一種百合隱癥病毒、斑駁病毒和黃瓜花葉病毒雙向膠體金免疫層析速測卡及制備方法
【專利摘要】一種百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡及制備方法，采用雙向免疫層析技術(shù)，該速測卡可一次性同時快速檢測LSV、LMoV和CMV，無需任何儀器和設(shè)備，較LSV和LMoV單一或LSV+LMoV復(fù)合膠體金免疫層析試劑卡，本發(fā)明速測卡檢測效率更高，檢測成本進(jìn)一步降低，一次性檢測病毒種類更齊全；此外，其操作簡便，攜帶方便，檢測快速、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，相對于PCR方法，假陽性率低于1％?？梢姳景l(fā)明特別適用于在田間推廣應(yīng)用，并且可靠性很高。
【專利說明】一種百合隱癥病毒、斑駁病毒和黃瓜花葉病毒雙向膠體金免疫層析速測卡及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種能實現(xiàn)百合三種常見病毒快速檢測的速測卡及制備方法，具體指運用膠體金免疫層析法，研制出同時能快速檢測百合隱癥病毒(LSV)、百合斑駁病毒(LMoV)和百合黃瓜花葉病毒(CMV)的雙向復(fù)合速測卡及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本植物,是一種集觀賞、食用、藥用價值于一身的重要經(jīng)濟(jì)作物。在中國，食用和藥用百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展較好。食用百合屬于稀有特種蔬菜，是具有清熱潤肺、增強(qiáng)免疫力等保健功能的綠色食品，市場需求量很大，尤其是蘭州百合以含糖量高，粗纖維少，肉質(zhì)細(xì)膩，營養(yǎng)豐富而享有很高的聲譽(yù)。目前，蘭州市及周邊等地蘭州百合的種植面積近10萬畝，產(chǎn)值11.6億元，直接參與百合種植的農(nóng)戶已超過9萬戶，百合種植已成為產(chǎn)區(qū)農(nóng)戶的主要收入來源。對于切花百合，我國上世紀(jì)80年代末就開始了切花生產(chǎn)，但自繁百合種球普遍存在緊實度不夠、病毒病等病害嚴(yán)重、切花品質(zhì)差等問題，種球質(zhì)量難以達(dá)到國外同類產(chǎn)品的水平。由于缺乏自繁種球的技術(shù)和能力，國內(nèi)百合切花生產(chǎn)中90%以上的種球依賴進(jìn)口，每年進(jìn)口百合種球1.5億個，耗資巨大。
[0003]近年來，隨著國內(nèi)百合種植面積的擴(kuò)大，無性繁殖使病毒廣泛傳播并積累，其中，由三種主要病毒(百合斑駁病毒-Lily mottle virus, LMoV、百合黃瓜花葉病毒-Cucumbermosaic virus, CMV、百合隱癥病毒-Lily symptomless virus, LSV)引起的病毒病在百合產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，自然發(fā)病率一般在20%?30%，有的70%以上，嚴(yán)重者可高達(dá)100%，且病毒大多是以兩種或三種病毒復(fù)合侵染的形式存在。LMoV侵染的百合癥狀主要表現(xiàn)為百合葉片有斑駁條紋甚至壞死斑，后期發(fā)展為花、葉片卷曲畸形，開碎色花，并常伴隨植株矮小、花與球莖的減產(chǎn)等；CMV侵染的百合植株通常矮化，嚴(yán)重時葉片出現(xiàn)反卷、枯萎，莖畸形，鱗片短，不能開花；而LSV侵染的百合植株沒有明顯癥狀，但鱗莖縮小，切花壽命減短，LSV與CMV或LMoV復(fù)合侵染時，將導(dǎo)致百合出現(xiàn)壞死斑，田間部分敏感植株易產(chǎn)生條紋，發(fā)病嚴(yán)重時整株枯死。病毒病可使食用百合的產(chǎn)量由每畝3000斤降至1200斤，甚至更少。2012年7月，蘭州百合產(chǎn)區(qū)發(fā)生了嚴(yán)重的病毒病等病害，導(dǎo)致百合大面積枯死，給農(nóng)戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病毒病已造成百合種源嚴(yán)重退化，已是制約百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。如何對百合病毒實現(xiàn)快速檢測，成為百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需要。
[0004]目前，百合病毒檢測的主要技術(shù)和方法有電子顯微鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和核酸檢測法(PCR)等，但這些技術(shù)和方法普遍存在檢測程序復(fù)雜、耗時^_7h/樣)、分析費用高、對儀器和實驗人員的技術(shù)水平要求高等問題，很難在生產(chǎn)中得到普遍推廣應(yīng)用。膠體金免疫層析技術(shù)(Immune colloidal gold technique, GI CA)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，該方法避免了以上幾種檢測方法的缺點，以其簡便(無需儀器)、快捷(5-10min)、成本低、對技術(shù)人員要求低、適合田間快速檢測等優(yōu)點已被廣泛接受，已在人類傳染病、動物病毒和環(huán)境檢測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
[0005]我們經(jīng)過前期的反復(fù)研究和試驗，首次將膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用于百合病毒的快速檢測，已經(jīng)成功研制了能快速檢測LMoV和LSV的單一和復(fù)合膠體金免疫層析檢測試劑卡，并已在百合產(chǎn)區(qū)推廣應(yīng)用，非常受百合生產(chǎn)的企業(yè)、種植戶以及地方相關(guān)單位的歡迎。但由于技術(shù)的局限性，LMoV和LSV單一及復(fù)合膠體金免疫層析檢測試劑卡無法對CMV同時進(jìn)行檢測。然而，CMV感染百合非常普遍，對百合生長的抑制也非常嚴(yán)重，而且普遍與LMoV和LSV復(fù)合侵染，導(dǎo)致比單一侵染更加嚴(yán)重的癥狀。以目前的技術(shù)，要想完成對百合三種主要病毒的檢測，必須將LMoV和LSV復(fù)合膠體金免疫層析試劑卡檢測與能檢測CMV的酶聯(lián)免疫(ELISA)或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等傳統(tǒng)方法結(jié)合，這樣一來，百合三種主要病毒同時檢測的愿景將依舊停留在實驗室階段，無法進(jìn)入田間，百合病毒檢測工作還是不能得到真正意義上的推廣與普及，百合病毒病仍然不能得到有效防治。
[0006]為徹底實現(xiàn)百合三種主要病毒的快速檢測，我們通過實驗研究，并對LMoV和LSV的單一和復(fù)合膠體金免疫層析檢測試劑卡技術(shù)進(jìn)行不斷優(yōu)化和改進(jìn)，證明可采用雙向免疫層析技術(shù)，通過一系列優(yōu)化組合實驗，研制能一次性同時檢測LSV、LMoV和CMV的雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡，徹底解決LMoV和LSV的單一和復(fù)合膠體金免疫層析檢測試劑卡技術(shù)所存在的單一性、局限性以及傳統(tǒng)的百合病毒檢測方法成本高、耗時長、對儀器設(shè)備和專業(yè)技能要求高等問題的束縛，讓田間種植人員即可掌握病毒快速檢測技術(shù)，在健康種源的選擇以及百合種植和生長的全過程內(nèi)隨時檢測病毒，為病毒病的動態(tài)監(jiān)測和防治提供數(shù)據(jù)支持。該LSV、LMoV和CMV的雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡的開發(fā)，將為加快百合產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展、提高百合產(chǎn)區(qū)農(nóng)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，增加農(nóng)民收入，促進(jìn)脫貧致富做出貢獻(xiàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是運用膠體金免疫層析法研制一種快速檢測LSV、LMoV和CMV三種常見百合病毒的雙向復(fù)合速測卡及其制備方法。本發(fā)明速測卡可一次性同時快速檢測LSV、LMoV和CMV，無需任何儀器和設(shè)備，較LMoV和LSV單一及LMoV+LSV復(fù)合膠體金免疫層析試劑卡,本發(fā)明速測卡檢測效率更高,檢測成本進(jìn)一步降低,一次性檢測病毒種類更齊全；此夕卜，其操作簡便，攜帶方便，檢測快速、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，相對于PCR方法，假陽性率低于I %。可見本發(fā)明特別適用于在田間推廣應(yīng)用，并且可靠性很高。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0009]一種百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡，包括:試劑卡槽1，襯板16，樣品墊10，復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB11，硝酸纖維素膜AB12，單一膠體金結(jié)合墊C13，硝酸纖維素膜C14，吸水濾紙15，其特征在于:試劑卡槽I包括上殼體和下殼體，上殼體和下殼體通過卡扣連接，上殼體設(shè)有第一孔洞2、第二孔洞3和第三孔洞4，樣品墊10置于第一孔洞2下方，硝酸纖維素膜AB12置于第二孔洞3下方，硝酸纖維素膜C14置于第三孔洞4下方，復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll上含有復(fù)合金標(biāo)探針，單一膠體金結(jié)合墊C13上含有單一金標(biāo)探針，襯板16固定于試劑卡槽I中，樣品墊10、復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABl1、硝酸纖維素膜AB12和吸水濾紙15依次排列連接于襯板16右側(cè)上表面，單一膠體金結(jié)合墊C13、硝酸纖維素膜C14和吸水濾紙15依次排列連接于樣品墊10左側(cè)襯板16的上表面，硝酸纖維素膜AB12上設(shè)有第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7，硝酸纖維素膜C14上設(shè)有第三檢測線8和第二對照線9，第一檢測線5上包被的是兔抗LSV多克隆抗體，第二檢測線6上包被的是兔抗LMoV多克隆抗體，第一對照線7上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，第三檢測線8上包被的是兔抗CMV多克隆抗體，第二對照線9上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗體合適包被量分別為2.0?2.5 μ g、1.5?
2.0 μ g以及2.0?2.5 μ g蛋白，LSV和LMoV復(fù)合金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量均為18 μ g/mL，CMV單一金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量為19 μ g/mL,羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2.5?
3.0 μ g蛋白。
[0010]其中在用所述速測卡檢測時，在所述第一孔洞2處加入少量百合樣品的待檢溶液，對比第一檢測線5、第二檢測線6、第三檢測線8和第一對照線7、第二對照線9的顏色，即可判定被檢測百合是否感染了百合癮癥病毒、百合斑駁病毒或百合黃瓜花葉病毒。
[0011]其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞2處5?10分鐘后，若待檢溶液中僅含有LSV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LSV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線5結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二檢測線6時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，則不能與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)诙z測線6和第三檢測線8沒有顏色變化而第一檢測線5和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒。
[0012]其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞2處5?10分鐘后，若待檢溶液中僅含有LMoV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第二檢測線6時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第二檢測線6結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，則不能與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5和第三檢測線8沒有顏色變化而第二檢測線6和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合斑駁病毒。
[0013]其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞2處5?10分鐘后，若待檢溶液中僅含有百合CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，則不能與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5、第二檢測線6時不發(fā)生反應(yīng)，復(fù)合金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線8和第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線8結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5和第二檢測線6沒有顏色變化而第三檢測線8和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合黃瓜花葉病毒。
[0014]其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞2處5?10分鐘后，若待檢溶液中同時含有LSV和LMoV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LSV和LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5和第二檢測線6時分別發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線5和第二檢測線6結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，則不能與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谌龣z測線8沒有顏色變化而第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒和百合斑駁病毒。
[0015]其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞2處5?10分鐘后，若待檢溶液中同時含有LSV和CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LSV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線5結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二檢測線6時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線8和第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線8結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)诙z測線6沒有顏色變化而第一檢測線5、第三檢測線8和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒和百合黃瓜花葉病毒。
[0016]其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞2處5?10分鐘后，若待檢溶液中同時含有LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第二檢測線6時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第二檢測線6結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線8和第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線8結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5沒有顏色變化而第二檢測線6、第三檢測線8和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒。
[0017]其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞2處5?10分鐘后，若待檢溶液中同時含有LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LSV和LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5、第二檢測線6時分別發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線5、第二檢測線6結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線8和第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線8結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5、第二檢測線6、第三檢測線8和第一對照線7、第二對照線9同時出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒。
[0018]其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞2處5?10分鐘后，若待檢溶液中不含LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，則不能與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5和第二檢測線6時不發(fā)生反應(yīng)，復(fù)合金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，則不能與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5、第二檢測線6、第三檢測線8沒有顏色變化而第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品沒有感染百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒。
[0019]一種百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:(I)兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗體的制備:分別從感染了 LSV、LMoV和CMV的百合葉片中提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，擴(kuò)增LSV、LMoV和CMV的CP基因片段。通過酶切克隆至pET_28a載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，37°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和層析純化分別獲得大小為32.0,30.0、24kDa的LSV CP、LMoV CP和CMV CP基因工程融合蛋白。分別用lmg/mL的LSV CP、LMoVCP和CMV CP基因工程融合蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔，獲得抗血清。所得抗血清依次通過20%、50%、33%三個飽和度的硫酸銨沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸緩沖液，然后使用DE52陰離子交換柱進(jìn)行純化分別獲得兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗體IgG ； (2)膠體金標(biāo)記兔抗LSV和LMoV多克隆抗體的方法:取半徑為30nm的膠體金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗體各180 μ g，在ΡΗ7.5的條件下通過磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得終濃度為I%，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為復(fù)合膠體金-抗體結(jié)合物；(3)膠體金標(biāo)記兔抗百合CMV多克隆抗體的方法:取半徑為30nm的膠體金10mL、兔抗百合CMV多克隆抗體190μ g，在PH7.7的條件下通過磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得終濃度為I%，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為單一膠體金-抗體結(jié)合物；(4)復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB的制備:用1/10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮復(fù)合膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB ； (5)單一膠體金結(jié)合墊C的制備:用1/10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮單一膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成單一膠體金結(jié)合墊C ； (6)免疫層析膜AB的包被:第一檢測線5、第二檢測線6上分別包被的是兔抗LSV和LMoV多克隆抗體，第一對照線7上包被的是羊抗兔IgG純化抗體；(7)免疫層析膜C的包被:第三檢測線8上包被的是兔抗CMV多克隆抗體，第二對照線9上包被的是羊抗兔IgG純化抗體；(8)雙向復(fù)合膠體金速測卡的組裝:將聚氯乙烯襯板作為支撐載體固定于試劑卡槽下殼體中，然后樣品墊、復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB、硝酸纖維素膜AB和吸水濾紙依次排列連接于襯板右側(cè)上表面，單一膠體金結(jié)合墊C、硝酸纖維素膜C和吸水濾紙依次排列連接于樣品墊左側(cè)襯板的上表面，再將速測卡槽上殼體與下殼體通過卡扣連接，就得到LSV、LMoV和CMV雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡。
[0020]本發(fā)明的試劑卡具有以下優(yōu)點:
[0021]檢測時，吸取少量百合樣品的待檢測溶液，滴在試劑卡槽上殼體第一孔洞處，在第二孔洞和第三孔洞處對比檢測線和對照線的顏色，即可判定百合植株是否感染了 LSV、LMoV或 CMV。
[0022]1、檢測快速:檢測時間只需5?10分鐘，可以滿足現(xiàn)場檢測的需要。
[0023]2、檢測準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、成本低:本反應(yīng)相應(yīng)的檢測線與百合其他主要病毒沒有交叉反應(yīng)，檢測靈敏度高，可一次性同時檢測LSV、LMoV和CMV，進(jìn)一步提高了檢測效率，降低了檢測成本。解決了現(xiàn)有百合病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡技術(shù)所存在的單一性、局限性以及傳統(tǒng)的百合病毒檢測方法成本高、耗時長、對儀器設(shè)備和專業(yè)技能要求高等問題的束縛。
[0024]3、攜帶方便，操作簡便:本發(fā)明不需要借助其他儀器設(shè)備，適合廣大基層單位開展百合病毒的檢測和防控工作，也適合百合生產(chǎn)的企業(yè)、公司以及百合種植的農(nóng)戶使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡平面結(jié)構(gòu)示意圖
[0026]圖2為本發(fā)明百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖
[0027]其中:
[0028]1-試劑卡槽
[0029]2——第一孔洞
[0030]3——第二孔洞
[0031]4——第三孔洞
[0032]5——第一檢測線
[0033]6——第二檢測線
[0034]7——第一對照線
[0035]8——第三檢測線
[0036]9——第二對照線
[0037]10——樣品墊
[0038]11——復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB
[0039]12—硝酸纖維素膜AB
[0040]13——單一膠體金結(jié)合墊C
[0041]14—硝酸纖維素膜C
[0042]15-吸水濾紙
[0043]16-襯板

【具體實施方式】
[0044]如圖1和圖2所示的LSV、LMoV和CMV雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡，包括試劑卡槽I，襯板16,樣品墊10,復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB11,硝酸纖維素膜AB12,單一膠體金結(jié)合墊C13，硝酸纖維素膜C14，吸水濾紙15，其中試劑卡槽I包括上殼體和下殼體，上殼體和下殼體通過卡扣連接，上殼體設(shè)有第一孔洞2、第二孔洞3和第三孔洞4，樣品墊10置于第一孔洞2下方，硝酸纖維素膜AB12置于第二孔洞3下方，硝酸纖維素膜C14置于第三孔洞4下方，復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll上含有復(fù)合金標(biāo)探針，單一膠體金結(jié)合墊C13上含有單一金標(biāo)探針，襯板16固定于試劑卡槽I中，樣品墊10、復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB11、硝酸纖維素膜AB12和吸水濾紙15依次排列連接于襯板16右側(cè)上表面，單一膠體金結(jié)合墊C13、硝酸纖維素膜C14和吸水濾紙15依次排列連接于樣品墊10左側(cè)襯板16的上表面,硝酸纖維素膜AB12上設(shè)有第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7，硝酸纖維素膜C14上設(shè)有第三檢測線8和第二對照線9，第一檢測線5上包被的是兔抗LSV多克隆抗體，第二檢測線6上包被的是兔抗LMoV多克隆抗體，第一對照線7上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，第三檢測線8上包被的是兔抗CMV多克隆抗體，第二對照線9上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗體合適包被量分別為2.0?2.5 μ g、1.5?2.0 μ g以及2.0?2.5 μ g蛋白，LSV和LMoV復(fù)合金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量均為18 μ g/mL, CMV單一金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量為19 μ g/mL,羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2.5?3.0 μ g蛋白。
[0045]其中，樣品墊和膠體金結(jié)合墊材質(zhì)均為玻璃纖維素膜，襯板為聚氯乙烯材質(zhì)做成，起支持作用。
[0046]本發(fā)明試劑卡的制備方法:
[0047]1、本發(fā)明中兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗體的制備方法
[0048]分別從感染了 LSV、LMoV和CMV的百合葉片中提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，擴(kuò)增LSV、LMoV和CMV的CP基因片段，通過酶切克隆至pET_28a載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，37°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和層析純化獲得大小32.0、30.0、24kDa的LSV CP、LMoV CP和CMV CP基因工程融合蛋白。分別用lmg/mL的LSV CP、LMoV CP和CMV CP基因工程融合蛋白作為免疫原分別免疫新西蘭大白兔。初次免疫中，將蛋白抗原與弗氏完全佐劑等體積充分混勻，進(jìn)行皮下多點注射。兩周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，將蛋白抗原與弗氏不完全佐劑等體積充分混勻，進(jìn)行皮下多點注射。以后每兩周加強(qiáng)免疫一次，在第4次加強(qiáng)免疫后的5?7天頸動脈采血，靜至，離心，收集到的血清加入質(zhì)量百分比濃度0.02%的疊氮鈉，-20°C保存。所得抗血清依次通過20%、50%、33%三個飽和度的硫酸銨沉淀粗提后，透析至PH7.8的磷酸緩沖液，然后使用DE52陰離子交換柱進(jìn)行純化而獲得兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗體IgG。
[0049]2、膠體金標(biāo)記兔抗LSV和LMoV多克隆抗體的方法
[0050]取半徑為30nm的膠體金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗體各180 μ g，在PH7.5的條件下通過磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，使得終濃度為I %，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及去凝聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為復(fù)合膠體金-抗體結(jié)合物。
[0051]3、膠體金標(biāo)記兔抗百合CMV多克隆抗體的方法
[0052]取半徑為30nm的膠體金10mL、兔抗百合CMV多克隆抗體190 μ g，在PH7.7的條件下通過磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得終濃度為1%，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為單一膠體金-抗體結(jié)合物。
[0053]4、復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB的制備
[0054]用1/10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮復(fù)合膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB。
[0055]5、單一膠體金結(jié)合墊C的制備
[0056]用1/10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮單一膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成單一膠體金結(jié)合墊C。
[0057]6、免疫層析膜AB的包被
[0058]第一檢測線5、第二檢測線6上分別包被的是兔抗LSV和LMoV多克隆抗體，第一對照線7上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，每條線寬2mm，兔抗LSV多克隆抗體合適包被量為
2.0?2.5 μ g蛋白，兔抗LMoV多克隆抗體合適包被量為1.5?2.0 μ g蛋白，羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2.5?3.0 μ g蛋白。
[0059]7、免疫層析膜C的包被
[0060]第三檢測線8上包被的是兔抗百合CMV多克隆抗體，第二對照線9上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，每條線寬2mm，兔抗百合CMV多克隆抗體合適包被量為2.0?2.5 μ g蛋白，羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2.5?3.0 μ g蛋白。
[0061]8、雙向復(fù)合膠體金速測卡的組裝
[0062]將聚氯乙烯襯板作為支撐載體固定于試劑卡槽下殼體中，然后樣品墊、復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB、硝酸纖維素膜AB和吸水濾紙依次排列連接于襯板右側(cè)上表面，單一膠體金結(jié)合墊C、硝酸纖維素膜C和吸水濾紙依次排列連接于樣品墊左側(cè)襯板的上表面，再將速測卡槽上殼體與下殼體通過卡扣連接，就得到LSV、LMoV和CMV雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡。
[0063]9、雙向復(fù)合膠體金速測卡的使用及結(jié)果判定
[0064]吸取少量百合樣品的待檢測溶液，滴在試劑卡槽上殼體第一孔洞2處，由于毛細(xì)效應(yīng)液體往前移動，若待檢溶液中僅含有LSV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LSV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線5結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二檢測線6時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，則不能與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)诙z測線6和第三檢測線8沒有顏色變化而第一檢測線5和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒。
[0065]若待檢溶液中僅含有LMoV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第二檢測線6時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第二檢測線6結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，則不能與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合,當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時不發(fā)生反應(yīng),單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5和第三檢測線8沒有顏色變化而第二檢測線6和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合斑駁病毒。
[0066]若待檢溶液中僅含有百合CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABlI時,則不能與復(fù)合金標(biāo)墊ABlI上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5、第二檢測線6時不發(fā)生反應(yīng)，復(fù)合金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線8和第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線8結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5和第二檢測線6沒有顏色變化而第三檢測線8和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合黃瓜花葉病毒。
[0067]若待檢溶液中同時含有LSV和LMoV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LSV和LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5和第二檢測線6時分別發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線5和第二檢測線6結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，則不能與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谌龣z測線8沒有顏色變化而第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒和百合斑駁病毒。
[0068]若待檢溶液中同時含有LSV和CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LSV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線5結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二檢測線6時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線8和第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線8結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)诙z測線6沒有顏色變化而第一檢測線5、第三檢測線8和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒和百合黃瓜花葉病毒。
[0069]若待檢溶液中同時含有LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第二檢測線6時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第二檢測線6結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線8和第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線8結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5沒有顏色變化而第二檢測線6、第三檢測線8和第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒。
[0070]若待檢溶液中同時含有LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABll時，LSV和LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊ABll上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線5、第二檢測線6和第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5、第二檢測線6時分別發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線5、第二檢測線6結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線8和第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線8結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5、第二檢測線6、第三檢測線8和第一對照線7、第二對照線9同時出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品同時感染了百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒。
[0071]若待檢溶液中不含LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊ABlI時,則不能與復(fù)合金標(biāo)墊ABlI上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第一檢測線5和第二檢測線6時不發(fā)生反應(yīng)，復(fù)合金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第一對照線7方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線7時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞2的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C13時，則不能與單一金標(biāo)墊C13上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線8時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線9時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線5、第二檢測線6、第三檢測線8沒有顏色變化而第一對照線7、第二對照線9出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品沒有感染百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒。
[0072]上述實施例可以看出，本發(fā)明可對LSV、LMoV和CMV同時進(jìn)行檢測，一般人員不需專門培訓(xùn)即可操作，5?10分鐘即可檢測出結(jié)果，從而達(dá)到快速、簡便、及時檢測這三種病毒的目的。
【權(quán)利要求】
1.一種百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡，包括:試劑卡槽(1)，襯板(16)，樣品墊(10)，復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(ll)，硝酸纖維素膜AB (12)，單一膠體金結(jié)合墊C (13)，硝酸纖維素膜C (14)，吸水濾紙(15)，其特征在于:試劑卡槽(I)包括上殼體和下殼體，上殼體和下殼體通過卡扣連接，上殼體設(shè)有第一孔洞(2)、第二孔洞(3)和第三孔洞(4)，樣品墊(10)置于第一孔洞(2)下方，硝酸纖維素膜AB (12)置于第二孔洞(3)下方，硝酸纖維素膜C (14)置于第三孔洞(4)下方，復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(Il)上含有復(fù)合金標(biāo)探針，單一膠體金結(jié)合墊C(13)上含有單一金標(biāo)探針，襯板(16)固定于試劑卡槽(I)中，樣品墊(10)、復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(ll)、硝酸纖維素膜AB (12)和吸水濾紙(15)依次排列連接于襯板(16)右側(cè)上表面，單一膠體金結(jié)合墊C (13)、硝酸纖維素膜C(14)和吸水濾紙(15)依次排列連接于樣品墊(10)左側(cè)襯板(16)的上表面，硝酸纖維素膜AB (12)上設(shè)有第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和第一對照線(7)，硝酸纖維素膜C(14)上設(shè)有第三檢測線(8)和第二對照線(9)，第一檢測線(5)上包被的是兔抗LSV多克隆抗體，第二檢測線(6)上包被的是兔抗LMoV多克隆抗體，第一對照線(7)上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，第三檢測線(8)上包被的是兔抗百合CMV多克隆抗體，第二對照線(9)上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗體合適包被量分別為2.0?2.5 μ g、1.5?2.0 μ g以及2.0?2.5 μ g蛋白，LSV和LMoV復(fù)合金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量均為18 μ g/mL,百合CMV單一金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量為19 μ g/mL,羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2.5?3.0 μ g蛋白； 其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞(2)處5?10分鐘后，若待檢溶液中僅含有LSV，在所述第一孔洞⑵的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(Il)時，LSV與復(fù)合金標(biāo)墊AB(Il)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線(5)時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線(5)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二檢測線(6)和第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二檢測線(6)時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第一對照線(7)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞(2)的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C (13)時，則不能與單一金標(biāo)墊C (13)上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線(8)時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線(9)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)诙z測線(6)和第三檢測線(8)沒有顏色變化而第一檢測線(5)和第一對照線(7)、第二對照線(9)出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒； 若待檢溶液中僅含有LMoV，將少量待檢溶液加入所述第一孔洞(2)處5?10分鐘后，在所述第一孔洞⑵的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(Il)時，LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊AB(Il)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線(5)時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第二檢測線(6)時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第二檢測線(6)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線(7)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞(2)的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C(13)時，則不能與單一金標(biāo)墊C (13)上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線(8)時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線(9)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線(5)和第三檢測線(8)沒有顏色變化而第二檢測線(6)和第一對照線(7)、第二對照線(9)出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合斑駁病毒； 若待檢溶液中僅含有百合CMV，將少量待檢溶液加入所述第一孔洞(2)處5?10分鐘后，在所述第一孔洞(2)的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(Il)時，則不能與復(fù)合金標(biāo)墊AB(Il)上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第一檢測線(5)、第二檢測線(6)時不發(fā)生反應(yīng)，復(fù)合金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線(7)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞(2)的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C(13)時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C(13)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線(8)和第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線(8)時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線(8)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線(9)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線(5)和第二檢測線(6)沒有顏色變化而第三檢測線(8)和第一對照線(7)、第二對照線(9)出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合黃瓜花葉病毒； 若待檢溶液中同時含有LSV和LMoV，將少量待檢溶液加入所述第一孔洞(2)處5?10分鐘后，在所述第一孔洞(2)的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(Il)時，LSV和LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊AB(Il)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線(5)和第二檢測線(6)時分別發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線(5)和第二檢測線(6)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線(7)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞(2)的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C(13)時，則不能與單一金標(biāo)墊C(13)上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第三檢測線(8)時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線(9)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谌龣z測線(8)沒有顏色變化而第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和第一對照線(7)、第二對照線(9)出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒和百合斑駁病毒； 若待檢溶液中同時含有LSV和CMV，將少量待檢溶液加入所述第一孔洞(2)處5?10分鐘后，在所述第一孔洞(2)的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(Il)時，LSV與復(fù)合金標(biāo)墊AB(Il)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線(5)時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線(5)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二檢測線(6)和第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二檢測線(6)時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第一對照線(7)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞(2)的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C(13)時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C(13)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線(8)和第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線(8)時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線(8)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線(9)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)诙z測線(6)沒有顏色變化而第一檢測線(5)、第三檢測線(8)和第一對照線(7)、第二對照線(9)出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒和百合黃瓜花葉病毒； 若待檢溶液中同時含有LMoV和CMV，將少量待檢溶液加入所述第一孔洞(2)處5?10分鐘后，在所述第一孔洞(2)的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(Il)時，LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊AB(Il)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線(5)時不發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)接觸到所述第二檢測線(6)時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第二檢測線(6)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線(7)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞(2)的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C(13)時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C(13)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線(8)和第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線(8)時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線(8)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線(9)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線(5)沒有顏色變化而第二檢測線￠)、第三檢測線(8)和第一對照線(7)、第二對照線(9)出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒； 若待檢溶液中同時含有LSV、LMoV和CMV，將少量待檢溶液加入所述第一孔洞(2)處5?10分鐘后，在所述第一孔洞(2)的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB(Il)時，LSV和LMoV與復(fù)合金標(biāo)墊AB(Il)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測線(5)、第二檢測線(6)時分別發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第一檢測線(5)、第二檢測線(6)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線(7)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞(2)的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C(13)時，百合CMV與單一金標(biāo)墊C(13)上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第三檢測線(8)和第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測線(8)時發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未與第三檢測線(8)結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線(9)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線(5)、第二檢測線￠)、第三檢測線(8)和第一對照線(7)、第二對照線(9)同時出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的百合癮癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡，其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞(2)處5?10分鐘后，若待檢溶液中不含LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞(2)的右側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB (II)時,則不能與復(fù)合金標(biāo)墊AB (II)上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第一檢測線(5)和第二檢測線(6)時不發(fā)生反應(yīng)，復(fù)合金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第一對照線(7)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對照線(7)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；同時在所述第一孔洞(2)的左側(cè)，檢測樣品經(jīng)過所述單一膠體金結(jié)合墊C (13)時,貝U不能與單一金標(biāo)墊C (13)上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合,當(dāng)接觸到所述第三檢測線(8)時不發(fā)生反應(yīng)，單一金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對照線(9)方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二對照線(9)時與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)谝粰z測線(5)、第二檢測線(6)、第三檢測線(8)沒有顏色變化而第一對照線(7)、第二對照線(9)出現(xiàn)棕紅色的條帶時，則判定被檢樣品沒有感染百合隱癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒。
3.—種如權(quán)利要求1-2所述百合癮癥病毒、百合斑駁病毒和百合黃瓜花葉病毒雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡的制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行:①兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗體的制備；②膠體金標(biāo)記兔抗LSV和LMoV多克隆抗體的方法:取半徑為30nm的膠體金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗體各180 μ g，在PH7.5的條件下通過磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得終濃度為1%，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為復(fù)合膠體金-抗體結(jié)合物膠體金標(biāo)記兔抗百合CMV多克隆抗體的方法:取半徑為30nm的膠體金10mL、兔抗百合CMV多克隆抗體190 μ g，在ΡΗ7.7的條件下通過磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得終濃度為1%，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為單一膠體金-抗體結(jié)合物；④復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB的制備:用1/10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮復(fù)合膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB ;⑤單一膠體金結(jié)合墊C的制備:用1/10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮單一膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成單一膠體金結(jié)合墊C ;⑥免疫層析膜AB的包被:在硝酸纖維素膜上分別包被兔抗LSV和LMoV多克隆抗體第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和羊抗兔IgG純化抗體第一對照線(7)，每條線寬2mm，兔抗LSV多克隆抗體合適包被量為2.0?2.5 μ g蛋白，兔抗LMoV多克隆抗體合適包被量為1.5?2.0 μ g蛋白，羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2.5?3.0 μ g蛋白；⑦免疫層析膜C的包被:在硝酸纖維素膜上包被兔抗百合CMV多克隆抗體第三檢測線(8)和羊抗兔IgG純化抗體第二對照線(9)，每條線寬2mm，兔抗百合CMV多克隆抗體合適包被量為2.0?2.5 μ g蛋白，羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2.5?3.Ομ g蛋白；⑧雙向復(fù)合膠體金速測卡的組裝:將聚氯乙烯襯板作為支撐載體固定于試劑卡槽下殼體中，然后樣品墊、復(fù)合膠體金結(jié)合墊AB、硝酸纖維素膜AB和吸水濾紙依次排列連接于襯板右側(cè)上表面，單一膠體金結(jié)合墊C、硝酸纖維素膜C和吸水濾紙依次排列連接于樣品墊左側(cè)襯板的上表面，再將速測卡槽上殼體與下殼體通過卡扣連接，就得到LSV、LMoV和CMV雙向復(fù)合膠體金免疫層析速測卡。
【文檔編號】G01N33/558GK104374912SQ201410524273
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】張玉寶, 王亞軍, 陳延, 謝忠奎, 王若愚, 郭志鴻 申請人:中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所