一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器及對(duì)核酸的檢測的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器的制備方法，連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，即S1-CP-AuNPs聚合物；在基底電極表面修飾CS-GR復(fù)合物，浸在連接探針2中，得S2/CS-GR/基底電極；將S2/CS-GR/基底電極浸在S1-CP-AuNPs聚合物中，通過S1和S2間堿基互補(bǔ)配對(duì)將S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底電極上，即傳感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。本發(fā)明還提供了一種依據(jù)上述方法制備的電化學(xué)傳感器。所述的傳感器可用于核酸的檢測，該傳感器具有很高的靈敏性，而且免標(biāo)記，對(duì)p53基因檢測范圍10-15～10-9mol/L，檢測限0.3×10-15mol/L。
【專利說明】-種多重信號(hào)放大的免標(biāo)巧電化學(xué)傳感器及對(duì)核酸的檢測

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及核酸的檢測方法，特別是一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器及 對(duì)核酸的檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)知人類的疾病都與基因有著直接或間接的關(guān)系，P53基因是人體重要的抑癌基 因，使癌細(xì)胞自殺，防止癌變，還具有幫助細(xì)胞基因修復(fù)缺陷的功能。一旦p53基因發(fā)生突 變，將會(huì)加快腫瘤的生長和癌癥的發(fā)展。因此，對(duì)核酸的高靈敏、高選擇性的快速檢測方法 存在著越來越迫切的需求，該對(duì)于基因研究、藥物篩選W及臨床診斷都有現(xiàn)實(shí)意義。
[000引 目前，用來檢測核酸的方法主要有；DNA印跡、RNA印跡和PCR技術(shù)，該些方法操作 中的一個(gè)共同點(diǎn)是必須把未雜交的探針和引物與雜交體分離后才能借助其他信號(hào)對(duì)祀核 酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器及對(duì) 核酸的檢測，所述的電化學(xué)傳感器具有很高的靈敏性，而且免標(biāo)記。
[0005] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種快速、高靈敏度的核酸檢測方法。
[0006] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器的制備方法，技術(shù)方案如下：
[000引 （1)連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，形成連接探針1-捕獲探針-金 納米粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物，其中，連接探針1的核巧酸序列為5'-SH-C6-TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG-3'，如序列表中SEQ ID NO. 1所示，捕獲探針的核巧酸序列為 5'-SH-C6-AAA GGG TTG GGC GGG ATG GGT TGA GTC TTC C i AG TGT GAT GAA ACC CAT C-3'，如序列表中SEQ ID NO. 2所示；
[0009] (2)石墨締分散在殼聚糖溶液中，形成殼聚糖-石墨締聚合物，即CS-GR復(fù)合物；
[0010] (3)在基底電極表面修飾CS-GR復(fù)合物，得殼聚糖-石墨締/基底電極，即CS-GR/ 基底電極；
[0011] (4)將殼聚糖-石墨締/基底電極處理后，浸在連接探針2中，得連接探針2/ 殼聚糖-石墨締/基底電極，即S2/CS-GR/基底電極，其中，連接探針2的核巧酸序列為 5, -NH2-C6-TTT TTTTCT GAC GCT GCT CAC G-3，，如序列表中 SEQ ID NO. 3 所示；
[0012] (5)將S2/CS-GR/基底電極浸在Sl-CP-AuNPs聚合物中，通過S1和S2間堿基互補(bǔ) 配對(duì)將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底電極上，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒 子/連接探針2/殼聚糖-石墨締/基底電極，即傳感器Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
[001引所述步驟似中殼聚糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. Iwt%?0. 5wt%。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中，基底電極為玻碳電極。
[0015] 所述步驟（1)中連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，連接探針1和捕 獲探針中分別加入=(2-氯己基）磯酸醋TCEP，室溫避光處理1小時(shí)；將上述兩溶液混 合加入到金納米粒子中，室溫避光攬拌；攬拌的過程中逐滴加入=哲甲基氨基甲燒-鹽酸 緩沖液Tris-HCl，再逐滴加入化C1溶液，室溫避光攬拌；將上述溶液離屯、，將沉淀重新分 散在Tris-HCl和化C1的混合溶液中，即得連接探針-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即 Sl-CP-AuNPs 聚合物。
[0016] 所述步驟（3)中，玻碳電極用S氧化二侶粉打磨成鏡面后清洗，驚干后，將CS-GR 復(fù)合物滴涂在玻碳電極上，室溫驚干，制得殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即CS-GR/GCE。
[0017] 所述步驟（4)中，殼聚糖-石墨締/玻碳電極浸在戊二醒溶液中，然后清洗；將清 洗后的殼聚糖-石墨締/玻碳電極浸在連接探針S2中，制得連接探針/殼聚糖-石墨締/ 玻碳電極，即S2/CS-GR/GCE ;其中，戊二醒溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5%?5%。
[0018] 步驟（3)中所述清洗，是在二次水中清洗3?5分鐘，然后依次在己醇和二次水中 超聲3?5分鐘。
[0019] 步驟（4)中所述清洗，是分別在化OH溶液和lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1緩沖 液中。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述方案制備的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器。
[0021] 本發(fā)明的另一目的是提供上述電化學(xué)傳感器在檢測核酸含量的應(yīng)用，包括W下步 驟：
[002引 （1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組含有不同濃度P53基因的抑為7. 4的Tris-肥1緩 沖溶液為標(biāo)準(zhǔn)液；
[0023] (2)建立工作曲線；將所述傳感器分別浸入標(biāo)準(zhǔn)溶液中40°C解育80分鐘，解育后 用Tris-HCl緩沖液沖洗，再將傳感器分別浸入肥Buffer 3、氯高血紅素、亞甲基藍(lán)溶液中， 每次浸入后均用Tris-HCl緩沖液沖洗，在lOmL Tris-HCl、KC1和&〇2的混合溶液中進(jìn)行 差分脈沖伏安法值PV)掃描，記錄響應(yīng)電流I (uA)，所述I值與標(biāo)準(zhǔn)溶液中p53基因濃度 c(mol/L)的對(duì)數(shù)log C成正比，繪制I-log C標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用線性回歸法得到I-log C線 性回歸方程；
[0024] (3)p53基因含量測定；將待測樣品配制為含有步驟（1)相同濃度P53基因的 Tris-HCl緩沖溶液，按照與步驟（2)相同的方法對(duì)所述傳感器進(jìn)行解育和進(jìn)一步反應(yīng)后進(jìn) 行差分脈沖伏安掃描，記錄響應(yīng)電流I ;根據(jù)響應(yīng)電流I和I-log C線性回歸方程，得到p53 基因含量。
[002引步驟（1)中所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為lOOmmol/L，步驟似中所用 Tris-HCl的濃度均為lOmmol/L，所述步驟（2)中肥Buffer 3含有0.加nit/ y L N. BstNB lo
[0026] 本發(fā)明的有益效果為；
[0027] 1.本發(fā)明建立了一種基于多重信號(hào)放大、免標(biāo)記的電化學(xué)適體傳感器用于超靈敏 檢測p53基因，其中多重信號(hào)放大策略包括；（1)殼聚糖-石墨締復(fù)合物基底有利于電子在 電極表面的轉(zhuǎn)移；(2)具有高比表面積的金納米粒子AuNPs可W固定更多的捕獲探針CP ; (3)在切刻內(nèi)切酶N.BstNB I的作用下，p53基因能重復(fù)利用，從而在酶切后產(chǎn)生更多的富 鳥嚷嶺G結(jié)構(gòu)，并在氯高血紅素hemin和K+的存在下形成DNA酶DNAzyme ; (4)DNAzyme催 化&化還原，同時(shí)促進(jìn)了亞甲基藍(lán)MB的氧化還原；W上方案能夠使信號(hào)增強(qiáng)，因此信號(hào)放大 策略具備可行性；
[002引 2.與現(xiàn)有的電化學(xué)傳感器相比，本發(fā)明的電化學(xué)傳感器具有免標(biāo)記的特點(diǎn)，信號(hào) 的產(chǎn)生依靠DNAzyme的催化作用，免除了傳統(tǒng)的標(biāo)記過程；
[0029] 3.本發(fā)明的電化學(xué)傳感器具有高度的靈敏性和專一性，對(duì)核酸的檢測簡單高效， 檢測限可達(dá)0. 3Xl(Ti5mol/l，檢測范圍為1045?l(T9mol/L。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明的電化學(xué)傳感器檢測原理示意圖；
[0031] 圖2為本發(fā)明的信號(hào)放大結(jié)果比較圖，其中，（a)為電極Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/ GCE 在與 p53 作用前，（b)為電極 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE 與 Inmol/L p53 作用后，（C) 為化）與酶反應(yīng)后，（d)為（C)與氯高血紅素作用后；
[0032] 圖3為本發(fā)明的DPV曲線圖，其中a-g為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為l(Ti5m〇i/L， l〇-"mol/L，l〇-"mol/L，l〇-i2mol/L，l〇-iimol/L，l〇-i°mol/L 和 l〇-9mol/L);
[0033] 圖4為響應(yīng)電流的變化A I與核酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0034] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4的DPV曲線圖；
[003引圖6為本發(fā)明實(shí)施例5的DPV峰電流強(qiáng)度柱狀圖，其中，TD為p53基因（5' -TCA TCA CAC TGG AAG ACT C-3')(如序列表中SEQ ID NO. 4所示）的檢測液，sTD為堿基錯(cuò)配 (5' -TCA TCA CAC TGG AAG AAT C-3'）的檢測液，nTD 為全部堿基錯(cuò)配巧' -GAC GTC AGA CTT CCT GCG A-3'）的檢測液，CK為抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-肥1緩沖溶液。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，并非構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的 保護(hù)范圍不W【具體實(shí)施方式】為限。
[0037] 實(shí)施例1 ;電化學(xué)傳感器的制備
[0038] 一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器，制備方法如下：
[0039] (1)連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定：
[0040] 2uL 100ymol/L S1 和 8uL 100ymol/L CP 中分別加入 0. luL 3mmol/L和 0. 4 y L 3mmol/L S (2-氯己基）磯酸醋（TCE巧，室溫避光處理1小時(shí)；將上述兩溶液混合 加入到0. 3mL攬拌速率為Ir/s的AuNPs中，室溫避光攬拌10小時(shí)；攬拌的過程中逐滴加入 3 y L 500 y mol/L pH 7. 4 的 Tris-HCl 緩沖液，再逐滴加入 50 y L Imol/L NaCl 溶液，室溫 避光攬拌10小時(shí)；上述溶液在l〇〇(K)r/min的轉(zhuǎn)速下離屯、lOmin，將沉淀重新分散在50 y L lOOmmol/L Tris-肥1和lOOmmol/L化Cl的混合液中；再次離屯、速度為lOOOOr/min，時(shí)間 lOmin，將沉淀重新分散在 200 y L pH 7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl 和 300mmol/L 化C1 的混 合液中，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物；
[0041] (2)玻碳電極分別用0. 05 ym和0. 3 ym的S氧化二侶粉打磨成鏡面后，用二次水 清洗2min，再依次在己醇和二次水中超聲清洗2min，室溫驚干；Img石墨締分散在0. 5mL質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為0. Iwt %的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的醋酸溶液中，超 聲共混，形成CS-GR復(fù)合物；將3 y L CS-GR復(fù)合物滴涂在玻碳電極GCE上，室溫驚干，制得 殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即電極CS-GR/GCE ;
[00創(chuàng) 做電極CS-GR/GCE在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5%的戊二醒溶液中浸泡1小時(shí)，用0. Imol/ L化OH溶液和lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1依次清洗2min ;將清洗后的電極浸在30 y L 0. 5 y mol/L連接探針2中1小時(shí)，用lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1緩沖液清洗2min后，審U 得連接探針2/殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即S2/CS-GR/GCE ;
[0043] (4)將 S2/CS-GR/GCE 浸在 30 y L Sl-CP-AuNPs 中 40 °C 0. 5 小時(shí)，通過 S1 和 S2 間堿基互補(bǔ)配對(duì)，將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/GCE上，清洗液清洗后制得傳感器 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
[0044] 如圖1所示，石墨締與殼聚糖非共價(jià)結(jié)合，石墨締-殼聚糖共同修飾的玻碳電極能 提供大的比表面積供更多的連接探針2固定；發(fā)夾結(jié)構(gòu)的捕獲探針和連接探針1通過Au-S 鍵固定在金納米粒子上；由于金納米粒子大的比表面積，更多的捕獲探針和連接探針1可 W被固定；連接探針1和連接探針2之間堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而將固定有捕獲探針和連接探針 1的金納米粒子固定在電極上。切刻內(nèi)切酶N.BstNB I識(shí)別雙鏈DNA中特定堿基序列并切 刻其中一條鏈。在沒有p53存在的情況下，N.BstNB I不能切割發(fā)夾捕獲探針（酶識(shí)別位 點(diǎn)處在環(huán)處，不是雙鏈結(jié)構(gòu)），因此發(fā)夾捕獲探針莖中的富鳥嚷嶺序列不能在氯高血紅素和 鐘離子存在下形成DNA酶值NAzyme)。當(dāng)p53存在時(shí)，p53與發(fā)夾捕獲探針互補(bǔ)配對(duì)形成 雙鏈結(jié)構(gòu)，發(fā)夾的莖部打開，酶識(shí)別位點(diǎn)處是雙鏈結(jié)構(gòu)，被N. BstNB I識(shí)別并切割捕獲探針。 捕獲探針被切割后富G結(jié)構(gòu)的鏈留在金納米粒子上即留在電極上，p53基因釋放與其他發(fā) 夾捕獲探針結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)供酶識(shí)別切割，從而形成更多留在納米金上的富G結(jié)構(gòu)，并 且在氯高血紅素和鐘離子的存在下形成DNAzyme。因此，一個(gè)p53可W循環(huán)利用引發(fā)多個(gè) DNAzyme的形成。在靜電作用下，荷正電的亞甲基藍(lán)嵌入到DNA結(jié)構(gòu)中，作為電子媒介體產(chǎn) 生電化學(xué)信號(hào)，同時(shí)，DNAzyme能催化雙氧水還原并促進(jìn)亞甲基藍(lán)的氧化還原反應(yīng)，使信號(hào) 進(jìn)一步增強(qiáng)。
[0045] 實(shí)施例2 ;電化學(xué)傳感器的制備
[0046] 一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器，制備方法如下：
[0047] (1)連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定：
[0048] 6uL 100ymol/L S1 和 24uL 100ymol/L CP 中分別加入0. 3uL 3mmol/L 和 1. 2 y L 3mmol/L S (2-氯己基）磯酸酉旨（TCE巧，室溫避光處理1小時(shí)；將上述兩溶液混 合加入到ImL攬拌速率為Ir/s的AuNPs中，室溫避光攬拌12小時(shí)；攬拌的過程中逐滴加 入 10 y L 500 y mol/L pH 7. 4 的 Tris-HCl 緩沖液，再逐滴加入 115 y L Imol/L 化C1 溶 液，室溫避光攬拌12小時(shí)；上述溶液在160(K)r/min的轉(zhuǎn)速下離屯、20min，將沉淀重新分散 在200 y L lOOmmol/L Tris-HCl和lOOmmol/L化C1的混合液中；再次離屯、速度為leOOOr/ min,時(shí)間 20min，將沉淀重新分散在 500 y L pH 7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl 和 300mmol/L 化Cl的混合液中，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物；
[0049] (2)玻碳電極分別用0. 05 y m和0. 3 y m的S氧化二侶粉打磨成鏡面后，用二次水 清洗3min，再依次在己醇和二次水中超聲清洗3min，室溫驚干；3mg石墨締分散在1. 5mL質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為0. 2wt %的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的醋酸溶液中，超聲 共混，形成CS-GR復(fù)合物；將6 y L CS-GR復(fù)合物滴涂在玻碳電極GCE上，室溫驚干，制得殼 聚糖-石墨締/玻碳電極，即電極CS-GR/GCE ;
[0050] 做電極CS-GR/GCE在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2. 5%的戊二醒溶液中浸泡2小時(shí)，用0. Imol/ L化OH溶液和lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1依次清洗2min ;將清洗后的電極浸在50 y L 0. 5 y mol/L連接探針2中1小時(shí)，用lOmmol/L抑7. 4的Tris-肥1緩沖液清洗2min后，審U 得連接探針2/殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即S2/CS-GR/GCE ;
[0051] (4)將 S2/CS-GR/GCE 浸在 30 y L Sl-CP-AuNPs 中 40 °C 1 小時(shí)，通過 S1 和 S2 間堿基互補(bǔ)配對(duì)，將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/GCE上，清洗液清洗后制得傳感器 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
[005引實(shí)施例3 ;電化學(xué)傳感器的制備
[0化引一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器，制備方法如下：
[0化4] (1)連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定：
[0化引 lOyL 100ymol/L S1 和 40yL 100ymol/L CP 中分別加入0. 5uL 3mmol/L 和 2. 0 y L3mmol/L S (2-氯己基）磯酸醋（TCE巧，室溫避光處理2小時(shí)；將上述兩溶液混合 加入到1. 6mL攬拌速率為Ir/s的AuNPs中，室溫避光攬拌16小時(shí)；攬拌的過程中逐滴加 入16 y L 500 y mol/L pH 7. 4的Tris-肥1緩沖液，再逐滴加入200 y L Imol/L化C1溶液， 室溫避光攬拌16小時(shí)；上述溶液在200(K)r/min的轉(zhuǎn)速下離屯、30min，將沉淀重新分散在 300 y L lOOmmol/LTris-肥1和lOOmmol/L化C1的混合液中；再次離屯、速度為20000r/min， 時(shí)間 30min，將沉淀重新分散在 800 yL pH 7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl 和 300mmol/L 化Cl 的混合液中，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物； [0化6] (2)玻碳電極分別用0. 05 y m和0. 3 y m的S氧化二侶粉打磨成鏡面后，用二次水 清洗5min，再依次在己醇和二次水中超聲清洗5min，室溫驚干；6mg石墨締分散在3. OmL質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為0. 5wt%的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的醋酸溶液中，超聲 共混，形成CS-GR復(fù)合物；將8 y L CS-GR復(fù)合物滴涂在玻碳電極GCE上，室溫驚干，制得殼 聚糖-石墨締/玻碳電極，即電極CS-GR/GCE ;
[0化7] (3)電極CS-GR/GCE在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的戊二醒溶液中浸泡3小時(shí)，用0. Imol/ L化OH溶液和lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1依次清洗5min ;將清洗后的電極浸在80 y L 0. 5 y mol/L連接探針2中1小時(shí)，用lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1緩沖液清洗5min后，審U 得連接探針2/殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即S2/CS-GR/GCE ;
[0058] (4)將 S2/CS-GR/GCE 浸在 80 y L Sl-CP-AuNPs 中 40 °C 3 小時(shí)，通過 S1 和 S2 間堿基互補(bǔ)配對(duì)，將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/GCE上，清洗液清洗后制得傳感器 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
[0化9] 實(shí)施例4 ;可行性分析
[0060] 實(shí)施例1制備的傳感器Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE在浸入亞甲基藍(lán)后并利用 lOmL 抑7. 4 的 lOOmmol/L Tris-肥 1、0. Imol/L KC1 和 2mmol/L &〇2的混合液進(jìn)行清洗，進(jìn) 行DPV檢測，如圖2所示，研究了傳感器在信號(hào)放大過程的不同階段的電信號(hào)。發(fā)現(xiàn)傳感器 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE在與p53作用前（a),與Inmol/L p53作用后化），再與酶反應(yīng) 后（C)時(shí)都在-0.244V處出現(xiàn)氧化峰（亞甲基藍(lán)特征峰），并且峰高之間差別不大；而當(dāng)電 極與氯高血紅素作用后（d)，亞甲基藍(lán)的氧化峰電流明顯增強(qiáng)，該是由于形成的DNAzyme催 化雙氧水還原并促進(jìn)亞甲基藍(lán)的氧化還原，使信號(hào)增強(qiáng)，W上結(jié)果顯示本方法提出的信號(hào) 放大策略是可行的。
[0061] 實(shí)施例5 ;電化學(xué)傳感器在檢測核酸含量的應(yīng)用，包括W下步驟：
[006引 （1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組含有不同濃度p53基因的抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-HCl緩沖溶液為標(biāo)準(zhǔn)液；
[0063] (2)建立工作曲線；將所述傳感器分別浸入標(biāo)準(zhǔn)溶液中40°C解育80分鐘，解育 后用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液沖洗，再將所述傳感器浸入含有0.加nit/uL N.BstNB I的50 L肥Buffer 3中55〇C反應(yīng)1小時(shí)，將溶液加熱至。90〇C，保持10分鐘使酶失活， 冷卻到室溫后，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗傳感器，再將所述傳感器浸泡在50 y L 0. 2mmol/L氯高血紅素化emin)中，室溫反應(yīng)30分鐘，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗 傳感器，再將所述傳感器浸泡在50 y L 0. 5mmol/L亞甲基藍(lán)（MB)溶液中，室溫反應(yīng)50分 鐘，用 lOmmol/L Tris-肥 1 緩沖液清洗傳感器，在 lOmL pH 7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl、 0. Imol/L KCl和2mmol/L &化混合液中進(jìn)行差分脈沖伏安法值PV)掃描（-0. 5?OV)，記 錄響應(yīng)電流I，如圖3所示，該傳感器利用W上步驟對(duì)（10-1S，1〇-"，1〇-"，1〇-12,1〇-11，1〇-1°， l(T9m〇l/L)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測的DPV圖，結(jié)果表明，隨著基因p53核酸濃度的增 力口，DPV峰電流增大；所述I值與標(biāo)準(zhǔn)溶液中p53基因濃度C的對(duì)數(shù)（log C)成正比，繪制 I-log C標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用線性回歸法得到I-log C線性回歸方程；如圖4所示，線性回歸 方程為；Y = 82. 71+4. 417X，R = 0. 9930。該傳感器對(duì)p53基因檢測范圍l(ri5?1Q可jol/ L 檢測限 0. 3Xl〇-i5mol/L。
[0064] (3)p53基因含量測定：按照與步驟（2)相同的方法對(duì)所述傳感器進(jìn)行解育和進(jìn)一 步反應(yīng)后進(jìn)行差分脈沖伏安掃描，記錄響應(yīng)電流；根據(jù)響應(yīng)電流I和I-log C線性回歸方 程，得到p53基因含量。
[0065] 實(shí)施例6機(jī)3基因濃度的檢測
[0066] 配制含有未知p53基因濃度的檢測液（抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-肥1緩沖 溶液）；將實(shí)施例1制備的傳感器浸入上述溶液中40°C解育80分鐘，解育后用lOmmol/L Tris-HCl沖洗，再將傳感器分別浸入含有0.加nit/ y L N. BstNB I的50 y L肥Buffer 3 中55°C反應(yīng)1小時(shí)，將溶液加熱到90°C，保持10分鐘使酶失活，冷卻到室溫后，用lOmmol/ L Tris-HCl緩沖液清洗傳感器，再將傳感器分別浸泡在50yL 0. 2mmol/L氯高血紅素 Oiemin)中室溫反應(yīng)30分鐘，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗傳感器，再將傳感器分別浸 泡在50 y L 0. 5mmol/L亞甲基藍(lán)（MB)溶液中室溫50分鐘，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液 清洗傳感器。在在 lOmL pH7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl、0. Imol/L KC1 和 2mmol/L &〇2混 合液中進(jìn)行差分脈沖伏安法值PV)掃描（-0.5?OV)，記錄響應(yīng)電流I，結(jié)果如圖5所示，根 據(jù)實(shí)施例3得到的I-log C線性回歸方程Y = 82. 71+4. 417X，R = 0. 9930,計(jì)算得p53基 因濃度為l〇-"mol/L。
[0067] 實(shí)施例5 ;傳感器對(duì)p53基因特異性的檢測
[0068] 配制 p53 基因（5'-TCA TCA CAC TGG AAG ACT C-3'）及單堿基錯(cuò)配巧'-TCA TCA CAC TGG AAG AAT C-3'）、全部堿基錯(cuò)配（5'-GAC GTC AGA CTT CCT GCG A-3'）的檢測液， W上所述檢測液均為基因含量為l(T9mol/L，抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-HCl緩沖溶液， 同時(shí)設(shè)有空白液，即抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-HCl緩沖溶液，將實(shí)施例1制備的傳感器 分別浸入上述溶液中40°C解育80分鐘，解育后用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液沖洗，再將傳 感器分別浸入含有0.加nit/ y L N. BstNB I的50 y L肥Buffer 3中55°C反應(yīng)1小時(shí)，將 溶液加熱到90°C 10分鐘使酶失活，冷卻到室溫后，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗傳感 器，再將傳感器分別浸泡在50yL 0.2mmol/L氯高血紅素化emin)中室溫反應(yīng)30分鐘，用 lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗傳感器，再將傳感器分別浸泡在50 y L 0. 5mmol/L亞甲基 藍(lán)細(xì)）溶液中室溫50分鐘，用10111111〇1/1化13-肥1緩沖液清洗傳感器。10血抑7.4的 lOOmmol/L Tris-HCl、0. Imol/L KC1和2mmol/L &〇2混合液中進(jìn)行差分脈沖伏安法值PV) 掃描（-0.5?0V)，記錄響應(yīng)電流I。由圖6可見，該傳感器對(duì)單堿基錯(cuò)配和全部堿基錯(cuò)配 的p53基因的電化學(xué)響應(yīng)遠(yuǎn)低于傳感器對(duì)p53基因的電化學(xué)響應(yīng)，因此，該傳感器對(duì)p53基 因的檢測有特異性，該是由于發(fā)夾捕獲探針CP對(duì)p53基因具有特異性，捕獲探針CP只能與 p53基因互補(bǔ)配對(duì)，打開發(fā)夾捕獲探針CP暴露N. BstNB I的識(shí)別位點(diǎn)，從而剪切CP釋放p53 基因參與下一個(gè)循環(huán)，而留在納米金上的部分捕獲探針CP在鐘離子存在下與hemin形成 DNA酶結(jié)構(gòu)，一系列的反應(yīng)變化實(shí)現(xiàn)信號(hào)有效放大，而單堿基錯(cuò)配和全部堿基錯(cuò)配的基因不 能與捕獲探針CP互補(bǔ)配對(duì)，從而不能發(fā)生接下來一系列的反應(yīng)。
【權(quán)利要求】
1. 一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，形成連接探針1-捕獲探針-金納米 粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物，其中，連接探針1的核苷酸序列為5'-SH-C6-TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG-3'，捕獲探針的核苷酸序列為 5'-SH-C6-AAA GGG ITG GGC GGG ATG GGT TGAGTC TTC C 丨 AG TGT GAT GAA ACC CAT 03' ； (2) 石墨烯分散在殼聚糖溶液中，形成殼聚糖-石墨烯聚合物，即CS-GR復(fù)合物； (3) 在基底電極表面修飾CS-GR復(fù)合物，得殼聚糖-石墨烯/基底電極，即CS-GR/基底 電極； (4) 將殼聚糖-石墨烯/基底電極處理后，浸在連接探針2中，得連接探針2/殼 聚糖-石墨烯/基底電極，即S2/CS-GR/基底電極，其中，連接探針2的核苷酸序列為 5' -NH2-C6-TTT TTT TCT GAC GCT GCT CAC G-3' ； (5) 將S2/CS-GR/基底電極浸在Sl-CP-AuNPs聚合物中，通過S1和S2間堿基互補(bǔ)配對(duì) 將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底電極上，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒子/ 連接探針2/殼聚糖-石墨烯/基底電極，即傳感器Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器的制備方法，其特 征在于，所述步驟（3)中，基底電極為玻碳電極。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器的制備方法， 其特征在于，所述步驟（1)中連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，連接探針1和 捕獲探針中分別加入三（2-氯乙基）磷酸酯TCEP，室溫避光處理1小時(shí)；將上述兩溶液混 合加入到金納米粒子中，室溫避光攪拌；攪拌的過程中逐滴加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 緩沖液Tris-HCl，再逐滴加入NaCl溶液，室溫避光攪拌；將上述溶液離心，將沉淀重新分 散在Tris-HCl和NaCl的混合溶液中，即得連接探針-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即 Sl-CP-AuNPs 聚合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器的制備方法，其特 征在于，所述步驟（3)中，玻碳電極用三氧化二鋁粉打磨成鏡面后清洗，晾干后，將CS-GR復(fù) 合物滴涂在玻碳電極上，室溫晾干，制得殼聚糖-石墨烯/玻碳電極，即CS-GR/GCE。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器的制備方法，其特 征在于，所述步驟（4)中，殼聚糖-石墨烯/玻碳電極浸在戊二醛溶液中，然后清洗；將清洗 后的殼聚糖-石墨烯/玻碳電極浸在連接探針S2中，制得連接探針/殼聚糖-石墨烯/玻 碳電極，即 S2/CS-GR/GCE。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器的制備方法，其特 征在于，步驟（3)中所述清洗，是在二次水中清洗3?5分鐘，然后依次在乙醇和二次水中 超聲3?5分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器的制備方法，其特 征在于，步驟（4)中所述清洗，是分別在NaOH溶液和10mm〇l/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液 中。
8. 權(quán)利要求1制備的一種多重信號(hào)放大的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器。
9. 權(quán)利要求8所述的標(biāo)記電化學(xué)傳感器作為檢測器在檢測核酸中的應(yīng)用，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組含有不同濃度P53基因的pH為7. 4的Tris-HCl緩沖溶 液為標(biāo)準(zhǔn)液； (2) 建立工作曲線：將所述傳感器分別浸入標(biāo)準(zhǔn)溶液中40°C孵育80分鐘，孵育后用 Tris-HCl緩沖液沖洗，再將傳感器分別浸入NEBuffer 3、氯高血紅素、亞甲基藍(lán)溶液中，每 次浸入后均用Tris-HCl緩沖液沖洗，在10ml Tris-HCl、KC1和H202的混合溶液中進(jìn)行差 分脈沖伏安法（DPV)掃描，記錄響應(yīng)電流I，所述I值與標(biāo)準(zhǔn)溶液中p53基因濃度c的對(duì)數(shù) logc成正比，繪制I-log c標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用線性回歸法得到I-log c線性回歸方程； (3) p53基因含量測定：將待測樣品配制為含有步驟（1)相同濃度p53基因的Tris-HCl 緩沖溶液，按照與步驟（2)相同的方法對(duì)所述傳感器進(jìn)行孵育和進(jìn)一步反應(yīng)后進(jìn)行差分脈 沖伏安掃描，記錄響應(yīng)電流I ;根據(jù)響應(yīng)電流I和I-l〇g c線性回歸方程，得到p53基因含 量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的標(biāo)記電化學(xué)傳感器作為檢測器在檢測核酸中的應(yīng)用，其特 征在于，步驟（1)中所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為100mmol/L，步驟（2)中所用Tris-HCl 的濃度均為 10mm〇l/L，所述步驟（2)中 NEBuffer 3 含有 0. 5unit/yL N. BstNB I。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK104502437SQ201510009967
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月8日
【發(fā)明者】夏建飛, 張菲菲, 楊敏, 王宗花, 宋岱珉, 畢賽, 桂日軍, 李延輝, 夏延致 申請(qǐng)人:青島大學(xué)