基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及電化學免疫【技術領域】，是一種基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法。包括以下步驟：以一種具有類過氧化氫酶催化活性的普魯士藍微粒子標記待測物的類似物作為標記抗原；將磁性四氧化三鐵微粒固定抗體，并將其分散在反應液中；形成競爭性免疫反應、電化學檢測體系中的氧化電流信號進而對待測物實現(xiàn)定量測量。該檢測方法采用普魯士藍代替生物酶分子標記小分子抗原，并結合磁性微粒進行競爭性免疫反應，通過電化學檢測標記抗原對于過氧化氫和對苯二酚的催化氧化反應產(chǎn)生的電信號，由于其電信號大小與待測小分子濃度呈線性相關，可實現(xiàn)對小分子化合物的高靈敏度定量檢測。
【專利說明】基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及電化學免疫【技術領域】，是一種基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法。
【背景技術】
[0002]在目前的生物醫(yī)藥檢測領域，對于環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的高靈敏度定量免疫檢測已成為廣大研究人員關注的焦點問題之一。為了實現(xiàn)微量或痕量的小分子化合物的高靈敏度檢測，各種基于生物特異性反應，如抗原抗體技術、蛋白配體技術等不同的方法和體系已經(jīng)被建立。其中，具有典型性的是競爭性免疫檢測技術，其利用標記抗原和待測分析物對抗體的競爭，通過檢測被抗體吸附的標記抗原可以推斷出體系中含有的待測分析物的濃度。但常用的標記技術有放射性標記、辣根過氧化物酶(HRP)等酶標記，以及熒光化學探針等光學標記。
[0003]電化學免疫分析技術是將免疫分析技術與電化學技術結合的一種免疫分析方法，通過將一些易于測定并具有高度敏感性的物質(zhì)標記到抗原或抗體分子上，并結合抗原與抗體間的特異性結合反應，通過檢測標記物的產(chǎn)生或放大的電信號，可以實現(xiàn)對于待測物質(zhì)的高靈敏度特異性檢測。電化學免疫標記的物質(zhì)一般是生物酶類，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶等，但這些酶類對于溫度、溶劑等外界條件要求嚴格，難以制備且價格昂貴。
[0004]普魯士藍微粒具有類似過氧化物酶的催化能力，可以催化過氧化氫的分解，通過電化學工作站檢測其分解的過氧化氫對還原性物質(zhì)對苯二酚氧化產(chǎn)生的電流。通過靜電作用，可以將普魯士藍標記在帶氨基的殼聚糖等分子的表面，再通過化學偶聯(lián)方法將待測小分子與帶普魯士藍標記的殼聚糖分子偶聯(lián)，可以制得普魯士藍標記的小分子標記抗原。
[0005]磁性納米粒子具有比表面積大、易富集等特點，經(jīng)修飾后可以在其表面標記抗體，制得磁性抗體。通過分散在反應體系中和外加磁場的作用，可以快速富集分離與抗體特異性識別的小分子化合物。因此，建立基于仿生材料標記結合磁性微粒競爭性免疫反應及電化學技術的小分子化合物檢測體系，對于環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的高靈敏度定量免疫檢測具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供了 一種基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法檢測方法，以實現(xiàn)對于環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的高靈敏度定量免疫檢測的目的。
[0007]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案:基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008]a)以一種具有類過氧化氫酶催化活性的普魯士藍微粒子標記待測物的類似物作為標記抗原；[0009]b)將磁性四氧化三鐵微粒固定抗體，并將其分散在反應液中；
[0010]C)在反應液中加入步驟a中制得的標記抗原和待測物后，標記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應；
[0011]d)通過磁鐵分離，將磁性抗體及其吸附的抗原分離至試管底部，吸取上清，在其中加入含有對苯二酚和過氧化氫的溶液，通過差分脈沖伏安法，電化學檢測體系中的氧化電流信號進而對待測物實現(xiàn)定量測量。
[0012]可選的，所述小分子化合物是指分子量在1000以下，且不能直接產(chǎn)生免疫原性的有機化合物分子。
[0013]可選的，所述四氧化三鐵微粒和普魯士藍微粒子的尺寸是μ m級或nm級的。
[0014]可選的，所述具有類過氧化氫酶催化活性的材料為普魯士藍。
[0015]可選的，所述的待測物是有機小分子化合物。
[0016]可選的，在所述電化學檢的步驟中，電化學電極為玻碳電極及其經(jīng)修飾后的電極。
[0017]可選的，所述普魯士藍微粒子通過化學方法固定待測物小分子的類似物，形成標記抗原。
[0018]可選的，所述競爭性免疫反應在磷酸緩沖液中發(fā)生。
[0019]可選的，所述競爭性免疫反應通過借助磁性微粒以及外加磁場的作用形成。
[0020]可選的，在步驟d)中，所述電化學檢測體系中的氧化電流信號進而對待測物實現(xiàn)定量測量，具體包括:
[0021]通過檢測上清中殘留的標記抗原對于含有過氧化氫和對苯二酚的溶液的催化氧化反應產(chǎn)生的電信號，實現(xiàn)對于待測小分子的定量電化學檢測。
[0022]該檢測方法采用普魯士藍代替生物酶分子標記小分子抗原，并結合磁性微粒進行競爭性免疫反應，通過電化學檢測標記抗原對于過氧化氫和對苯二酚的催化氧化反應產(chǎn)生的電信號，由于其電信號大小與待測小分子濃度呈線性相關，可實現(xiàn)對小分子化合物的高靈敏度定量檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明實施例的方法中，普魯士藍催化免疫電化學差分脈沖伏安圖；
[0024]圖2利用本發(fā)明實施例的方法所測的濃度與電流的線性關系圖；
[0025]圖3利用本發(fā)明實施例的方法所測的濃度的對數(shù)與電流的線性關系圖。
【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明提出了一種利用普魯士藍催化活性作為抗原標記的競爭免疫反應電化學檢測方法。本方法首先借助帶多個氨基的殼聚糖，將普魯士藍粒子標記于待測小分子化合物的類似物上構成標記抗原。通過將抗體與磁性納米粒子偶聯(lián)，借助標記抗原與待測目標物對磁性抗體的競爭以及外加磁場對于磁性抗體結合目標物和標記抗原后的分離，構建了競爭免疫反應體系。然后通過電化學檢測上清液中剩余的標記抗原對過氧化氫的催化分解及其對對苯二酚的氧化電流，建立了小分子化合物高靈敏度的檢測體系。
[0027]另外，需要指出的是，在本發(fā)明的所有實施例中，優(yōu)選的，可以具備以下一個或者多個限定條件；可選的，所述小分子化合物是指分子量在1000以下，且不能直接產(chǎn)生免疫原性的有機化合物分子?？蛇x的，所述四氧化三鐵微粒和普魯士藍微粒子的尺寸是μπι級或nm級的。可選的，所述具有類過氧化氫酶催化活性的材料為普魯士藍?？蛇x的，所述的待測物是有機小分子化合物?？蛇x的，在所述電化學檢的步驟中，電化學電極為玻碳電極及其經(jīng)修飾后的電極?？蛇x的，所述普魯士藍微粒子通過化學方法固定待測物小分子的類似物，形成標記抗原?？蛇x的，所述競爭性免疫反應在磷酸緩沖液中發(fā)生?？蛇x的，所述競爭性免疫反應通過借助磁性微粒以及外加磁場的作用形成?？蛇x的，在步驟d)中，所述電化學檢測體系中的氧化電流信號進而對待測物實現(xiàn)定量測量，具體包括:通過檢測上清中殘留的標記抗原對于含有過氧化氫和對苯二酚的溶液的催化氧化反應產(chǎn)生的電信號，實現(xiàn)對于待測小分子的定量電化學檢測。
[0028]實施例一
[0029]本實施例提供的檢測方法包括以下步驟:
[0030]1、普魯士藍標記分子抗原的制備:
[0031]將帶有氨基或羧基等活性基團的小分子化合物通過酰胺化反應(EDC/NHS反應)、重氮化法、戊二醛法等偶聯(lián)到殼聚糖分子上，通過調(diào)節(jié)PH值，使標記了小分子化合物的殼聚糖帶正電，然后在其分散液中加入硫酸亞鐵和鐵氰化鉀，其表面合成帶負電的普魯士藍，通過靜電作用實現(xiàn)普魯士藍對小分子抗原的標記。
[0032]2、磁性抗體的制備:
[0033]將氯化亞鐵和三氯化鐵比例1: 2，分別加入水中溶解加熱至70°C，加入氯化亞鐵摩爾數(shù)8倍的氫氧化鈉溶液，迅速混合，可見生成棕黑色的磁性納米粒子，然后緩慢滴加與氯化亞鐵等摩爾數(shù)的油酸，熟化20min后加入高錳酸鉀溶液，氧化24h，使磁性納米粒子表面的油酸被氧化成羧基，用超純水洗滌數(shù)次，獲得帶有羧基的磁性納米粒子。將帶羧基的磁性納米粒子分散在磷酸鹽緩沖液中，并加入一定量的抗體，通過酰胺化反應(EDC/NHS反應)與抗體偶聯(lián)2h。之后，與1%的脫脂乳粉在37°C下孵育lh，封閉掉未反應的羧基，洗滌一次，即獲得磁性抗體。
[0034]3、電化學檢測方法:
[0035]該方法為基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，具體包括以下步驟:
[0036]步驟1:以一種具有類過氧化氫酶催化活性的普魯士藍微粒子標記待測物的類似物作為標記抗原:
[0037]具體的，稱取一定量修飾有氨基的半抗原溶于含有甲醇的ddH20構成I液；稱取一定量脫乙酰度為90%的殼聚糖溶于PH值6.5的磷酸鹽緩沖液中，構成II液；量取100 μ 125%的戊二醛，加蒸餾水稀釋至5ml，構成III液。在室溫攪拌下，將I液和III液逐滴加入II液中攪拌，8h后裝入透析袋，用蒸餾水透析3d，每天更換2到3次透析液至透析完全，即獲得偶聯(lián)殼聚糖的抗原(Ag-CS)。在其中加入lmllmol/1氯化亞鐵和2%。的鹽酸，再加入lmol/1鐵氰化鉀即可見藍色的普魯士藍粒子的形成，冷凍干燥，即可獲得標記了普魯士藍的殼聚糖待測物分子標記抗原(PB/CS/Ag)。
[0038]步驟2:合成帶羧基的磁性納米粒子，將磁性四氧化三鐵微粒固定抗體，并將其分散在反應液中:將8.1g FeCl3.6H20在142.5mL去離子水中溶解后，轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中，攪拌加熱至70°C。稱取4.4gFeCl2.4Η20溶于IOmL去離子水，過濾，取7.5mL加入到三口燒瓶中。在劇烈攪拌下，快速加入24mL20%的NaOH溶液，Imin后逐滴加入4.66g油酸，于70°C下繼續(xù)快速攪拌20min。反應結束后，得到黑色溶膠狀物質(zhì)，利用外加磁場將所得的沉淀從反應體系中分離出來。
[0039]用乙醇洗滌2次除去多余的油酸，再用去離子水洗滌至pH = 7。然后加入160mL濃度為10mg/mL的KMnO4溶液，在超聲波清洗儀中超聲振蕩24h，磁分離后用去離子水洗滌3次，得到磁流體?；蛘咴谙礈旌笳婵绽鋬龈稍?0h，得到表面修飾有羧基的磁性納米粒子。將25mg帶羧基的磁性納米粒子分散在ImL PH = 6.5的PBS磷酸鹽緩沖液中，在其中分別加入25mgEDC和NHS，在37°C中活化30min，并加入一定量的抗體，通過酰胺化反應(EDC/NHS反應)與抗體偶聯(lián)2h。之后，與1%的脫脂乳粉在37°C下孵育lh，封閉掉未反應的羧基，洗滌一次，即獲得磁性抗體。
[0040]步驟3:在反應液中加入步驟I中制得的標記抗原和待測物后,標記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應:將100 μ L含有25mg磁性四氧化三鐵微粒固定抗體分散在5mL反應液中，在反應液中加入100 μ L步驟a中制得的標記抗原和一組不同濃度待測物(磺胺二甲基嘧啶)后，在37°C下孵育lh，標記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應。
[0041]步驟4:通過磁鐵分離，將磁性抗體及其吸附的抗原分離至試管底部，吸取4mL上清，加入ImL含有77mg對苯二酚和11 μ L30%過氧化氫的溶液中，以玻碳電極為工作電極，鉬片電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極通，在-0.6?2.0V間，通過差分脈沖伏安法(DPV法)電化學檢測體系中的氧化電流信號進而對待測物實現(xiàn)定量測量(請參考圖1)。結果發(fā)現(xiàn)在20ng/mL?10μ g/mL之間，電流信號大小與待測目標物濃度呈現(xiàn)良好的線性關系O
[0042]本發(fā)明方法在實施過程中使用的試劑包括以下幾種成分:
[0043]抗體和抗原分子:抗體一般是指可特異識別環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的抗體。殼聚糖，脫乙酰度70%?90%的殼聚糖含有大量氨基，磁性納米粒子(表面帶有羧基)，普魯士藍粒子，玻碳電極，鉬片電極，飽和甘汞電極，普魯士藍，待測物抗原分子及其類似物，過氧化氫，對苯二酚，亞硝酸鈉，戊二醛，高錳酸鉀，六水合氯化鐵，四水合氯化亞鐵。
[0044]使用的裝置包括:水浴鍋、電化學工作站、超純水制水機。
[0045]以玻碳電極為工作電極，鉬片電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用差分脈沖伏安法，電化學檢測體系中的氧化電流信號進而對待測物實現(xiàn)定量測量。
[0046]具體的，以普魯士藍為標記催化材料，以四氧化三鐵納米粒子為磁性微粒，以磺胺類抗體為檢測抗體，磺胺二甲基嘧啶為待測分析物，磺胺對二甲氧基嘧啶為待測分析物的類似物為例，說明本方法的具體實施流程。
[0047]1、普魯士藍標記的待測分析物、類似物作為標記抗原的合成方法:
[0048]稱取28mg磺胺對二甲氧基嘧啶溶于含有50 μ I甲醇的Iml ddH20構成I液；稱取20mg脫乙酰度為90%的殼聚糖溶于0.35ml PH值6.5的磷酸鹽緩沖液中，構成II液；量取100 μ 125%的戊二醛，加蒸餾水稀釋至5ml，構成III液。在室溫攪拌下，將I液和III液逐滴加入II液中攪拌，8h后裝入透析袋，用蒸餾水透析3d，每天更換2到3次透析液至透析完全，即獲得偶聯(lián)殼聚糖的磺胺二甲基嘧啶(SD-CS)。在其中加入lmllmol/1氯化亞鐵和2%。的鹽酸，再加入lmol/1鐵氰化鉀即可見藍色的普魯士藍粒子的形成，冷凍干燥，即可獲得標記了普魯士藍的殼聚糖待測物分子標記抗原(PB/CS/SD)。
[0049]2、四氧化三鐵磁性抗體的合成:
[0050]將8.1g FeCl3.6H20在142.5mL去離子水中溶解后，轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中，攪拌加熱至70°C。稱取4.4gFeCl2*4H20溶于IOmL去離子水，過濾，取7.5mL加入到三口燒瓶中。在劇烈攪拌下，快速加入24mL20%的NaOH溶液，Imin后逐滴加入4.66g油酸，于70°C下繼續(xù)快速攪拌20min。反應結束后，得到黑色溶膠狀物質(zhì)，利用外加磁場將所得的沉淀從反應體系中分離出來。用乙醇洗滌2次除去多余的油酸，再用去離子水洗滌至pH = 7。然后加入160mL濃度為10mg/mL的KMnO4溶液，在超聲波清洗儀中超聲振蕩24h，磁分離后用去離子水洗滌3次，得到磁流體?；蛘咴谙礈旌笳婵绽鋬龈稍?0h，得到表面修飾有羧基的磁性納米粒子。將25mg帶羧基的磁性納米粒子分散在ImL PH = 6.5的PBS磷酸鹽緩沖液中，在其中分別加入25mgEDC和NHS，在37°C中活化30min，并加入一定量的抗體，通過酰胺化反應(EDC/NHS反應)與抗體偶聯(lián)2h。之后，與1%的脫脂乳粉在37°C下孵育lh，封閉掉未反應的羧基，洗滌一次，即獲得磁性抗體。
[0051]3、競爭免 疫反應的進行和電化學檢測:
[0052]將100 μ L含有25mg磁性四氧化三鐵微粒固定抗體分散在5mL反應液中，在反應液中加入100 μ L的標記抗原和一組不同濃度待測物(磺胺二甲基嘧啶)后，在37°C下孵育lh，標記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應。通過磁鐵分離，將磁性抗體及其吸附的抗原分離至試管底部，吸取4mL上清，加入ImL含有77mg對苯二酚和11μL30%過氧化氫的溶液中.以玻碳電極為工作電極，鉬片電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，在-0.6~2.0V間，通過差分脈沖伏安法(DPV法)電化學檢測體系中的氧化電流信號進而對待測物實現(xiàn)定量測量(請參考圖2和圖3，其中，在圖2中，橫坐標為電流，縱坐標為濃度；在圖3中，橫坐標為電流，縱坐標的濃度的對數(shù))。結果發(fā)現(xiàn)在20ng/mL~10yg/mL之間，電流信號大小與待測目標物濃度呈現(xiàn)良好的線性關系。
[0053]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1.基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)以一種具有類過氧化氫酶催化活性的普魯士藍微粒子標記待測物的類似物作為標記抗原； b)將磁性四氧化三鐵微粒固定抗體，并將其分散在反應液中； c)在反應液中加入步驟a中制得的標記抗原和待測物后，標記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應； d)通過磁鐵分離，將磁性抗體及其吸附的抗原分離至試管底部，吸取上清，在其中加入含有對苯二酚和過氧化氫的溶液，通過差分脈沖伏安法，電化學檢測體系中的氧化電流信號進而對待測物實現(xiàn)定量測量。
2.如權利要求1所述的基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于: 所述小分子化合物是指分子量在1000以下，且不能直接產(chǎn)生免疫原性的有機化合物分子。
3.如權利要求1所述的基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于: 所述四氧化三鐵微粒和普魯士藍微粒子的尺寸是μ m級或nm級的。
4.如權利要求1所述的基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述具有類過氧化氫酶催化活性的材料為普魯士藍。
5.如權利要求1所述的基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述的待測物是有機小分子化合物。
6.如權利要求1所述的基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:在所述電化學檢的步驟中，電化學電極為玻碳電極及其經(jīng)修飾后的電極。
7.如權利要求1所述的基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述普魯士藍微粒子通過化學方法固定待測物小分子的類似物，形成標記抗原。
8.如權利要求1所述的基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述競爭性免疫反應在磷酸緩沖液中發(fā)生。
9.如權利要求1所述的基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述競爭性免疫反應通過借助磁性微粒以及外加磁場的作用形成。
10.如權利要求1所述的基于普魯士藍仿生標記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:在步驟d)中，所述電化學檢測體系中的氧化電流信號進而對待測物實現(xiàn)定量測量，具體包括: 通過檢測上清中殘留的標記抗原對于含有過氧化氫和對苯二酚的溶液的催化氧化反應產(chǎn)生的電信號，實現(xiàn)對于待測小分子的定量電化學檢測。
【文檔編號】G01N33/53GK103995103SQ201410258017
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權日:2014年6月11日
【發(fā)明者】王靜, 王淼, 佘永新, 李騰飛, 劉廣洋, 杜欣蔚, 于海龍, 金芬, 邵華, 金茂俊, 王珊珊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所