉細(xì)胞毒液等量混合液與保護(hù)劑(蔗糖明膠保護(hù)劑，明膠49g;蔗糖280g加無離子水700ml加熱溶解后，分裝，110116t:滅菌3060分鐘。)按7:l混合(病毒液保持在10-20°C，保護(hù)劑40-5(TC)，充分搖均后分裝，邊分裝邊搖動，得本發(fā)明疫苗；8ml疫苗瓶分裝量為23ml，迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。本發(fā)明疫苗的使用方法(1)接種途徑滴鼻、口服、后海穴位注射(尾根與肛門之間的凹陷處)、肌肉注射。(2)接種劑量(1頭份)。本發(fā)明疫苗的免疫持續(xù)期是母豬為1產(chǎn)，其它豬只6個(gè)月。本發(fā)明弱毒株應(yīng)用范圍較寬，例如，可應(yīng)用十制備成診斷豬流行性腹S病毒的i會斷試劑，還可應(yīng)用T制備成單苗或聯(lián)苗(活或滅活疫苗)疫苗等。圖1本發(fā)明弱毒株與PEDVCV777株ORF3的序列相比結(jié)果。圖2本發(fā)明弱毒株與PEDVBrl/87株ORF3的序列相比結(jié)果。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。具體實(shí)施方式實(shí)施例本發(fā)明豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株(PEDV)的制備PEDCV777強(qiáng)毒株由比利時(shí)的Peresent教授饋贈。PEDV弱毒株的培育用PEDVCV777株強(qiáng)毒適應(yīng)Vero細(xì)胞系，傳代毒83代轉(zhuǎn)向仔豬腎(PK)原代細(xì)胞培養(yǎng)，從90代起進(jìn)行5次克隆純化，頭2次選群斑，后3次選單斑，其中83-7-斑5株繼續(xù)傳代為147代，以克隆后35代毒(總代次134代)進(jìn)行6代次返祖試驗(yàn)，對不吃初乳的仔豬均無致病性，證明傳代弱毒毒力是穩(wěn)定的；將所得到弱毒株提交保藏，其微生物保藏號是CCTCC一V200608;保藏時(shí)間是2006年11月16日；保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址湖北省武漢市武漢大學(xué)。試驗(yàn)例1本發(fā)明豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株的基因序列特征分析根據(jù)GenBank中發(fā)表的PEDVCV777株(AF353511)的序列設(shè)計(jì)一對引物，用于擴(kuò)增本發(fā)明弱毒株一疫苗株(135代)的ORF3序列，引物如下PORF3U2:5-CCTAGACTTCAACCTTACGA-3'PORF3L2:5:CAGGAAAAAGAGTACGAAAA-3'PEDVCV777弱毒株一疫苗株(135)ORF3基因的測序結(jié)果為SEQIDNO:l所示；根據(jù)所測得的序列結(jié)果顯示與國外的毒株進(jìn)行Blast比對，然后去掉不屬于ORF3的序列，最終得出的PEDVCV777弱毒株一疫苗株(135代)ORF3基因序列總長度為626bp(SEQIDN0:2)。根據(jù)所測得的PEDVCV777弱毒株一疫苗株U35代)ORF3基因的序列與國外的毒株進(jìn)行比對和序列分析得出以下結(jié)論(l)與PEDVCV777株ORF3的序列相比，CV777弱毒株與CV777株ORF3的序列同源性為97.9%，PEDVCV777弱毒株從ORF3序列的ATG開始的第245位到293位一共缺失了49個(gè)核苷酸，具體缺失的核苷酸序列[為了區(qū)分強(qiáng)弱毒株，將弱毒株標(biāo)記為CV777(A)]如F:ATTGCCCACTTTTATATTACTGTGGTGCACTTTTAGATGCAACTATTAT(SEQIDNO:3);具體的比對結(jié)果見圖1。(2)與PEDVBr1/87株ORF3的序列相比，PEDCV777弱毒株與Br1/87株ORF3的序列同源性為97.8%，PEDVCV777弱毒株從ORF3序列的ATG開始的第245位到293位一共缺失了49個(gè)核苷酸，具體缺失的核苷酸序列為(SEQIDNO:4);具體的比對結(jié)果見圖2。試驗(yàn)例2本發(fā)明弱毒株(PEDV)的保護(hù)效力試驗(yàn)1試驗(yàn)材料1.1PED毒株適應(yīng)Vero細(xì)胞毒為PEDVCV777強(qiáng)毒株(比利時(shí)Pensaert教授饋贈，哈爾濱獸醫(yī)研究自行馴化培育)，效檢強(qiáng)毒為滬毒株。1.2細(xì)胞系Vero細(xì)胞，日本千葉大學(xué)清水文七教授惠贈。1.3制備原代腎細(xì)胞仔豬及試驗(yàn)豬來自中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)場及無TGE與PED流行病史，并經(jīng)血清學(xué)鑒定TGE與PED均為陰性的健康豬群。2試驗(yàn)方法2.1PEDVCV777株適應(yīng)Vero細(xì)胞、傳代、毒價(jià)測定及感染性與免疫效力試驗(yàn)見文獻(xiàn)(中國畜禽傳染病20巻(6)329-332)。2.2本發(fā)明PEDV細(xì)胞傳代毒的主動與被動免疫試驗(yàn)2.2.1傳代毒克隆前的主動免疫試驗(yàn)以2ml口服接種3-6日齡哺乳仔豬，克隆后則經(jīng)后海穴位接種1ml。2.2.2克隆后的被動免疫試驗(yàn)以2ml后海穴接種產(chǎn)前30-45天的妊娠母豬。2.3效力試驗(yàn)主動免疫仔豬于接種后8-11天口服攻擊10-5xlml/頭PED瀘毒株；被動免疫妊娠母豬所產(chǎn)3日齡仔豬口服攻擊10-6xlml/頭瀘毒株，均為19及21代強(qiáng)毒。2.4電子顯微鏡、免疫熒光檢驗(yàn)及中和試驗(yàn)方法見文獻(xiàn)(中國畜禽傳染病20巻(6)329-332)。2.5病毒克隆純化以仔豬腎原代細(xì)胞(PK)做空斑培養(yǎng)，方法見義獻(xiàn)(中國200710003047.3說明書第6/12頁畜禽傳染病20巻(6)329-332)。3、試驗(yàn)結(jié)果3.1PEDV接種毒克隆前的主動免疫試驗(yàn)繼傳代毒11、21、22代感染性試驗(yàn)及25、28、31代感染性與免疫效力試驗(yàn)(4)后，對59、68及90代進(jìn)行口服途徑的主動免疫試驗(yàn)，攻毒后分別為4/4、4/4、3/4及3/3保護(hù)，對照組3/3發(fā)病。3.2PEDV傳代毒適應(yīng)PK細(xì)胞及克隆純化試驗(yàn)傳代毒83代轉(zhuǎn)向PK細(xì)胞培養(yǎng)，上PK細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE，經(jīng)中和試驗(yàn)、免疫熒光(檢查細(xì)胞培養(yǎng)片)、免疫電鏡(包括膠體金標(biāo)記)檢驗(yàn)，均為PED抗血清呈陽性反應(yīng)，與TGE抗血清不交叉，毒價(jià)107°-1075TCID50/0.3ml，復(fù)歸仔豬攻PED強(qiáng)毒均保護(hù)，證明PED傳代毒83代之后已適應(yīng)了PK細(xì)胞。從90代起進(jìn)行克隆純化試驗(yàn)，克隆是在2次群斑(由5-7個(gè)lmm以內(nèi)單斑組成)的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行3次單斑挑選。選出2個(gè)克隆株，其中83-7-斑5株繼續(xù)傳代并進(jìn)行系列試驗(yàn)，克隆后已繼48代，總代次為147代。3.3克隆后的主動免疫試驗(yàn)克隆后的5、10、14、20及25代主動免疫試驗(yàn)的總保護(hù)率為95.92%(47/49)、發(fā)病率4.08%，對照組發(fā)病率為88.8%(16/18)，見表1。表1PED傳代毒克隆后主動免疫試驗(yàn)克降后仔豬仔豬安全性試驗(yàn)間隔時(shí)間效力試驗(yàn)對照組代次頭數(shù)日齡途徑劑量反應(yīng)強(qiáng)毒代次劑量途徑發(fā)病率保護(hù)率5146后海穴lml無11PED滬株19代lmlU服0/1414/141011后海穴lml無11PED滬株19代lmlu服0/1111/11謂1464后海穴lml無10PED瀘株19代lmlUl服1/65/6202573后海穴lml無8PED瀘株19代lmlu服0/77/7(總計(jì)124代)115后海穴lml無8PED瀘株19代lmlU服1/1110/113.4克隆后的被動免疫試驗(yàn)總做8批，克隆后17、20代各2批，25、30、35及40代各一批，總保護(hù)率96.2%(76/79)，發(fā)病率3.8%(3/79)，對照組100%(10/10)發(fā)病，見表2。試驗(yàn)?zāi)肛i的中和抗體效價(jià)接種前7頭為4倍或以下，l頭為8倍。對所產(chǎn)仔豬攻毒前6頭母豬為128倍，2頭為64倍。檢測4頭攻毒后10-17天母豬的中和抗體價(jià)均為256倍。8表2PED傳代毒克隆后被動免疫試驗(yàn)_^_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明弱毒株對于豬流行性腹瀉病毒具有良好的免疫保護(hù)率。試驗(yàn)例3本發(fā)明弱毒株的安全性試驗(yàn)1、豬流行性腹瀉弱毒的穩(wěn)定性試驗(yàn)1.1試驗(yàn)方法以克隆后25代本發(fā)明弱毒株(總代次124代)5ml口服接種2~4日齡人工哺乳仔豬，臨床觀察在6代次19頭仔豬中除第一代有2頭一過性腹瀉(營養(yǎng)性的)夕卜，其余均無反應(yīng)，觀察72小時(shí)迫殺，進(jìn)行空腸絨毛及免疫熒光檢驗(yàn)，同時(shí)制備10倍空腸組織懸液，過濾后作為次代接種材料及上PK細(xì)胞傳12代。1.2試驗(yàn)結(jié)果熒光檢査均呈陽性，再將空腸組織濾液上PK細(xì)胞12代，均出現(xiàn)典型CPE，證明克隆純化后傳代毒是穩(wěn)定的(表3)。_表3PED83-7-7斑傳代毒穩(wěn)定性試驗(yàn)_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.1試驗(yàn)渚來自中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)場及無TGE、PED流行病史，并經(jīng)血清學(xué)鑒定TGE與PED均為陰性的健康豬群。3~713齡仃豬。2.2試驗(yàn)方法病毒以克隆后的25~35代毒(總代次為124~134代)其期間的三個(gè)代次進(jìn)行病毒的大劑量安全性試驗(yàn)，接種劑量為10頭份(10"TCID5。/頭份)，每組10頭，同時(shí)設(shè)對照組2頭(接種等量的生理鹽水)，同時(shí)觀察體溫、采食、局部反應(yīng)以及是否嘔吐、腹瀉等。觀察28天。2.3試驗(yàn)結(jié)果其他試驗(yàn)豬均無反應(yīng)，通過上述的試驗(yàn)，證明大劑量的免疫接種，除了124代有一頭體溫升高外和126代有一頭母豬鍵食外，對其他仔豬和母豬均無任何影響。試驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明疫苗在妊娠母豬上應(yīng)用，不會造成母豬流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙，實(shí)驗(yàn)組與對照組無明顯差異，母豬產(chǎn)仔數(shù)均在913只，屬于正常范圍，無流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙等表現(xiàn)，證明疫苗是安全的(表4、5)。安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明弱毒株對妊娠母豬、仔豬均安全無副反應(yīng)。表4本發(fā)明豬流行性腹瀉弱毒大劑量安全性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5本發(fā)明豬流行性腹瀉弱毒母豬大劑量安全性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組觀察內(nèi)容(除產(chǎn)仔數(shù)和流產(chǎn)外，其他項(xiàng)目觀察15日)對,照鄉(xiāng)且X見察內(nèi)容(除產(chǎn)仔數(shù)和流產(chǎn)外，其他項(xiàng)目觀察15曰)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a出現(xiàn)采食減少現(xiàn)象，但是在2天后恢復(fù)。200710003047.3轉(zhuǎn)溢齒被10/125t表7實(shí)例編號催化劑CuO平均顆粒直徑，nm比表面，m2/g水滴法孔體積，ml/g<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例13~24分別將30克DSZF廣DSZF,2在800°c、100%水蒸氣氣氛條件下進(jìn)行8小時(shí)的老化處理。取不同量的經(jīng)老化處理DSZF廣DSZFj2與不同量的工業(yè)FCC平衡催化劑(商品牌號為GOR-II，齊魯石化公司催化劑廠生產(chǎn)，主要性質(zhì)見表8)進(jìn)行混合。將催化劑混合物裝入小型固定流化床反應(yīng)裝置的反應(yīng)器中，對表9所示減壓渣油與減壓蠟油的混合油(減壓渣油含量為30重量％，減壓蠟油含量為70重量％)進(jìn)行催化裂化反應(yīng)。將收集到的液體產(chǎn)物按實(shí)沸點(diǎn)蒸餾方法進(jìn)行蒸餾，分出餾程220。c以下的汽油產(chǎn)物。采用脈沖火焰光度法測定裂化汽油中的硫含量。分別將100克新鮮DSZF,DSZF,2裝入小型固定流化床反應(yīng)裝置的反應(yīng)器中，對上述各自收集到的裂化汽油分別進(jìn)行吸附脫硫反應(yīng)。表10和表11給出了所用催化劑混合物的組成、反應(yīng)條件和反應(yīng)結(jié)果。對比例1本對比例說明含硫烴油常規(guī)催化裂化時(shí)汽油產(chǎn)物中的硫含量。按實(shí)例13中的方法對同樣的原料油進(jìn)行催化裂化反應(yīng)，不同的是所用催化劑為100。/。工業(yè)FCC平衡催化劑(同實(shí)例13~24),并且不對所生成的汽油產(chǎn)物進(jìn)行吸附脫硫處理。表10給出了反應(yīng)條件和反應(yīng)結(jié)果。對比例2本對比例說明按照CN1583972A中提供的方法加工含疏原料，降低FCC汽油產(chǎn)物硫含量的效果。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>權(quán)利要求1、豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株(Porcinediarrheavirus)，其微生物保藏號是CCTCC-V200608。2、一種核苷酸序列，是SEQIDNO:2所示的堿基序列。3、按照權(quán)利要求1的弱毒疫苗株，其特征在于與PEDVCV777株ORF3的序列相比，所述的弱毒疫苗株從ORF3序列的ATG開始的第245位到293位一共缺失了49個(gè)核苷酸，該缺失的核苷酸序列為SEQIDNO:3所示。4、按照權(quán)利要求1的弱毒疫苗株，其特征在于與PEDVBrl/87株ORF3的序列相比，所述的弱毒疫苗株從ORF3序列的ATG開始的第245位到293位一共缺失了49個(gè)核苷酸，該缺失的核苷酸序列為SEQIDNO:4所示。5、一種防治豬流行性腹瀉的疫苗組合物，由權(quán)利要求l-4任何一項(xiàng)的弱毒疫苗株和藥學(xué)上可接受的佐劑組成。6、權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)的弱毒疫苗株在制備防治豬流行性腹瀉藥物中的用途。7、權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)的弱毒疫苗株在制備診斷或檢測豬流行性腹瀉病毒試劑中的用途。8、權(quán)利要求2的核苷酸序列在制備診斷或檢測豬流行性腹瀉病毒試劑中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株及其應(yīng)片。本發(fā)明弱毒疫苗株的微生物保藏號是CCTCC-V200608。本發(fā)明弱毒疫苗株安全性好，對于豬流行性腹瀉病毒具有良好的免疫保護(hù)率。本發(fā)明弱毒株可應(yīng)用于可應(yīng)用于制備成防治豬流行性腹瀉病毒的單苗或聯(lián)苗(活或滅活疫苗)等，也可制備成診斷豬流行性腹瀉病毒的診斷試劑。文檔編號A61K35/76GK101117627SQ20071000304公開日2008年2月6日申請日期2007年2月1日優(yōu)先權(quán)日2007年2月1日發(fā)明者佟有恩,力馮,孫東波,時(shí)洪艷,陳建飛申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所