本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201及其T細(xì)胞表位肽在結(jié)核病檢測(cè)試劑、疫苗和藥物制備中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，調(diào)查結(jié)果顯示全世界有三分之一的人口處于潛伏感染，且有5％～10％在未來(lái)的生活中將可能發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。自1993年世界衛(wèi)生組織宣布結(jié)核病成為全球危機(jī)后，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，據(jù)WHO報(bào)告，每年新增結(jié)核病人約800萬(wàn)，每年約有200～300萬(wàn)人死于結(jié)核病。我國(guó)在22個(gè)結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家中位居第2位，全國(guó)第5次流行病學(xué)抽樣檢查結(jié)果顯示：全國(guó)130萬(wàn)人發(fā)病，占全球發(fā)病率的14.3％，我國(guó)也是全球27個(gè)耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，耐多藥結(jié)核病患病人數(shù)占據(jù)全球第一。每個(gè)未經(jīng)治療的活動(dòng)性肺結(jié)核病人能夠傳染10～15人。結(jié)核病已經(jīng)成為全球重要的衛(wèi)生問(wèn)題，需引起人們的高度重視。結(jié)核的早期診斷和預(yù)防治療對(duì)結(jié)核病的控制至關(guān)重要，臨床上常用的是細(xì)菌學(xué)方法痰涂片鏡檢和痰培養(yǎng)，痰涂片鏡檢是世界范圍內(nèi)結(jié)核病檢查中使用最廣泛的技術(shù)，由于此法設(shè)備簡(jiǎn)便，適合在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的地區(qū)使用。但是由于對(duì)樣本中的菌含量要求高，因此該方法靈敏度不高，導(dǎo)致大量涂陰患者不被發(fā)現(xiàn)從而轉(zhuǎn)陽(yáng)，且涂陰患者具有傳染性，不容忽視，該方法無(wú)種特異性，靈敏度差，受痰液標(biāo)本和病情的影響。痰培養(yǎng)作為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，現(xiàn)在已有BACTECMGIT960系統(tǒng)等快速培養(yǎng)系統(tǒng)可在2周內(nèi)分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，但由于其配制的培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)添加劑、雜菌抑制劑價(jià)格昂貴，無(wú)法在發(fā)展中國(guó)家廣泛推廣，并且快速培養(yǎng)與改良L-J培養(yǎng)相比污染率顯著增高，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。常用的用于人群篩查的檢測(cè)方法是皮膚結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)，使用的是結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有許多分枝桿菌種類(致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD診斷結(jié)核病的特異性較差，不能有效區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與卡介苗接種，結(jié)核的影像學(xué)檢查如常規(guī)的X線檢查、CT檢查、MRI檢查、超聲檢查等價(jià)格昂貴，且對(duì)身體造成一定傷害，特異性低，不適合用于常規(guī)的檢查診斷。結(jié)核分枝桿菌侵入人體后寄居在巨噬細(xì)胞內(nèi)，人體對(duì)結(jié)核分枝桿菌主要的免疫反應(yīng)是細(xì)胞免疫應(yīng)答，主要參與的細(xì)胞是CD4+和CD8+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可以通過(guò)穿孔素、顆粒酶等途徑將被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞殺死從而達(dá)到清除結(jié)核分枝桿菌的目的。感染結(jié)核分枝桿菌的人再次接觸結(jié)核分枝桿菌特異性抗原時(shí)，T淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生IFN-γ，通過(guò)單克隆抗體檢測(cè)出IFN-γ即可確定曾經(jīng)或正在感染結(jié)核分枝桿菌。目前以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法T-SPOT是利用IFN-γ特異性抗體捕獲經(jīng)結(jié)核抗原刺激的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后產(chǎn)生的IFN-γ，并以酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)顯色的方式表現(xiàn)出來(lái)，從斑點(diǎn)的數(shù)量來(lái)確定細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，從單細(xì)胞水平評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能。以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外γ干擾素的檢測(cè)被用于結(jié)核病的輔助診斷，該檢測(cè)方法不僅能篩選出活動(dòng)性結(jié)核病人，同時(shí)也能檢測(cè)出潛伏期病人，從而能更好的預(yù)防和控制潛伏期結(jié)核，目前已有以結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)編碼的結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽為刺激物的商品化的IGRA檢測(cè)試劑盒，如QuantiFERON-TBGoldtest和T-SPOT，均呈現(xiàn)較高的靈敏性和特異性。Rv2201(GI:15609338)是H37Rv基因組上的天冬酰胺合成酶基因，基因全長(zhǎng)1959bp，編碼含有652個(gè)氨基酸的蛋白，主要參與天冬酰胺的合成過(guò)程，Rv2201是一種分泌蛋白，能夠在細(xì)胞上清中檢測(cè)出來(lái)，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)Rv2201蛋白存在較多的T細(xì)胞表位，具有潛在的診斷效能。本發(fā)明建立在反向疫苗學(xué)的基礎(chǔ)上，利用計(jì)算機(jī)篩選出結(jié)核分枝桿菌可能的免疫原性抗原庫(kù)，然后利用生物信息學(xué)軟件TEpredict和IEDB預(yù)測(cè)結(jié)核抗原MHC-I類T細(xì)胞表位，通過(guò)固態(tài)合成法合成這些多肽，先利用人群免疫篩選試驗(yàn)對(duì)結(jié)核新抗原進(jìn)行篩選，篩選出免疫優(yōu)勢(shì)抗原之后，再通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其免疫原性進(jìn)行驗(yàn)證，最后經(jīng)驗(yàn)證得到的免疫優(yōu)勢(shì)抗原可一方面用于結(jié)核診斷，另一方面可用于卡介苗的改造。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201T細(xì)胞表位肽及其應(yīng)用。本發(fā)明基于以下構(gòu)思：Rv2201是結(jié)核分枝桿菌上的保守膜蛋白，是可在H37Rv培養(yǎng)上清中檢測(cè)出來(lái)的分泌蛋白，主要參與天冬酰胺的合成，Rv2201只在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中存在。本發(fā)明基于T細(xì)胞IFN-γ釋放技術(shù)，利用生物信息學(xué)軟件TEpredict和IEDB對(duì)Rv2201編碼基因上T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用固態(tài)合成法合成表位多肽，再通過(guò)T-SPOT法(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn))對(duì)結(jié)核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內(nèi)的特異性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，從而評(píng)價(jià)該抗原用于結(jié)核檢測(cè)的靈敏度和特異性，同時(shí)通過(guò)人群免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選出Rv2201抗原蛋白上的免疫優(yōu)勢(shì)表位肽，再通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，確定免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位肽的免疫原性。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201在制備結(jié)核檢測(cè)試劑、疫苗和藥物中的應(yīng)用；其中，所述抗原蛋白R(shí)v2201的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201T細(xì)胞表位肽，所述表位肽選自P136和P137，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1-2所示。本發(fā)明還提供由所述T細(xì)胞表位肽衍生的表位肽或其類似物。本發(fā)明還提供編碼所述表位肽的DNA分子。本發(fā)明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的表達(dá)盒及表達(dá)載體。本發(fā)明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白。本發(fā)明還提供所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白在制備結(jié)核檢測(cè)試劑、疫苗和藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種結(jié)核診斷試劑，所述診斷試劑中含有結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201，或編碼所述抗原蛋白R(shí)v2201的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。本發(fā)明還提供含有上述診斷試劑的結(jié)核T-SPOT檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒還包括以下材料或試劑：①一抗：抗人或動(dòng)物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。②酶標(biāo)試劑：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人或動(dòng)物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應(yīng)板，陽(yáng)性對(duì)照孔中含有結(jié)核非特異性刺激抗原(如PHA等)，陰性對(duì)照孔含有PBS或基底液。④其他T-SPOT檢測(cè)所需的試劑及耗材。優(yōu)選地，一抗固定在上述微孔反應(yīng)板上。本發(fā)明是基于雙抗體夾心原理，采用T-SPOT法檢測(cè)抗原，實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結(jié)合細(xì)胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標(biāo)二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識(shí)別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。本發(fā)明還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201和/或所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白在制備結(jié)核疫苗和抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種結(jié)核疫苗，其有效成分為結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201，或編碼所述抗原蛋白R(shí)v2201的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。發(fā)明還提供一種抗結(jié)核藥物，其有效成分包括以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201和/或所述表位肽作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備的多克隆抗體，或者以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201和/或所述表位肽作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用雜交瘤技術(shù)和DNA重組技術(shù)，制備的識(shí)別所述結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201及其T細(xì)胞表位肽抗原的人源化單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201和/或所述表位肽及其衍生的表位肽或其類似物在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。其是將人或動(dòng)物的淋巴細(xì)胞經(jīng)所述表位肽及其衍生的表位肽或其類似物抗原或它們的組合物刺激后，檢測(cè)T細(xì)胞或B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。其中，結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括：γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括抗體。針對(duì)結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫膠體金試驗(yàn)、細(xì)胞因子內(nèi)染色和T細(xì)胞增殖試驗(yàn)等。B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。所述淋巴細(xì)胞來(lái)自人或動(dòng)物的外周血、靜脈血、腦脊液、胸腔積液或胸水等。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(一)本發(fā)明利用結(jié)核分枝桿菌Rv2201蛋白抗原及其T細(xì)胞表位肽作為刺激物用于結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)，與以往采用完全抗原相比，能夠降低由于抗原不純?cè)斐傻募訇?yáng)性。(二)研究證明，本發(fā)明提供的抗原表位均能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此當(dāng)使用上述表位作為刺激物進(jìn)行體外T細(xì)胞γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)時(shí)，靈敏度顯著提高。(三)采用固相合成的方法合成表位多肽，有利于質(zhì)量控制，且成本較低，純度高，適合大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例1結(jié)核分枝桿菌抗原基因Rv2201的克隆及蛋白的表達(dá)純化Rv2201(GI：15609338)是結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組編碼的保守膜蛋白，含652個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。根據(jù)其編碼基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌)表達(dá)并純化獲得抗原蛋白R(shí)v2201。實(shí)施例2結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201T細(xì)胞表位肽的合成基于T細(xì)胞IFN-γ釋放技術(shù)，利用生物信息學(xué)軟件TEpredict和IEDB對(duì)Rv2201編碼基因上T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用固態(tài)合成法合成表位多肽，再通過(guò)T-SPOT法對(duì)結(jié)核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內(nèi)的特異性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，從而評(píng)價(jià)該抗原用于結(jié)核檢測(cè)的靈敏度和特異性。本實(shí)施例提供的結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2201T細(xì)胞表位肽選自P136和P137，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1-2所示。實(shí)施例3結(jié)核T-SPOT檢測(cè)試劑盒的制備所述試劑盒基本組成如下：①實(shí)施例1制備的蛋白抗原Rv2201和/或?qū)嵤├?合成的表位肽抗原：所述表位肽選自P136和P137中的至少一種。②一抗：抗人或動(dòng)物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。酶標(biāo)試劑：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人或動(dòng)物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應(yīng)板，陽(yáng)性對(duì)照孔中含有結(jié)核非特異性刺激抗原(如PHA等)，陰性對(duì)照孔含有PBS或基底液。④其他T-SPOT檢測(cè)所需的試劑及耗材。將一抗固定在上述微孔反應(yīng)板上。該試劑盒是基于雙抗體夾心原理設(shè)計(jì)的，采用T-SPOT法檢測(cè)抗原，實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結(jié)合細(xì)胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標(biāo)二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識(shí)別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。實(shí)施例4抗原表位肽用于結(jié)核感染的臨床檢測(cè)1.外周血淋巴細(xì)胞的分離1.1受試對(duì)象①志愿者病例的篩選標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)癥狀、體征及胸部影像學(xué)檢查診斷為肺結(jié)核的，且痰培養(yǎng)為陽(yáng)性的肺結(jié)核患者。②肺部疾病患者的篩選標(biāo)準(zhǔn)：痰培養(yǎng)和痰涂片為陰性的肺部其他疾病，如塵肺、慢阻肺等肺部疾病患者。③健康志愿者的篩選標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)結(jié)核臨床癥狀、無(wú)結(jié)核病人密切接觸史、無(wú)其他疾病或感染。入選的結(jié)核病患者和志愿者年齡在15-80歲之間，從到結(jié)核病室就診的連續(xù)時(shí)間樣本中隨機(jī)選取。共采集了50例結(jié)核病志愿者、40例肺部疾病患者及55例健康志愿者血液樣本，采血時(shí)使用無(wú)內(nèi)毒素的肝素抗凝真空采血管采集外周靜脈血，每名志愿者采血約5ml～10ml。1)樣品于4小時(shí)內(nèi)用Ficoll-Hypaque分離液分離PBMCs。2)先將全血用RPMI-1640培養(yǎng)基1:1稀釋混勻，在離心管中加入一定體積的分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方，保持兩液面界面清晰，分離液、抗凝未經(jīng)稀釋全血、RPMI1640培養(yǎng)基體積為1:1:1，室溫(18～26℃)，800g離心20分鐘。3)離心結(jié)束后，管底是紅細(xì)胞，中間層是分離液，最上層是血漿層，血漿層與分離液層之間是白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)層。用吸管吸取白色云霧狀細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至15ml無(wú)菌離心管中，加入RPMI1640培養(yǎng)基至10ml，室溫下800g離心10分鐘。4)棄去上清，重懸后加入7mlRPMI1640培養(yǎng)基，700g離心10分鐘。5)棄去上清加0.5mlAIM-V培養(yǎng)基重懸沉淀。6)利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，用AIM-V培養(yǎng)基配制500μL細(xì)胞濃度為2.5×106/ml的細(xì)胞懸液。2.抗原表位肽的準(zhǔn)備將實(shí)施例2中固相合成法合成的抗原表位肽用DMSO溶解，各條表位肽分別用含10％胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋至一定濃度后使用。3.T-SPOT檢測(cè)抗原表位肽特異性T細(xì)胞采用實(shí)施例3的試劑盒，向預(yù)包被一抗的微孔板中加入以下試劑，每個(gè)病人分別設(shè)4個(gè)檢測(cè)孔：陽(yáng)性對(duì)照孔(加100μL濃度為15μg/ml的植物血凝素PHA作為陽(yáng)性刺激物)、陰性對(duì)照孔(加100μLPBS作為陰性對(duì)照)、2個(gè)檢測(cè)孔(兩個(gè)孔中分別加入100μL濃度為20μg/ml的多肽P136、P137)，每個(gè)孔中加入100μL上述稀釋好的PBMC，使每孔中PBMC的數(shù)量達(dá)25萬(wàn)個(gè)，將抗原與PBMC細(xì)胞置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)。4.洗板及結(jié)果判定洗去PBMC細(xì)胞和抗原刺激物，加100μL一抗室溫下孵育1小時(shí)，用PBS洗5遍，加二抗室溫孵育1小時(shí)，再用PBS洗5遍，加底物避光顯色7分鐘后，用純化水終止顯色，將培養(yǎng)板放在通風(fēng)口處晾干觀察板上的斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果判定(表1)：空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＝N、檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)＝T、陽(yáng)性質(zhì)控孔斑點(diǎn)數(shù)＝P。表1T-SPOT結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)其中兩條表位肽檢測(cè)50例結(jié)核病人、40例肺部其他疾病患者和55個(gè)健康人的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2。表2Rv2201蛋白抗原兩條表位肽檢測(cè)靈敏度和特異度統(tǒng)計(jì)表位肽靈敏度(％)特異度(％)P13628100P1376100兩條多肽聯(lián)合32100檢測(cè)靈敏度＝(結(jié)核病患者檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)/結(jié)核病患者總數(shù))×100％檢測(cè)特異度＝1-(肺結(jié)核病患者檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)+健康志愿者檢測(cè)陽(yáng)性數(shù))/(肺部疾病患者總數(shù)+健康志愿者總數(shù))按照單條多肽檢測(cè)出陽(yáng)性即為陽(yáng)性的原則，經(jīng)計(jì)算得出Rv2201蛋白抗原P136、P137兩條表位肽聯(lián)合檢測(cè)出結(jié)核病人的靈敏度為32％，特異度為100％。優(yōu)選地，在本發(fā)明的結(jié)核病診斷試劑盒中采用ESAT6和CFP10聯(lián)合抗原可提高結(jié)核病的診斷效率，本實(shí)施例中結(jié)核病人PBMC對(duì)Rv2201及其表位多肽具有細(xì)胞免疫應(yīng)答，而肺部其他疾患病人和健康人的PBMC對(duì)Rv2201及其表位多肽無(wú)免疫應(yīng)答，證實(shí)Rv2201蛋白表位多肽能夠被結(jié)核病人特異性識(shí)別，且四條多肽的聯(lián)合診斷效率相對(duì)于單條多肽的診斷效率提高，因此Rv2201及其表位肽具有潛在的診斷性能，可以考慮作為聯(lián)合抗原，用于結(jié)核病的檢測(cè)試劑中。另外，人群篩選試驗(yàn)也證實(shí)了Rv2201表位多肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生的IFN-γ，IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除，因此可以考慮將Rv2201及其表位多肽用于結(jié)核的疫苗的構(gòu)建和制備。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3