本發(fā)明屬于重要分析領(lǐng)域，具體涉及升麻葛根湯組合物的指紋圖譜。

背景技術(shù)：

升麻葛根湯組合物由升麻、葛根、白芍、炙甘草四味中藥組成，具有辛涼解肌，透疹解毒的功效；現(xiàn)代臨床除治療麻疹外，亦用于治療皰疹，水痘，急性痢疾、肝炎等病癥，另外本方作為小兒的沿用方，對感冒高熱發(fā)冷的老人、小兒療效甚佳。為了更全面、有效的控制本中藥組合物的質(zhì)量控制水平，和國際接軌，讓臨床用藥安全及療效更加有所保證，需要對本中藥組合物采用更為先進的質(zhì)量控制手段。

由于中藥及其復(fù)方制劑均為多組分復(fù)雜體系，因此評價其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)的，能提供豐富鑒別信息的檢測方法，但現(xiàn)行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測定等方法都不足以解決這一問題。中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥剖劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)，成分的種類與數(shù)量進而對藥品質(zhì)量進行整體描述和評價。所以，中藥指紋圖譜已經(jīng)成為目前國際上較為先進的中藥質(zhì)量控制手段。美國食品藥品管理局(FDA)植物藥產(chǎn)品工業(yè)指南、WHO草藥評價指南中均指出，如果草藥制劑的活性成分不能鑒別，可以通過指紋圖譜(fingerprint spectrum)證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致。歐共體在草藥質(zhì)量指南注釋中也指出，草藥及其制劑是以整體作為有效物質(zhì)，因此，草藥的質(zhì)量穩(wěn)定性僅靠測定己知的有效成分是不夠的，應(yīng)該通過指紋圖譜顯示其所含的各種成分。印度草藥典、英國草藥典、德國藥用植物協(xié)會、加拿大藥用及芳香植物協(xié)會等，也接受用指紋圖譜來保證有效成分未明的草藥產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。目前國家藥品監(jiān)督管理局對中藥注射劑己要求具有相關(guān)的指紋圖譜，對提高中藥注射劑的質(zhì)量起到了關(guān)鍵作用，但對其他劑型的中藥尚沒有強制性要求。

中藥指紋圖譜包括中藥化學(xué)指紋圖譜、蛋白指紋圖譜、DNA指紋圖譜及生物效應(yīng)指紋圖譜等。通常說的指紋圖譜是指化學(xué)指紋圖譜，是中藥材、中藥提取物或中成藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定分析手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥主要化學(xué)成分特性的色譜或光譜。

中藥化學(xué)指紋圖譜可以分為中藥光譜指紋圖譜，如紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、X射線衍射圖譜等；色譜指紋圖譜，如薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳圖譜(CE)等；波譜指紋圖譜，如質(zhì)譜(MS)、核磁共振波譜(NMR)等；DNA指紋圖圖譜；以及采用多種現(xiàn)代分析儀器聯(lián)用得到的多維多息特征譜(characteristic fingerprint of muhrdimension andmuhrdata)，如HPLC/MS、HPLC/Ms/MS、GC/MS、CE/MS等。

中藥指紋圖譜研究方法雖然較多，但色譜學(xué)方法應(yīng)是主流方法，尤其是TLC，HPLC和GC色譜技術(shù)，已經(jīng)成為大家所公認的三種常規(guī)的分析手段，是目前研究中藥指紋圖譜應(yīng)優(yōu)先考慮的方法。

中藥指紋圖譜有兩個作用：一是通過指紋圖譜的特征性，能有效鑒別中藥材的真?zhèn)位虍a(chǎn)地：二是通過指紋圖譜主要特征峰的面積或比例的制定，能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，確保產(chǎn)品質(zhì)量的相對一致。

中藥指紋圖譜的制作和應(yīng)用常包括：(1)采集具有代表性的中藥樣品，采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽涔┰嚻啡芤?，并選用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品(參照物)，進行分析方法的優(yōu)選；(2)根據(jù)確定的分析方法，對一定批次的中藥樣品進干了分離分析，將所得的多批次數(shù)據(jù)進行處理，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；(3)將樣品按照與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜制作相同的方法進行樣品處理、分離分析后，將所得的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進行相似度比較，一般相以度達到80％以上即可視為該樣品為合格。相似度的計算和評價方法通常采用相關(guān)系數(shù)與相合系數(shù)或夾角余弦法。我國中南大學(xué)、浙江大學(xué)等單位提據(jù)以上方法，編制了相應(yīng)的計算機軟件用于完成相假度評價，其中以國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”應(yīng)用較多。因此采用指紋圖譜技術(shù)全面反映組合物的整體特征，并進一步與其活性相關(guān)聯(lián)，對于完善目前的質(zhì)量控制方法，保證臨床用藥的安全有效是十分必要的。目前，關(guān)于升麻葛根湯組合物的指紋圖譜的研究尚未有文獻公開報道更沒有建立升麻葛根湯的指紋圖譜，從質(zhì)量控制方面，有關(guān)升麻葛根湯組合物的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜亦沒有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的沒有關(guān)于升麻葛根湯組合物的指紋圖譜以及建立升麻葛根湯組合物的指紋圖譜的文獻報道的缺陷，從而提供一種升麻葛根湯組合物指紋圖譜的建立方法及指紋圖譜。

為此，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

升麻葛根湯組合物的指紋圖譜的建立方法包括采用高效液相色譜法建立升麻葛根湯組合物指紋圖譜，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.9ml/min～1.1ml/min；柱溫：25℃～35℃；

檢測儀器采用紫外檢測器，指紋圖譜的檢測波長210nm～250nm；

理論塔板數(shù)以葛根素峰計不低于4000；

參照物溶液為大豆苷的甲醇溶液；

流動相為乙腈-0.1％磷酸溶液為系統(tǒng)，按如下順序進行梯度洗脫：

所述升麻葛根湯組合物是通過如下兩種方法制備得到：

(1)分別稱取升麻2g、葛根3g、白芍2g、炙甘草2g飲片，剪切成約2mm～8mm左右的粗顆粒，置于2L煎藥砂鍋中，加300ml水，浸泡30分鐘，加蓋煎煮，于220V的電壓下加熱至沸騰10分鐘，于170V電壓下保持微沸至藥液約100ml，濾除藥渣，即得第一升麻葛根湯組合物；或

(2)按照重量份計稱取如下飲片升麻666.7g，葛根1000g，白芍666.7g，炙甘草666.7g，切制成粒度2mm～8mm的粗顆粒，加水12倍量水，煎煮30min，濾過，然后將濾液減壓濃縮至稠膏，加麥芽糊精，干燥，混勻，加硬脂酸鎂，干壓顆粒，制成1000g，即得第二升麻葛根湯組合物。

所述指紋圖譜包括21個共有峰：

1號峰相對保留時間RRT為8.944，2號峰相對保留時間RRT為14.111，3號峰相對保留時間RRT為20.583，4號峰相對保留時間RRT為24.036，5號峰相對保留時間RRT為27.333，6號峰相對保留時間RRT為32.806，7號峰相對保留時間RRT為37.305，8號峰相對保留時間RRT為40.061，9號峰相對保留時間RRT為42.859，10號峰相對保留時間RRT為45.699，11號峰相對保留時間RRT為54.817，S峰相對保留時間RRT為61.159，13號峰相對保留時間RRT為67.543，14號峰相對保留時間RRT為70.776，15號峰相對保留時間RRT為73.526，16號峰相對保留時間RRT為80.076，17號峰相對保留時間RRT為83.260，18號峰相對保留時間RRT為86.766，19號峰相對保留時間RRT為91.200，20號峰相對保留時間RRT為98.200，21號峰相對保留時間RRT為111.034，其中，12號S峰是參照物的色譜峰。

用于高效液相色譜測定的供試品溶液采用水作為溶劑，參照物溶液采用甲醇作溶劑。

參照物溶液的制備過程為：取大豆苷對照品適量，加甲醇配制成1ml甲醇含大豆苷200μg的參照物溶液。

供試品溶液的制備過程為：取第一升麻葛根湯組合物5ml，離心，取上清液，即得；或取第二升麻葛根湯組合物1.5g，置50ml容量瓶中，加水稀釋，超聲溶解，放冷，再加水定容，搖勻，取溶液，離心，取上清液，即得。

進樣量為10μl，所述指紋圖譜的檢測波長為210nm～250nm。

升麻葛根湯組合物的指紋圖譜采用高效液相色譜法，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.9ml/min～1.1ml/min；柱溫：25℃～35℃；

理論塔板數(shù)以葛根素峰計不低于4000；

參照物溶液為大豆苷的甲醇溶液；

流動相為乙腈-0.1％磷酸溶液為系統(tǒng)，按如下順序進行梯度洗脫：

所述檢測波長為210nm～250nm。

所述指紋圖譜包括21個共有峰：

1號峰相對保留時間RRT為8.944，2號峰相對保留時間RRT為14.111，3號峰相對保留時間RRT為20.583，4號峰相對保留時間RRT為24.036，5號峰相對保留時間RRT為27.333，6號峰相對保留時間RRT為32.806，7號峰相對保留時間RRT為37.305，8號峰相對保留時間RRT為40.061，9號峰相對保留時間RRT為42.859，10號峰相對保留時間RRT為45.699，11號峰相對保留時間RRT為54.817，S峰相對保留時間RRT為61.159，13號峰相對保留時間RRT為67.543，14號峰相對保留時間RRT為70.776，15號峰相對保留時間RRT為73.526，16號峰相對保留時間RRT為80.076，17號峰相對保留時間RRT為83.260，18號峰相對保留時間RRT為86.766，19號峰相對保留時間RRT為91.200，20號峰相對保留時間RRT為98.200，21號峰相對保留時間RRT為111.034，其中，12號S峰是參照物的色譜峰。

本發(fā)明技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明提供的升麻葛根湯組合物指紋圖譜，全面反映出升麻葛根湯組合物的質(zhì)量信息，從而能夠達到更加全面、有效地控制升麻葛根湯組合物制劑產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

2、本發(fā)明提供的升麻葛根湯組合物指紋圖譜的建立方法采用國家藥典委員會提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對所測指紋圖譜進行辨認，操作方便、快捷；而且，以此得出的相以度結(jié)果對制劑指紋圖譜進行評價，結(jié)論較為客觀、準(zhǔn)確。

3、本發(fā)明提供的升麻葛根湯組合物指紋圖譜的建立方法參照中藥注射劑指紋圖譜的要求，對本發(fā)明涉及的指紋圖譜進行了研究，經(jīng)過對供試品制備方法的考察及測定指紋圖譜的儀器，色譜柱、流動相、檢測波長等條件進行系統(tǒng)的優(yōu)選，建立了指紋圖譜測定條件并進行了方法學(xué)考察，在對多批本中藥組合物指紋圖譜檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上，逐漸積累數(shù)據(jù)，提出了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，作為本品指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，從而達到能夠更全面、有效地控制制劑質(zhì)量的目的。

4、本發(fā)明對所測得的指紋圖譜的辨認采用國家藥典委員會提供中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)作為本中藥組合物指紋圖譜相似度計算軟件，經(jīng)多次試驗研究，通過與計算相對保留時間及相對峰面積的方法相比較，所得出的評價結(jié)論基本一致，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)評價指紋圖譜的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度結(jié)果，對制劑指紋圖譜進行評價，結(jié)論較為客觀、準(zhǔn)確。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是多波長檢測結(jié)果；

圖2是200～400nm掃描光譜3D圖；

圖3是色譜線由下至上：215nm、220nm、225nm、230nm、240nm、250nm；

圖4是200～400nm掃描光譜3D圖；

圖5是兩種溶劑系統(tǒng)的色譜對比圖；

圖6是供試品溶液色譜圖；

圖7是供試品溶液色譜圖；

圖8是供試品溶解溶劑考察色譜對比圖；

圖9是參照物色譜峰與供試品溶液色譜峰對比圖；

圖10指紋圖譜測定中200～400nm掃描光譜3D圖；

圖11指紋圖譜測定中的大豆苷參照物溶液色譜圖

圖12指紋圖譜測定中的對照指紋圖譜

圖13連續(xù)四批樣品指紋圖譜對比色譜圖

圖14是完整性試驗色譜圖；

具體實施方式

提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實施方式，不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

實施例中未注明具體實驗步驟或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的常規(guī)實驗步驟的操作或條件即可進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)試劑產(chǎn)品。

本發(fā)明試藥及儀器：

試藥：

升麻葛根湯組合物(實驗室自制，制備方法見實施例2)；

異阿魏酸(批號：111698-201103中國藥品生物制品檢定研究院，純度99.2％)；

芍藥苷(批號：110736-201136，中國藥品生物制品檢定研究院，純度96.0％)；

葛根素(批號：110752-201418，中國藥品生物制品檢定研究院，純度95.5％)；

甘草酸銨對照品(批號：110731-201418，中國藥品生物制品檢定研究院，93.1％)，

甘草苷對照品(批號：111610-201106，中國藥品生物制品檢定研究院，純度93.7％)，

升麻素(批號：111710-200602，中國藥品生物制品檢定研究院)，

大豆苷元對照品(批號：111502-2004021，中國藥品生物制品檢定研究院)，

大豆苷對照品(批號：111738-201302，中國藥品生物制品檢定研究院)，

芍藥內(nèi)酯苷對照品(批號：GR-133-141025，南京廣洞生物制品有限公司，純度98.0％)，

升麻(批號：160220，產(chǎn)地：吉林)；

葛根(批號：160222，產(chǎn)地：湖北)；

白芍(批號：160223，產(chǎn)地：安徽)；

炙甘草(批號：160221，產(chǎn)地：新疆)。試劑為分析純，水為超純水。

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(1290DAD檢測器)

Waters E2695高效液相色譜儀(2998DAD檢測器)

實施例1.配制對照品溶液

異阿魏酸對照品溶液取異阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加10％乙醇制成每1ml含異阿魏酸20μg的溶液，即得。

升麻素對照品溶液取升麻素對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加10％乙醇制成每1ml含異阿魏酸80μg的溶液，即得。

芍藥苷對照品溶液取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

芍藥內(nèi)酯苷對照品溶液取芍藥內(nèi)酯苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加10％乙醇制成每1ml含異阿魏酸50μg的溶液，即得。

葛根素對照品溶液取葛根素對照品適量，精密稱定，加30％乙醇制成每1ml含80μg的溶液，即得。

大豆苷元對照品溶液取葛根素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含70μg的溶液，即得。

大豆苷對照品溶液取大豆苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含70μg的溶液，即得。

甘草苷對照品溶液取甘草苷對照品適量，精密稱定，加70％乙醇分別制成每1ml含甘草苷20μg的溶液，即得。

甘草酸銨對照品溶液取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70％乙醇分別制成每1ml含甘草酸銨0.2mg的溶液，即得。

混合對照品溶液：分別吸取上述對照品1ml置5ml容量瓶中，混勻，即得。

實施例2.升麻葛根湯組合物的制備

第一升麻葛根湯組合物：稱取如下重量配比的四味飲片：升麻300g；葛根450g；白芍300g；炙甘草300g，剪切成約2mm～8mm左右的粗顆粒，分別稱取9g(升麻2g、葛根3g、白芍2g、炙甘草2g)置于2L煎藥砂鍋中，加300ml水，浸泡30分鐘，加蓋煎煮，加熱(電壓值約220V)至沸騰(約10分鐘)，保持微沸(電壓值約170V)至藥液約100ml(約38分鐘)，采用兩層醫(yī)用紗布濾除藥渣，即得。

第二升麻葛根湯組合物：按照重量份計稱取如下飲片升麻666.7g，葛根1000g，白芍666.7g，炙甘草666.7g，切制成粒度2mm～8mm的粗顆粒，加水12倍量水，煎煮30min，濾過，得濾液，將濾液減壓濃縮至稠膏，加適量的麥芽糊精，干燥，混勻，加適量硬脂酸鎂，干壓顆粒，制成1000g，即得。組合物②采用聚酯鍍鋁/聚乙烯復(fù)合膜，包裝規(guī)格為3.0g/袋。

實施例3：色譜條件的選擇

(1)檢測波長的選擇

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：以甲醇為流動相A，0.1mol/L磷酸為流動相B，按照下表，進行梯度洗脫，進樣量10μl，流速：1.0ml/min，柱溫：30℃。梯度程序如下。

表1梯度洗脫程序1

采用HPLC多波長檢測技術(shù)，檢測波長分別為λ＝316、λ＝290，λ＝270，λ＝250，λ＝237，λ＝230，以色譜峰數(shù)、分離度等評價，所得結(jié)果見圖1，2。

由3D光譜掃描圖可知，升麻葛根湯煎液中所含大部分物質(zhì)處于末端吸收(210nm～250nm)，結(jié)合圖1所考察的波長可知，在盡可能的選擇紫外末端波長能較全面的反應(yīng)煎液的指紋信息，在優(yōu)化色譜梯度條件下在210nm～250nm的波長范圍內(nèi)對多個波長進行進一步的考察，結(jié)果見圖3，4。

綜上可知，檢測波長為220nm時，不僅基線平穩(wěn)，色譜峰指認信息也更多，因此選擇指紋圖譜的檢測波長為220nm。

(2)流動相組成的考察

由于組合物采用水提取，浸出成分往往極性較大，且四味飲片成分多為黃酮類、苷類等，極性亦較大。結(jié)合HPLC采用的常用流動相組成，分別對甲醇—水、乙腈—水系統(tǒng)進行考察。試驗結(jié)果見圖5。

試驗結(jié)果表明：乙腈—水系統(tǒng)在色譜峰個數(shù)，色譜峰分離上均較甲醇—水系統(tǒng)好，因此選擇乙腈—水系統(tǒng)進行色譜梯度優(yōu)化研究。

(3)流動相比例的優(yōu)化

在乙腈—水系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，在其余條件均相同的情況下，對梯度洗脫程序進行優(yōu)化研究。通過流動相梯度不斷的調(diào)整和優(yōu)化，試驗結(jié)果見表2、3、圖6、7。

色譜優(yōu)化條件一：

表2梯度洗脫程序2

由圖可知，色譜峰大部分分離度較好，但在保留時間37min、60min左右色譜峰分離較差，有必要進一步的優(yōu)化。

色譜優(yōu)化條件二：

表3梯度洗脫程序1

實施例4：供試品溶劑考察

溶劑、溫度是影響物質(zhì)溶解度的重要因素，相同的物質(zhì)在不同溶劑中溶解度存在差異，相同溶劑中物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增大。升麻葛根湯組合物①在提取過程中溫度較高，物質(zhì)的溶解度相對較高，當(dāng)冷卻至室溫后，部分物質(zhì)因溶解度減少將析出，造成組合物①呈現(xiàn)一定的沉淀或混懸物，此沉淀或混懸物作為組合物組成的一部分，應(yīng)該對其質(zhì)量進行相應(yīng)的研究，同時供試品溶液的制備過程應(yīng)該考慮此部分物質(zhì)的保留。

按制備方法制備第一升麻葛根湯組合物，冷卻至30℃～35℃之間，分別按照系列方式制備供試品溶液：①直接離心進樣(原液)：取第一升麻葛根湯組合物適量，12000r/min離心10min，取上清液進樣，進樣量10μl，即得。②30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇作溶劑：分別精密量取5ml第一升麻葛根湯組合物置于10ml容量瓶中，分別加入甲醇3ml、5ml，搖勻，加水至刻度，分別作為30％、50％甲醇溶劑，精密量取3ml第一升麻葛根湯組合物置于10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為70％的甲醇溶劑；分別取上述三種溶液適量，12000r/min離心10min，取上清液進樣，進樣量20μl，即得。試驗結(jié)果見圖8.

由圖8可知，四種方式處理的供試品在色譜峰分離、峰數(shù)上均一致，考慮到組合物本身采用水提取，水作為溶劑更能反應(yīng)組合物本身的成分屬性，因此選擇指紋圖譜供試品溶液的溶解溶劑為水。

實施例5.參照物的選擇

參照物在指紋圖譜中主要用于辨認和評價指紋圖譜特征的指引，不等同于含量測定的對照品。按照《中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求》指紋圖譜的參照物一般選取容易獲取的一個或一個以上制劑中的主要活性成分或指標(biāo)成分，用于考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性。中藥復(fù)方制劑的參照物首選君藥的活性成分或指標(biāo)成分，而參照物應(yīng)為保留時間適中、峰面積大小合適、分離穩(wěn)定的色譜峰。

參照物溶液的制備：取異阿魏酸、阿魏酸、葛根素、芍藥苷、甘草苷、芍藥內(nèi)酯苷、升麻素、大豆苷元、大豆苷、甘草酸銨對照品適量，加甲醇制備成每1ml含有異阿魏酸74.4μg、阿魏酸72.0μg、葛根素74.6μg、芍藥苷77.4μg、甘草苷67.5μg、芍藥內(nèi)酯苷77.6μg、升麻素81.1μg、大豆苷73.1μg、大豆苷元56μg、甘草酸銨74.0μg的對照品溶液，即得。

由圖9可知：在供試品溶液中大豆苷、甘草苷、甘草酸銨均能良好的分離，其中芍藥內(nèi)酯苷、大豆苷元因供試品種含量較低，色譜峰面積較小；芍藥苷、葛根素在色譜圖中沒有得到較好分離；升麻素、異阿魏酸、阿魏酸三者因結(jié)構(gòu)相似在色譜圖中保留時間比較接近，因此分離情況不佳，且三者在供試品溶液中的峰面積均較小，均不適合作為參照物。大豆苷來源于葛根飲片，葛根為方中臣藥，大豆苷在色譜圖中保留時間、峰面積適中，且前后無干擾峰，最終確定大豆苷作為指紋圖譜參照物。

實施例6.共有峰確定及對照指紋圖譜的建立.

采用同一批次飲片，制備升麻葛根湯組合物①10份，分別升麻葛根湯組合物①供試品溶液，按指紋圖譜測定法測定，記錄圖譜。通過分析，確定其共有特征峰為21個(見附圖10-12)，所述的21個共有特征峰的相對保留時間偏差RSD均小于2％，即：

1號峰平均相對保留時間RRT為7.642，RSD％為0.41％；

2號峰平均相對保留時間RRT為9.853，RSD％為0.49％；

3號峰平均相對保留時間RRT為16.126，RSD％為0.33％；

4號峰平均相對保留時間RRT為22.259，RSD％為0.23％；

5號峰平均相對保留時間RRT為26.222，RSD％為0.37％；

6號峰平均相對保留時間RRT為28.988，RSD％為0.44％；

7號峰平均相對保留時間RRT為35.621，RSD％為0.21％；

8號峰平均相對保留時間RRT為39.980，RSD％為0.38％；

9號峰平均相對保留時間RRT為42.276，RSD％為0.41％；

10號峰平均相對保留時間RRT為45.416，RSD％為0.53％；

11號峰平均相對保留時間RRT為48.500，RSD％為0.51％；

12號峰平均相對保留時間RRT為59.605，RSD％為0.19％；

13號峰平均相對保留時間RRT為65.159，RSD％為0.25％；

14號峰平均相對保留時間RRT為70.071，RSD％為0.18％；

15號峰平均相對保留時間RRT為73.203，RSD％為0.15％；

16號峰平均相對保留時間RRT為75.359，RSD％為0.05％；

17號峰平均相對保留時間RRT為80.548，RSD％為0.10％；

18號峰平均相對保留時間RRT為85.038，RSD％為0.09％；

19號峰平均相對保留時間RRT為92.278，RSD％為0.08％；

20號峰平均相對保留時間RRT為99.758，RSD％為0.06％；

21號峰平均相對保留時間RRT為110.939，RSD％為0.03％；

其中，12號S峰是參照物的色譜峰。

運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012年版)處理圖譜，以160511-1作為參照圖譜，得到升麻葛根湯組合物①對照指紋圖譜。采用夾角余弦法計算樣品相似度，結(jié)果表明，煎煮的10份升麻葛根湯組合物①相似度在0.983～1.000之間，相似度較高。

表4 10份升麻葛根湯組合物①相似度評價結(jié)果

根據(jù)10批供試品溶液色譜圖所給出的相關(guān)參數(shù)，選擇具有特征性的21共有峰，以12號參照峰峰面積作為1，計算其他各共有特征指紋峰峰面積的比值，結(jié)果見表5。

表5 10份升麻葛根湯組合物①共有峰面積比值結(jié)果

取第一升麻葛根湯組合物所對應(yīng)的飲片，制備連續(xù)三批次第二升麻葛根湯組合物樣品，按指紋圖譜測定方法測定，記錄色譜圖(見附圖13)，以第一升麻葛根湯組合物生成的對照指紋圖譜作為隨行對照圖譜，計算3批次第二升麻葛根湯組合物的相似度。結(jié)果見下表。

第二升麻葛根湯組合物相似度計算結(jié)果

實施例7.指紋圖譜方法學(xué)驗證.

1空白試驗

為考察供試品溶解溶劑對指紋圖譜中各色譜峰的干擾，進行空白試驗。按擬定方法，進樣10μl去離子水運行梯度，記錄色譜圖，結(jié)果表明空白樣品基線平穩(wěn)、基本無干擾。

2完整性試驗

按擬定條件記錄120min的色譜圖后，再繼續(xù)運行120min，并記錄色譜圖(見圖14)?？梢娚楦鸶鶞M合物120min后未見色譜峰，確定梯度運行120min。

3重復(fù)性試驗

按照供試品溶液制備方法，制備6份供試品溶液，分別進樣10μl，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算相似度，RSD值，所得結(jié)果見表6.

表6重復(fù)性試驗相似度結(jié)果

試驗結(jié)果表明：該方法重復(fù)性良好。

4供試品溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、16h、24h、36h時間點進樣，記錄色譜圖，計算相似度及RSD值，所得結(jié)果見表7.

表7供試品穩(wěn)定性試驗相似度結(jié)果

試驗結(jié)果表明：供試品溶液在36h以內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3％，穩(wěn)定性良好。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。