本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以HOXB9和PBX1作為生物標(biāo)志物的胃癌檢測試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率占全球每年新發(fā)腫瘤第四位，死亡率高居第二位。胃癌診斷和治療方案的制定有賴于病理和分子病理診斷結(jié)果。分子病理可借助免疫組化檢測技術(shù)，為胃癌的診斷、鑒別診斷、分型分期、化療、靶向治療和預(yù)后提供依據(jù)。免疫組化技術(shù)是利用標(biāo)記的特異性抗體對組織細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原的表達量和分布進行原位檢測的技術(shù)。目前，已知有10多種胃癌相關(guān)標(biāo)志物免疫組化指標(biāo)應(yīng)用于臨床。

由于胃癌的發(fā)病機制不明，現(xiàn)有的胃癌相關(guān)標(biāo)志物臨床判斷胃癌的生長及預(yù)后效果欠佳。每個胃癌標(biāo)志物檢測需要至少一張切片，對組織消耗量大，無法判斷標(biāo)志物間彼此相關(guān)性，準(zhǔn)確度不高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供HOXB9和PBX1聯(lián)合作為胃癌生物標(biāo)志物在制備或篩選胃癌檢測試劑中的用途。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種以HOXB9和PBX1聯(lián)合作為生物標(biāo)志物的胃癌檢測試劑盒。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測胃癌的方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明的第一方面，提供了HOXB9和PBX1聯(lián)合作為胃癌生物標(biāo)志物在制備或篩選胃癌檢測試劑中的用途。

優(yōu)選地，所述HOXB9和PBX1聯(lián)合作為胃癌組織生物標(biāo)志物。

優(yōu)選地，所述胃癌檢測試劑以HOXB9和PBX1聯(lián)合作為檢測對象。

優(yōu)選地，所述胃癌檢測試劑中，含有HOXB9和PBX1聯(lián)合作為標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對照。

所述標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對照，用于檢測樣本組織中的HOXB9和PBX1含量。

將HOXB9和PBX1聯(lián)合作為胃癌生物標(biāo)志物用于篩選胃癌檢測試劑，是指將HOXB9與PBX1作為靶標(biāo)應(yīng)用于胃癌檢測試劑的篩選。在一優(yōu)選例中，基于所述的HOXB9與PBX1，篩選特異性識別HOXB9的試劑和特異性識別PBX1的試劑，從而作為檢測胃癌的試劑，來檢測樣本組織中的HOXB9與PBX1水平。

在一優(yōu)選例中，基于所述的HOXB9與PBX1，篩選特異性識別HOXB9的抗體和特異性識別PBX1的抗體，從而作為從而作為檢測胃癌的試劑。

優(yōu)選地，所述胃癌檢測試劑中，含有特異性識別HOXB9的試劑和特異性識別PBX1的試劑。

優(yōu)選地，所述胃癌檢測試劑用于胃癌的判斷、治療方案的選擇、和/或預(yù)后評估。

本發(fā)明的第二方面，提供了特異性識別HOXB9的試劑和特異性識別PBX1的試劑在制備胃癌檢測試劑盒中的用途。

在一優(yōu)選例中，特異性識別HOXB9的試劑選自特異性識別HOXB9的抗體。特異性識別PBX1的試劑選自特異性識別PBX1的抗體。

所述抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。

本發(fā)明的第三方面，提供一種胃癌檢測試劑盒，包括特異性識別HOXB9的試劑和特異性識別PBX1的試劑。

優(yōu)選地，所述胃癌檢測試劑盒以HOXB9和PBX1作為胃癌生物標(biāo)志物。

優(yōu)選地，所述胃癌檢測試劑盒以HOXB9和PBX1作為檢測對象。

在一優(yōu)選例中，特異性識別HOXB9的試劑選自特異性識別HOXB9的抗體。特異性識別PBX1的試劑選自特異性識別PBX1的抗體。

所述抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。

在一優(yōu)選例中，特異性識別HOXB9的抗體包括用于檢測HOXB9的第一抗體和用于檢測所述第一抗體的第二抗體。特異性識別PBX1的抗體包括用于檢測PBX1的第一抗體和和用于檢測所述第一抗體的第二抗體。

進一步地，所述第二抗體為熒光分子標(biāo)記的第二抗體。

在一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括免疫熒光染色技術(shù)常用的試劑，免疫熒光染色技術(shù)常用的試劑包括：福爾馬林固定液、石蠟、二甲苯、檸檬酸鈉、封閉液中的一種或多種。

在一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括陽性對照、陰性對照。所述陽性對照包括HOXB9和PBX1。所述陰性對照包括ddH₂O。

優(yōu)選地，所述胃癌檢測試劑盒用于胃癌的判斷、治療方案的選擇、和/或預(yù)后評估。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測胃癌的方法，包括檢測樣本組織中HOXB9和PBX1的水平。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明基于發(fā)明人研究成果，通過檢測兩個新發(fā)現(xiàn)且彼此關(guān)聯(lián)的胃癌標(biāo)志物，更準(zhǔn)確的判斷胃癌的生長及預(yù)后；通過免疫熒光雙染法，精確判斷標(biāo)志物間彼此關(guān)系，節(jié)約組織消耗量。HOXB9和PBX1同時作為新的胃癌標(biāo)志物，可為胃癌的分子病理診斷提供依據(jù)。在胃癌組織細(xì)胞原位同時觀察胃癌標(biāo)志物HOXB9和PBX1的表達，易于觀察評價兩者之間的相關(guān)性。一張切片上同時檢測兩個相關(guān)的胃癌標(biāo)志物，有助于節(jié)約標(biāo)本用量，可應(yīng)用于胃鏡等取材較少的檢測。

采用本發(fā)明的檢測試劑盒對組織樣本中的HOXB9和PBX1進行聯(lián)合檢測，從而診斷和檢測胃癌，檢測結(jié)果靈敏度好，特異性高?？捎行в糜谖赴┑脑缙诤Y查和/或預(yù)后評估，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：左圖表示HOXB9在正常組織中高表達，右圖表示HOXB9在胃癌組織中低表達。

圖2：左圖表示PBX1在正常組織中低表達，右圖表示PBX1在胃癌組織中高表達。

圖3：HOXB9和PBX1的表達在胃癌組織中的相關(guān)性。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECμLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECμLAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECμLAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

術(shù)語、縮略語

qRT-PCR：quantitative real-time polymerase chain reaction，實時熒光定量PCR

靈敏度：即真陽性率，真陽性與真陽性+假陰性的比例。

特異性：即真陰性率，真陰性與真陰性+假陽性的比例。

實施例1.通過免疫熒光雙染法對胃癌組織內(nèi)HOXB9和PBX1的表達水平和部位進行檢測

一、本實施例通過免疫熒光雙染法對胃癌組織內(nèi)HOXB9和PBX1的表達水平和部位進行檢測，步驟如下：

(1)胃鏡取材或手術(shù)切除胃癌組織，常規(guī)10％福爾馬林固定，石蠟包埋，5mm切片。

(2)烤片：60攝氏度，1小時。

(3)脫臘：二甲苯溶液I中15分鐘，二甲苯溶液II中15分鐘，無水乙醇I中5分鐘，無水乙醇II中5分鐘，90％乙醇I中5分鐘，90％乙醇II中5分鐘，70％乙醇中5分鐘，雙蒸水洗2次。

(4)抗原修復(fù)：高壓修復(fù)法，加入0.01mol/L檸檬酸鈉(Ph 6.0)，加熱10分鐘后緩慢冷卻至室溫。

(5)封閉：加10％正常驢血清，室溫孵育封閉30分鐘。

(6)加一抗：滴加含小鼠抗HOXB9和大鼠抗PBX1的一抗抗體，4度孵育過夜，PBS震蕩洗滌3遍。

(7)加二抗：滴加FITC和APC標(biāo)記的兔血清來源的二抗，室溫孵育1小時，PBS震蕩洗滌3遍。

(8)將蓋玻片放于紙巾上，滴加Gelvatol一滴于蓋玻片中央。翻過載玻片于蓋玻片上，用鋁箔避光放置30分鐘。

(9)顯微鏡下觀察。

二、本實施例首次發(fā)現(xiàn)：在胃癌組織中，HOXB9和PBX1的表達水平與胃癌生長和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；HOXB9和PBX1之間有負(fù)相關(guān)性：

(1)如表1和圖1所示，HOXB9在正常胃粘膜組織中表達較高，而胃癌組織中表達水平降低。

表1：HOXB9表達水平降低可導(dǎo)致胃癌生長及淋巴轉(zhuǎn)移密切

(2)如圖2和表2所示，PBX1在正常胃粘膜組織中表達較低，而胃癌組織中表達水平升高：

表2：PBX1表達水平升高可導(dǎo)致胃癌生長及淋巴轉(zhuǎn)移密切

(3)如圖3所示，HOXB9和PBX1的表達在胃癌組織中的相關(guān)性：HOXB9表達降低時，PBX1的表達水平會升高，兩者之間為負(fù)相關(guān)性。

實施例2.以HOXB9和PBX1作為生物標(biāo)志物的胃癌檢測試劑盒的構(gòu)建及應(yīng)用

本實施例構(gòu)建以HOXB9和PBX1作為生物標(biāo)志物的胃癌檢測試劑盒，所述試劑盒包括：用于檢測HOXB9的試劑和用于檢測PBX1的試劑。用于檢測HOXB9的試劑包括用于檢測HOXB9的第一抗體和用于檢測所述第一抗體的第二抗體。用于檢測PBX1的試劑包括用于檢測PBX1的第一抗體和用于檢測所述第一抗體的第二抗體。

具體地，本實施例的胃癌檢測試劑盒通過免疫熒光雙染法對胃癌組織內(nèi)HOXB9和PBX1的表達水平進行檢測。用于檢測HOXB9的第一抗體采用小鼠源HOXB9抗體，用于檢測所述第一抗體的第二抗體采用FITC標(biāo)記的兔源抗體。用于檢測PBX1的第一抗體采用大鼠源PBX1抗體，用于檢測所述第一抗體的第二抗體采用APC標(biāo)記的兔源抗體。

采用構(gòu)建好的以HOXB9和PBX1作為生物標(biāo)志物的胃癌檢測試劑盒，參照實施例1的方法，檢測100個臨床樣本，以判斷是否為胃癌樣本以及是否有淋巴轉(zhuǎn)移。

以樣本中：HOXB9表達量和PBX1表達量的比值作為診斷指標(biāo)，當(dāng)HOXB9表達量和PBX1表達量的比值<1(熒光信號以PBX1占主導(dǎo))算為胃癌陽性樣本；當(dāng)HOXB9表達量和PBX1表達量的比值>1(熒光信號以HOXB9占主導(dǎo))作為胃癌陰性樣本。

其中，43個樣本算為胃癌陽性樣本；57個樣本算為陰性樣本。

本實例首次發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中同時檢測HOXB9和PBX1，并以HOXB9表達量和PBX1表達量的比值作為診斷指標(biāo)，在沒有明顯降低靈敏度的同時顯著增加了特異性，見表3：

表3：HOXB9和PBX1三種檢測方式靈敏度和特異性的比較

綜上所述，采用本發(fā)明的檢測試劑盒對組織樣本中的HOXB9和PBX1進行聯(lián)合檢測，從而診斷和檢測胃癌，檢測結(jié)果靈敏度好，特異性高?？捎行в糜谖赴┑脑缙诤Y查和/或預(yù)后評估，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

以上的實施例是為了說明本發(fā)明公開的實施方案，并不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了具體的描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說顯而易見的修改來獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。