本發(fā)明涉及SAA含量檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種一步均相SAA檢測(cè)試劑盒及其制備和使用方法。

背景技術(shù)：

血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A protein，SAA)是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，屬于載脂蛋白家族中的異質(zhì)類蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量約為12 000。SAA基因具有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)約3.20kb，與其他大多數(shù)載脂蛋白的基因一樣。目前已發(fā)現(xiàn)的4種人SAA基因均位于11號(hào)染色體上。SAA1和SAA2屬急性期基因，編碼急性期蛋白(A-SAA)；SAA3是假基因；SAA4是結(jié)構(gòu)基因，編碼結(jié)構(gòu)蛋白。SAA是一種高度特異性的蛋白質(zhì)，成熟SAA由104個(gè)氨基酸構(gòu)成，其N(xiāo)端的11個(gè)氨基酸是脂質(zhì)結(jié)合部位，其前端76個(gè)氨基酸被酶切后可成為淀粉樣蛋白A，而其第77～104位氨基酸是中性粒細(xì)胞結(jié)合區(qū)，有免疫相關(guān)的生物學(xué)功能。

在急性時(shí)相反應(yīng)中，經(jīng)白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)、SAA和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激，肝細(xì)胞可迅速合成SAA，濃度在4-6h內(nèi)達(dá)到峰值，從正常水平的1-5μg/ml升高到1000μg/ml，但半減期短，只有50min左右。PCT要在1-2d達(dá)到峰值、半減期長(zhǎng)；CRP要在2-3d達(dá)到峰值、增幅數(shù)至數(shù)百倍、半減期最長(zhǎng)。因此，在感染性疾病的最早期或急性期診斷中，無(wú)論是細(xì)菌、病毒還是真菌感染，SAA的靈敏度都要優(yōu)于PCT和CRP；尤其是對(duì)于病毒性感染的診斷和鑒別診斷來(lái)說(shuō)，SAA更具優(yōu)勢(shì)。

SAA在病毒和細(xì)菌感染中均升高，而病毒感染中CRP幾乎不升高或升高不明顯。對(duì)于微弱的炎癥刺激，SAA較CRP更靈敏。因此，在CRP正常的病毒感染患者、非侵襲性或早期侵襲性細(xì)菌感染患者中，SAA是一個(gè)較為有用的指標(biāo)。在小兒感染性疾病早期，由于小兒患者的體征和癥狀均不明確，很難鑒別是細(xì)菌感染還是病毒感染。所以早期快速地鑒別小兒患者細(xì)菌感染和病毒感染，對(duì)于及時(shí)有效地治療及各種并發(fā)癥的預(yù)防有著重要的意義。病毒感染時(shí)PCT水平稍增高，CRP幾乎不升高或升高不明顯，而SAA則明顯升高，且病毒感染組SAA/CRP比值明顯高于細(xì)菌感染組，提示病毒感染時(shí)，血清SAA變化較CRP、PCT更為敏感，因此血SAA水平和SAA/CRP比值可作為診斷病毒感染、鑒別細(xì)菌和病毒感染的敏感指標(biāo)。另外，SAA和CRP的比值與小兒感染性疾病的嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，監(jiān)測(cè)SAA/CRP比值比單獨(dú)檢測(cè)SAA或CRP具有更大的應(yīng)用價(jià)值。

目前用于檢測(cè)SAA的方法主要是放射性免疫檢測(cè)法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、乳膠免疫比濁法等。RIA有很高的檢測(cè)靈敏度，但由于標(biāo)記物具有放射性危害，標(biāo)記物穩(wěn)定性差，廢棄物難以處理等缺點(diǎn)，已逐漸退出臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域。ELISA法采用辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，并催化底物產(chǎn)生顏色變化，具有操作簡(jiǎn)單，試劑穩(wěn)定期長(zhǎng)的特點(diǎn)，但ELISA法的檢測(cè)靈敏度較低，線性范圍窄，目前主要應(yīng)用于傳染性疾病篩查等對(duì)檢測(cè)靈敏度要求較低的項(xiàng)目。乳膠免疫比濁法是利用抗原抗體反應(yīng)原理測(cè)定血清中SAA的含量，此方法無(wú)法兼顧靈敏度和線性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有SAA免疫檢測(cè)方法存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種可用于定量檢測(cè)的一步均相SAA檢測(cè)試劑盒；本發(fā)明還提供一種一步均相SAA檢測(cè)試劑盒的制備方法和使用方法。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述一種一步均相SAA檢測(cè)試劑盒，主要組成包括：抗SAA抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球、抗SAA抗體偶聯(lián)的感光微球、分析緩沖液、反應(yīng)孔。

所述發(fā)光微球表面活性基團(tuán)為醛基、羧基、氨基等，發(fā)光微球帶有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子，發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己烯)或Thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phen等，發(fā)光微球大小為100-300nm，該發(fā)光微球可由鉑金埃爾默公司購(gòu)得。

所述感光微球表面活性基團(tuán)為醛基、羧基、氨基等，感光微球帶有光激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧的染料，如酞箐染料、葉綠素等，感光微球大小為100-300nm，該感光微球可由鉑金埃爾默公司購(gòu)得。

進(jìn)一步地，所述抗SAA抗體(通過(guò)常規(guī)免疫學(xué)方法制備)為針對(duì)SAA不同表位的單克隆抗體或多克隆抗體。

進(jìn)一步地，所述反應(yīng)孔為微孔板、微流控試劑盤(pán)、反應(yīng)杯或反應(yīng)管。

本發(fā)明所述的一步均相SAA檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

(1)抗SAA抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備；

(2)抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球的制備；

(3)分析緩沖液的制備。

進(jìn)一步地，所述抗SAA抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備，包括如下步驟：

(1)將抗SAA抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液洗滌，備用；將發(fā)光微球，用HEPES緩沖液清洗，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；

(3)加入2.0-3.0μl 10％質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)；

(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反應(yīng)體系中；震蕩反應(yīng)0.5-1.5小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入150-250μl Tris-HCl緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，使用前稀釋至所需濃度。

進(jìn)一步地，所述抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球的制備，包括如下步驟：

(1)將抗SAA抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液洗滌，備用；將感光微球，用HEPES緩沖液清洗，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；

(3)加入2.0-3.0μl 10％質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)；

(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反應(yīng)體系中；震蕩反應(yīng)0.5-1.5小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入150-250μl Tris-HCl緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，使用前稀釋至所需濃度。

進(jìn)一步地，所述分析緩沖液的制備，包括如下步驟：將HEPES 0.1-2g、BSA0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸餾水溶解后，制成分析緩沖液。

進(jìn)一步地，步驟(1)中所述抗SAA抗體與發(fā)光微球與的質(zhì)量比為1：(1-100)。

進(jìn)一步地，步驟(1)所述抗SAA抗體與感光微球的質(zhì)量比為1：(1-100)。

進(jìn)一步地，使用分析緩沖液稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml；稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。

本發(fā)明所述的一步均相SAA檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

(1)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗SAA抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球和抗SAA抗體偶聯(lián)的感光微球，混合反應(yīng)5-60分鐘；

(2)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值；

(3)繪制SAA濃度與光信號(hào)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用步驟(2)測(cè)得的光信號(hào)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SAA含量。

有益效果：由現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的一步均相SAA檢測(cè)試劑盒具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明所得試劑盒能利用SAA的抗體，以氧通道化學(xué)發(fā)光技術(shù)為平臺(tái)，針對(duì)炎癥診斷的SAA快速檢測(cè)，本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)快速準(zhǔn)確、范圍寬、靈敏度高、特異性好、重復(fù)性好、免清洗；同時(shí)本發(fā)明的試劑盒的制備方法簡(jiǎn)單，無(wú)污染，并且試劑盒使用方法操作簡(jiǎn)單，將其應(yīng)用于感染的監(jiān)測(cè)，可以提高炎癥診斷的準(zhǔn)確率，便于臨床檢測(cè)使用，具有極大的市場(chǎng)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例3提供的SAA檢測(cè)試劑盒原理示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例3提供的SAA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線性范圍圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3試劑盒與西門(mén)子SAA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性比較圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

抗SAA抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備：

(1)將0.1mg抗SAA單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到1mg/ml備用。將0.1mg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；

(3)加入2.0μl 10％Tween 20，8μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，37℃震蕩反應(yīng)24小時(shí)；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加8μl溶液到反應(yīng)體系中；37℃震蕩反應(yīng)0.5小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入150μl Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。

抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球的制備：

(1)將0.1mg抗SAA單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到1mg/ml備用。將0.1mg感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；

(3)加入2.0μl 10％Tween 20，8μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，37℃震蕩反應(yīng)24小時(shí)；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加8μl溶液到反應(yīng)體系中；37℃震蕩反應(yīng)0.5小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入150μl Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。

分析緩沖液的制備：將HEPES 0.1g、BSA 0.1g、Casein 0.1g、NaCl 0.5g、Triton X-100 0.01ml加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4，水補(bǔ)足到100ml，制成分析緩沖液。

使用分析緩沖液稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml；稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。

上述抗SAA抗體偶聯(lián)發(fā)光微球、抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球、分析緩沖液再加入微孔板組成本發(fā)明所述的試劑盒。

實(shí)施例2

抗SAA抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備：

(1)將0.1mg抗SAA多克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到1mg/ml備用。將10mg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；

(3)加入3μl 10％Tween 20，12μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，37℃震蕩反應(yīng)48小時(shí)；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加12μl溶液到反應(yīng)體系中；37℃震蕩反應(yīng)1.5小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入250μl Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。

抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球的制備：

(1)將0.1mg抗SAA多克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到1mg/ml備用。將10mg感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；

(3)加入3μl 10％Tween 20，12μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，37℃震蕩反應(yīng)48小時(shí)；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加12μl溶液到反應(yīng)體系中；37℃震蕩反應(yīng)1.5小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入250μl Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。

分析緩沖液的制備：將HEPES 2g、BSA 5g、Casein 5g、NaCl 3g、Triton X-100 1ml加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4，水補(bǔ)足到100ml，制成分析緩沖液。

使用分析緩沖液稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml；稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。

上述抗SAA抗體偶聯(lián)發(fā)光微球、抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球、分析緩沖液再加入微流控試劑盤(pán)組成本發(fā)明所述的試劑盒。

實(shí)施例3

(1)將0.1mg抗SAA單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到1mg/ml備用。將1mg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；

(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，37℃震蕩反應(yīng)36小時(shí)；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反應(yīng)體系中；37℃震蕩反應(yīng)1小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。

抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球的制備：

(1)將0.1mg抗SAA單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到1mg/ml備用。將1mg感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；

(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，37℃震蕩反應(yīng)36小時(shí)；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反應(yīng)體系中；37℃震蕩反應(yīng)1小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。

分析緩沖液的制備：將HEPES 1.0g、BSA2.5g、Casein 2.5g、NaCl 1.75g、Triton X-100 0.5ml加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4，水補(bǔ)足到100ml，制成分析緩沖液。

使用分析緩沖液稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml；稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。

上述抗SAA抗體偶聯(lián)發(fā)光微球、抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球、分析緩沖液再加入反應(yīng)杯組成本發(fā)明所述的試劑盒。

實(shí)施例4

抗SAA抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備：

(1)將0.1mg抗SAA單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到1mg/ml備用。將5mg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；

(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，37℃震蕩反應(yīng)36小時(shí)；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反應(yīng)體系中；37℃震蕩反應(yīng)1小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。

抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球的制備：

(1)將0.1mg抗SAA單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到1mg/ml備用。將5mg感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；

(2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；

(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μl，37℃震蕩反應(yīng)36小時(shí)；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反應(yīng)體系中；37℃震蕩反應(yīng)1小時(shí)，離心，去除上清；

(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；

(6)最后一次離心后用PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。

分析緩沖液的制備：將HEPES 1.0g、BSA2.5g、Casein 2.5g、NaCl 1.75g、Triton X-100 0.5ml加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4，水補(bǔ)足到100ml，制成分析緩沖液。

使用分析緩沖液稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml；稀釋抗SAA抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。

上述抗SAA抗體偶聯(lián)發(fā)光微球、抗SAA抗體偶聯(lián)感光微球、分析緩沖液再加入反應(yīng)管組成本發(fā)明所述的試劑盒。

實(shí)施例5

試劑盒的使用方法：

(1)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗SAA抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球和抗SAA抗體偶聯(lián)的感光微球，混合反應(yīng)5-60分鐘；

(2)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值；

(3)繪制SAA濃度與光信號(hào)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用步驟(2)測(cè)得的光信號(hào)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SAA含量。

試驗(yàn)例6

本發(fā)明試劑盒方法學(xué)評(píng)價(jià)：

1、線性

配制濃度為0μg/ml，2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，的血清淀粉樣蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在反應(yīng)孔中分別加入5μl標(biāo)準(zhǔn)品，加入20μl偶聯(lián)血清淀粉樣蛋白A抗體的發(fā)光微球(終濃度10μg/ml)，加入20μl偶聯(lián)血清淀粉樣蛋白A抗體的感光微球(終濃度10μg/ml)，室溫暗處溫育15分鐘。溫育后，激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值。

如上用本發(fā)明實(shí)施例3所制備的SAA檢測(cè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，繪制各檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(見(jiàn)附圖2)。從附圖2可以看出本發(fā)明所制備的檢測(cè)試劑盒能保持良好的線性，血清淀粉樣蛋白A濃度為200μg/ml時(shí)方法無(wú)Hook效應(yīng)。

2、準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確性測(cè)量是指用已知量血清淀粉樣蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品加入到正常人的血清標(biāo)本中，測(cè)量加入后濃度值與加入的理論值進(jìn)行比較，計(jì)算血清淀粉樣蛋白A的回收率。檢測(cè)結(jié)果如下：

3、精密度

選取3份不同濃度的標(biāo)本，分別按照本發(fā)明所述的方法重復(fù)測(cè)量20次。根據(jù)20次的測(cè)量結(jié)果，計(jì)算平均偏差C.V.％值。

4、分析靈敏度

分析靈敏度的定義為：是指在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上能與零劑量區(qū)別的量。重復(fù)20次測(cè)量零劑量點(diǎn)，計(jì)算其平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以X+2SD的計(jì)算的濃度值即為該試劑盒的分析靈敏度。本發(fā)明試劑盒的分析靈敏度為2pg/ml。

5、特異性

檢測(cè)本發(fā)明的氧通道化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑在干擾性物質(zhì)(溶血、高血脂、高膽紅素)存在的情況下檢測(cè)標(biāo)本的準(zhǔn)確性。將血紅蛋白溶液(5mg/ml)分別取適量加入到1ml的血清淀粉樣蛋白A陽(yáng)性血清標(biāo)本中，使血清中血紅蛋白的含量分別為1mg/ml、0.5mg/ml。將甘油三酯溶液(5mg/ml)分別取適量加入到1ml的血清淀粉樣蛋白A陽(yáng)性血清標(biāo)本中，使血清中甘油三酯的含量分別為1mg/mL、0.5mg/ml。將膽紅素溶液(5mg/ml)分別取適量加入到1ml的血清淀粉樣蛋白A陽(yáng)性血清標(biāo)本中，使血清中膽紅素的含量分別為50μg/ml、25μg/ml。對(duì)加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的血清淀粉樣蛋白A陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，在反應(yīng)孔中每孔分別加入5μl含加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的血清淀粉樣蛋白A陽(yáng)性標(biāo)本，加入20μl偶聯(lián)抗血清淀粉樣蛋白A抗體的發(fā)光微球(終濃度10μg/ml)，加入20μl偶聯(lián)血清淀粉樣蛋白A抗體的感光微球(終濃度10μg/ml)，室溫暗處溫育15分鐘。溫育后，激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值。將理論濃度與實(shí)測(cè)濃度的比值作為回收率，回收率在96.36％-106.01％之間。表明血清淀粉樣蛋白A氧通道化學(xué)發(fā)光試劑在檢測(cè)血清樣本時(shí)不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。

6、相關(guān)性

如圖3所示，與西門(mén)子血清淀粉樣蛋白A化學(xué)發(fā)光試劑盒的相關(guān)性為：y＝0.9976x-0.0597，R²＝0.9961

本發(fā)明與現(xiàn)有方法和產(chǎn)品相比，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性好、成本較低，對(duì)檢測(cè)儀器要求低的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的原理(見(jiàn)附圖1)是通過(guò)在均相條件下將偶聯(lián)了抗血清淀粉樣蛋白A抗體的帶有酞菁染料的感光微球1，包被有二甲基噻吩、蒽等活性分子且?guī)в袖B螯合物、偶聯(lián)了抗血清淀粉樣蛋白A抗體的發(fā)光微球2混合。此時(shí)偶聯(lián)了抗血清淀粉樣蛋白A抗體感光微球1和偶聯(lián)了抗血清淀粉樣蛋白A抗體的發(fā)光微球2迅速有效地識(shí)別檢測(cè)樣本3的目標(biāo)分子而形成免疫夾心復(fù)合物。在激光(波長(zhǎng)為680nm)的照射下，感光微球上的光敏劑將周?chē)h(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活躍的單線態(tài)氧。單線態(tài)氧擴(kuò)散至發(fā)光微球，與其上的化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，進(jìn)一步激活了同樣在發(fā)光微球上的熒光基團(tuán)，使之發(fā)出熒光，波長(zhǎng)為615nm。單線態(tài)氧的半衰期為4μs，在溶液中的擴(kuò)散距離為200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，單線態(tài)氧無(wú)法擴(kuò)散到發(fā)光微球，則不會(huì)有熒光信號(hào)產(chǎn)生。

以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本材料的技術(shù)實(shí)施方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。