專(zhuān)利名稱(chēng)：特異性結(jié)合epha2受體的抗體的制作方法
特異性結(jié)合EPHA2受體的抗體本發(fā)明涉及特異性結(jié)合EphA2受體的抗體或其表位結(jié)合片段。它進(jìn)一步涉及包含與抗體共價(jià)結(jié)合的細(xì)胞毒劑的綴合物及用于制備此類(lèi)綴合物的方法。
背景技術(shù)：
癌癥是一種以源自異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的不受控制的增殖為特征的疾病。最危險(xiǎn)的癌癥形式是惡性細(xì)胞，其具有通過(guò)經(jīng)由侵入而直接生長(zhǎng)入相鄰組織中，或者通過(guò)轉(zhuǎn)移而植入遠(yuǎn)距離部位中，從而擴(kuò)散的能力。轉(zhuǎn)移細(xì)胞已經(jīng)獲得了從原發(fā)性腫瘤脫離，經(jīng)由血流或淋巴系統(tǒng)移位到遠(yuǎn)距離部位并在遠(yuǎn)距離的且無(wú)關(guān)的微環(huán)境形成集落的能力。現(xiàn)在清楚的是，Eph分子牽涉疾病狀態(tài)諸如癌癥。Eph受體是一種在基因組中最大的獨(dú)特的受體酪氨酸激酶(RTK)家族，其由與8種膜結(jié)合肝配蛋白配體相互作用 的 14 種受體組成，分成兩組 A 和 B(Pasquale, E. B.等，2005，Nature Reviews Mol. CellBiol. ,6:462-475)。Eph受體對(duì)其配體的結(jié)合誘導(dǎo)受體聚簇，激活激酶活性，隨后對(duì)酪氨酸殘基進(jìn)行胞質(zhì)域的反式磷酸化，為許多信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)創(chuàng)建對(duì)接位點(diǎn)(docking site)(Kullander,K 和Klein, R.，2002，Nature Reviews Mol. Cell Biol.,3:475-486;Noren, N.K.和 Pasquale, E. B.，2004，Cell signal.，16:655-666)。已經(jīng)在卵巢、乳腺、前列腺、肺、結(jié)腸、食管、腎細(xì)胞、宮頸癌和黑素瘤中報(bào)告了EphA2受體的過(guò)表達(dá)。提示了 EphA2是惡性細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的正調(diào)節(jié)物(Landen，C.N.等,2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6) : 1179-1187)。還已經(jīng)描述了 EphA2 在癌癥中的作用，因?yàn)閱为?dú)的EphA2過(guò)表達(dá)足以將乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成惡性表型(Zelinski等，2001，Cancer Res.，61:2301-2306),而且提高對(duì)遠(yuǎn)距離部位的自發(fā)轉(zhuǎn)移(Landen, C.N.等,2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6) : 1179-1187)。此外，越來(lái)越多的證據(jù)提不了 EphA2 牽涉腫瘤血管生成(Ogawa 等，2000，Oncogene, 19:6043-6052; Cheng 等2002, Mol. Cancer Res. , 1:2-11;Cheng 等,2003,Neoplasia, 5(5):445-456;Dobrzanski等，2004，Cancer Res.，64:910-919)。已經(jīng)顯示了 EphA2的磷酸化與其豐度相關(guān)聯(lián)。酪氨酸磷酸化的EphA2被快速內(nèi)在化，并且注定要進(jìn)行降解，而未磷酸化的EphA2被證明翻轉(zhuǎn)(turnover)降低，并且因此在細(xì)胞表面積累。目前認(rèn)為此種模型可以促成癌癥中高頻率的EphA2過(guò)表達(dá)(Landen，C.N.等，2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6) : 1179-1187)。然而，事實(shí)可能更復(fù)雜，因?yàn)樽罱臄?shù)據(jù)似乎指示EphA2激酶依賴性和不依賴性功能在腫瘤進(jìn)展中的作用(Fang ff. B.，2005, Oncogene, 24:7859-7868)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出激動(dòng)性抗體，其促進(jìn)EphA2酪氨酸磷酸化和內(nèi)在化，最終導(dǎo)致對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制(Dodge-Zantek 等,1999, Cell Growth&Differ, 10:629-638;WO01/12172,WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/101764,WO 2006/023403, WO2006/047637, WO 2007/030642)。申請(qǐng)WO 2006/084226披露了既不提高也不降低EphA2激酶活性，但是能夠阻礙腫瘤細(xì)胞增殖的抗體。然而，其中沒(méi)有指示這些抗體阻止肝配蛋白Al結(jié)合受體，并且抑制肝配蛋白Al誘導(dǎo)的EphA2磷酸化。WO 2004/092343中已經(jīng)提出了使用拮抗性抗體，但是其中沒(méi)有披露實(shí)際的抗體。WO 2008/010101中已經(jīng)描述了作為真實(shí)的拮抗劑的識(shí)別EphA2的抗體及其人源化變體和綴合物。這些抗體及其衍生物抑制EphA2激酶依賴性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，仍需要可以在癌癥療法中使用的新的且有效的藥物。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的藥劑，其特異性結(jié)合A類(lèi)Eph受體家族成員，諸如EphA2,并且通過(guò)拮抗受體來(lái)抑制受體的細(xì)胞活性。如此,本發(fā)明包括識(shí)別EphA2受體,優(yōu)選地人的，并且發(fā)揮所述受體的拮抗劑功能的抗體或其片段。這些抗體缺乏任何激動(dòng)劑活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其表位結(jié)合片段包含至少一條重鏈和至少一條輕鏈，所述重鏈包含三個(gè)連續(xù)的具有以SEQ ID NO: 1、2、和3代表的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)，且其中所述輕鏈包含三個(gè)連續(xù)的具有以SEQ ID N0:4、5、和6代表的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體或其表位結(jié)合片段是人源化的或重修表面 的(resurfaced)。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述抗體或其表位結(jié)合片段的重鏈包含由SEQ ID NO: 12組成的氨基酸序列，且所述抗體或其表位結(jié)合片段的輕鏈包含由SEQ IDNO: 14組成的氨基酸序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的重鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 18，且所述抗體的輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 16。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體或其表位結(jié)合片段與細(xì)胞毒劑綴合。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了本發(fā)明的抗體或其表位結(jié)合片段的綴合物，其中所述綴合物包含選自下組的結(jié)合的細(xì)胞毒劑式(XIII)的化合物
權(quán)利要求
1.一種抗體或其表位結(jié)合片段，其特異性結(jié)合EphA2受體，并且包含至少一條重鏈和至少一條輕鏈，其中所述重鏈包含三個(gè)連續(xù)的具有以SEQ ID NO: 1、2、和3代表的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)，且其中所述輕鏈包含三個(gè)連續(xù)的具有以SEQ ID N0:4、5、和6代表的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)。
2.依照權(quán)利要求I的抗體或其表位結(jié)合片段，其中所述單克隆抗體或其表位結(jié)合片段是人源化的或重修表面的抗體或其表位結(jié)合片段。
3.依照權(quán)利要求I的抗體或其表位結(jié)合片段，其中所述重鏈包含由SEQID NO: 12組成的氨基酸序列，且其中所述輕鏈包含由SEQ ID NO: 14組成的氨基酸序列。
4.依照權(quán)利要求I的抗體或其表位結(jié)合片段，其中所述重鏈為(consistin)氨基酸序列SEQ ID NO: 18，且其中所述輕鏈為氨基酸序列SEQ ID NO: 16。
5.依照權(quán)利要求1-4的抗體或表位結(jié)合片段的綴合物，其中所述綴合物包含選自下組的細(xì)胞毒劑 a)式(XIII)的美登木素生物堿類(lèi)
6.依照權(quán)利要求5的綴合物，其中所述細(xì)胞毒劑與所述抗體共價(jià)結(jié)合。
7.依照權(quán)利要求5或6中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述細(xì)胞毒劑是式(XIII)的美登木素生物堿類(lèi)。
8.一種用于制備綴合物的方法，包括下列步驟 (i)使任選緩沖的細(xì)胞結(jié)合劑水溶液與細(xì)胞毒性化合物的溶液接觸； ( )然后，任選地分開(kāi)在(i)中形成的綴合物與未反應(yīng)的試劑和可能存在于溶液中的任何聚集體； 其中所述細(xì)胞結(jié)合劑是依照權(quán)利要求1-4的抗體，而細(xì)胞毒劑選自 式(XVII)的化合物
9.通過(guò)權(quán)利要求8的方法能夠獲得的綴合物。
10.依照權(quán)利要求9的綴合物，所述綴合物具有選自式(XV)和式(XVI)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)
11.權(quán)利要求10的抗體-藥物綴合物，其中η是4至7。
12.權(quán)利要求11的抗體-藥物綴合物，其具有式(XV)的結(jié)構(gòu)。
13.一種藥物組合物，其含有依照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的抗體或其表位結(jié)合片段，或依照權(quán)利要求6、7和8中任一項(xiàng)的綴合物，和藥學(xué)可接受載體或賦形劑。
14.依照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的抗體或其表位結(jié)合片段，或依照權(quán)利要求5、6和7中任一項(xiàng)的綴合物，其作為藥物使用。
15.依照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的抗體或其表位結(jié)合片段，或依照權(quán)利要求5、6和7中任一項(xiàng)的綴合物用于制備用于治療癌癥的藥物的用途。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述癌癥選自癌，包括膀胱、乳腺、結(jié)腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宮頸、甲狀腺和皮膚癌；包括鱗狀細(xì)胞癌；淋巴樣譜系的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤；髓樣譜系的造血腫瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓細(xì)胞性白血病；間質(zhì)起源的腫瘤,包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其它腫瘤,包括黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸胎癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤；中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、和神經(jīng)鞘瘤；間質(zhì)起源的腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、和骨肉瘤；和其它腫瘤，包括黑素瘤、著色性干皮病、角化棘皮瘤、精原細(xì)胞瘤、甲狀腺濾泡性癌和畸胎癌。
17.依照權(quán)利要求1-4的抗體或其表位結(jié)合片段，其中所述單克隆抗體或其表位結(jié)合片段的互補(bǔ)位在輕鏈中包含環(huán)LI的Arg35、L2的Tyr54、Arg58和Asp60。
18.依照權(quán)利要求1-4的抗體或其表位結(jié)合片段，其中所述單克隆抗體或其表位結(jié)合片段的互補(bǔ)位在重鏈中包含環(huán)Hl的Thr30、Ala31、Tyr32和Tyr33、H2的Asn52、Tyr54、Asn55 和 Phe57 和 H3 的 Glu99、PhelOO、TyrlOl、Glyl02、Tyrl03 和 Tyrl05。
19.依照權(quán)利要求1-4的抗體或其表位結(jié)合片段，其中所述單克隆抗體或其表位結(jié)合片段包含位置Thr H28處的突變。
20.依照權(quán)利要求1-4的抗體或其表位結(jié)合片段，其中所述單克隆抗體或其表位結(jié)合片段包含所述輕鏈上的下列少數(shù)位置之一處的突變35、26至31、34至37、55、56、57、59和94 至 102。
21.依照權(quán)利要求1-4的抗體或其表位結(jié)合片段，其中所述單克隆抗體或其表位結(jié)合片段包含所述重鏈上的下列少數(shù)位置之一處的突變28、54和57。
22.依照權(quán)利要求1-4的抗體或其表位結(jié)合片段，其特異性結(jié)合人EphA2受體的表位，該人EphA2受體的表位包含來(lái)自EphA2受體胞外域的LBD的殘基Gly49、Lys50、Gly51、Asp53、Cys70、Asn71、Val72、Met73、Ser74、Gly75、Gln77、Phel08、Prol09、Glyll0、Glylll、Ser 113和Serl 14，或其保守取代形式。
23.依照權(quán)利要求6、7和8中任一項(xiàng)的綴合物，其具有高于4的平均DAR，所述DAR用UV分光光度計(jì)測(cè)量，并通過(guò)以下等式DAR=Cd/Ca確定 其中 Cd- [ ( ε Α280Χ Α252) - ( ε Α252χ A280) ] / [ ( ε D252X ￡ Α28θ) - ( ￡ Α252Χ ￡ D28o)] Ca- [Α280-(Cd X ε D280) ] / ε Α280 ε D252=26, 159M-1cm-1 ε D280=5, 180M-1cm-1ε Α280=224, OOOM_1cm_1 ε Α252=82, 880M_1cm_1 A252和A28tl是分別于252和280nm在UV分光光度計(jì)上測(cè)量的綴合物的吸光度。
24.依照權(quán)利要求23的綴合物，其具有4至10或5至8的平均DAR。
25.依照權(quán)利要求23的綴合物，其具有5.9至7. 5的平均DAR。
26.—種制品,其包含 a)包裝材料， b)依照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的抗體或其表位結(jié)合片段，或依照權(quán)利要求6至8和23至25中任一項(xiàng)的綴合物，和 c)所述包裝材料內(nèi)含有的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)，其指示所述抗體或其表位結(jié)合片段對(duì)于治療癌癥是有效的。
全文摘要
本公開(kāi)內(nèi)容涉及特異性結(jié)合EPHA2受體的抗體或其表位結(jié)合片段。它進(jìn)一步涉及包含與抗體共價(jià)結(jié)合的細(xì)胞毒劑的綴合物及用于制備此類(lèi)綴合物的方法。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102791737SQ201080054996
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月2日
發(fā)明者A.康默康, C.弗洛蒙德, D.塔瓦雷斯, F.帕克, H.布沙爾, I.沙遜, V.米科爾 申請(qǐng)人:賽諾菲