本發(fā)明涉及蘭科白及屬藥用植物產(chǎn)品的鑒別和質(zhì)量控制方法技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種鑒別三種藥用白及的色譜指紋圖譜方法。
背景技術(shù):
藥材白及為蘭科白及屬植物白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)的干燥塊莖,是我國(guó)傳統(tǒng)止血生肌藥,中醫(yī)臨床用于咯血,吐血,外傷出血,瘡瘍腫毒,皮膚皸裂。白及屬(Bletilla Rchb.)植物全世界有6種,分布于亞洲的緬甸北部經(jīng)我國(guó)至日本。我國(guó)產(chǎn)4種:華白及Bletilla sinensis(Rolfe)Schltr.Schltr.、小白及Btetilla formosana(Hayata)Schltr.、黃花白及Bletilla ochracea Schltr、紫花三叉白及Bletilla striate(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.。而市場(chǎng)認(rèn)可度和藥用價(jià)值最高的種是紫花三叉白及,且絕大多數(shù)的栽培品種也是紫花三叉白及,其種源90%來(lái)源于“江西群落”和“貴州群落”,種植面積大致是貴州占20%(約1500畝),云南占18%,四川占15%,安徽占15%,湖北占12%,江蘇、廣西、湖南、陜西各占5%。
現(xiàn)代藥理研究顯示白及塊莖中含有多種有效藥用成分,水溶性多糖則是其主要藥用成分。作為天然高分子材料,白及多糖同時(shí)具有功能緩釋性、局部滯留性、自身降解性、無(wú)刺激性、無(wú)毒副作用等輔料的特性,在現(xiàn)代藥物制備中的作用越來(lái)越重要。
多糖類(lèi)化合物作為天然藥物的主要活性成分之一,其活性與其多糖的空間結(jié)構(gòu)及分子量分布密切相關(guān),為探索其組分和藥效的相關(guān)性,本方案將采用高效體積排阻色譜法(HPSEC)對(duì)同一產(chǎn)地不同種類(lèi)白及多糖的相對(duì)分子質(zhì)量的分布進(jìn)行比較分析,從不同分子量多糖的比例和分布來(lái)表征不同物種白及多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),建立HPSEC色譜指紋圖譜為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供可行辦法。而迄今為止,未見(jiàn)關(guān)于利用HPSEC色譜建立藥用白及多糖色譜指紋圖譜的公開(kāi)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種更準(zhǔn)確可靠的鑒別三種藥用白及的色譜指紋圖譜方法,該圖譜方法是根據(jù)三種藥用白及主要藥效基礎(chǔ)物質(zhì)多糖建立的HPSEC色譜圖譜。本發(fā)明建立的多糖分子量分布圖譜能有效區(qū)分不同白及種類(lèi),既可彌補(bǔ)藥典中利用硅膠薄層點(diǎn)樣層析的出現(xiàn)目的斑點(diǎn)的來(lái)判斷白及優(yōu)劣和真?zhèn)蔚牟蛔悖部捎脕?lái)鑒別三種藥用白及(小白及Btetilla formosana(Hayata)Schltr.;黃花白及Bletilla ochracea Schltr;紫花三叉白及Bletilla striate(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.)與其他種白及屬植物。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明提供一種鑒別三種藥用白及的色譜指紋圖譜方法,包括如下步驟:
(1):預(yù)處理
將按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法取樣得到的已知不同品種的藥用白及材料切成薄片后混合,于60-70℃的烘箱中烘干至恒重并粉碎成粉末;
(2):多糖提取
①采用80℃-90℃的無(wú)水乙醇索氏提取步驟(1)中所得粉末至回流液無(wú)色,揮干溶劑,將所得白及藥渣按照料液比(1-2):(4-6)加入蒸餾水中,并于75℃-85℃水浴冷凝回流提取3-5次,每次2-3h;
②合并濾液并向?yàn)V液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%-0.5%的活性炭混勻脫色,于60℃-65℃環(huán)境下靜置1-2h后抽濾;
③抽濾后,將上述溶液于60℃-65℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行負(fù)壓濃縮為原體積的30%-35%,再加入無(wú)水乙醇,使其終濃度達(dá)到80%-85%(v/v),再于3-5℃冰箱中靜置2-3h,接著,3000-4000r/min轉(zhuǎn)速下離心10-20min后留取沉淀;
④將沉淀用蒸餾水溶解即得藥用白及粗多糖溶液;
(3):多糖純化
對(duì)步驟(2)所得的粗多糖溶液進(jìn)行進(jìn)一步的多糖純化;
(4):色譜指紋圖譜的建立
①將不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成4-5mg/mL的水溶液分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC中,再根據(jù)各相應(yīng)色譜圖計(jì)算多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程;
②多糖純化后的藥用白及樣品分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC,獲取相應(yīng)色譜圖,再根據(jù)多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出各樣品的色譜曲線(xiàn)各部分的相對(duì)分子量,最終建立相應(yīng)已知的藥用白及樣品的HPSEC代表模式色譜圖譜;
(5):未知種類(lèi)白及的鑒定
將未知種類(lèi)的白及按照以上步驟(1)-(4)進(jìn)行處理,以得到其對(duì)應(yīng)色譜指紋圖譜,再將其與已建立的已知的白及樣品的色譜指紋圖譜進(jìn)行相似度比較,當(dāng)其相似度大于90%以上時(shí),即可判定為同一類(lèi)白及屬植物,否則不是同一種屬。
優(yōu)選地,所述步驟(1)中不同品種藥用白及的品種分別為:紫花三叉白及、黃花白及與小白及。
優(yōu)選地,所述步驟(1)中藥用白及材料為藥用白及鮮品塊莖或干燥塊莖。
優(yōu)選地,所述步驟(1)中統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為:分別在貴州、云南、四川、安徽四個(gè)地區(qū)按照五點(diǎn)取樣法收集藥用白及樣本。
優(yōu)選地,所述步驟(3)中多糖純化采用Sevage法:按照樣品與萃取劑體積比(3-5):(0.5-2)加入Sevage試劑,混勻,振蕩25-35min,以3000-4000r/min離心5-10min,棄去除下層氯仿及中層變性蛋白;再取上層水溶液重復(fù)去蛋白操作,至無(wú)明顯中層為止;最后,收集去蛋白后的上層水溶液,通過(guò)超濾裝置超濾,脫去小分子物質(zhì),即得到純化后的多糖濃縮溶液。
優(yōu)選地,所述Sevage試劑為體積比分別為(3-5)∶(0.5-1.5)的氯仿與正丁醇的混合液。
優(yōu)選地,所述超濾裝置為濾膜截留分子量為1K的超濾裝置。
優(yōu)選地,所述步驟(4)中不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的重均分子量Mw分別為:2000KDa、580KDa、70KDa、10KDa、5KDa。
優(yōu)選地,所述步驟(4)中多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程的計(jì)算方法為:根據(jù)各葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間和分子量對(duì)數(shù),以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)lgMw為縱坐標(biāo),色譜峰保留時(shí)間Rt為橫坐標(biāo),使用線(xiàn)性方程擬合得多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。
優(yōu)選地,進(jìn)行高效體積排阻色譜HPSEC檢測(cè)時(shí)相應(yīng)色譜條件為:流動(dòng)相為0.1M醋酸鈉,流速為0.5mL/min,柱溫為45℃,進(jìn)樣量為20uL。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明提供的三種白及多糖分子量分布的HPSEC色譜指紋圖譜為代表模式圖譜,利用中國(guó)藥典委員會(huì)出品的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件進(jìn)行判定,能通過(guò)白及主要藥效成分-白及多糖的分子量分布來(lái)有效區(qū)分和鑒別三種藥用白及,其方法能彌補(bǔ)中國(guó)藥典2015版設(shè)定的白及鑒定方法的的不足,因?yàn)楹笳呤抢霉枘z薄層點(diǎn)樣層析的出現(xiàn)目的斑點(diǎn)的來(lái)作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和判斷標(biāo)準(zhǔn),是一種單一的信息反饋,制假者利用檢測(cè)方法的漏洞可以造假,而本方法更貼近化學(xué)組分的本質(zhì),是更精細(xì)的信息,制假者幾乎無(wú)法仿制或仿制成本昂貴。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明實(shí)施例1-2提供的一種鑒別三種藥用白及的色譜指紋圖譜方法的流程圖。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提供的一種鑒別三種藥用白及的色譜指紋圖譜方法的紫花三叉白及多糖的分子量分布圖;
圖3是本發(fā)明實(shí)施例1提供的一種鑒別三種藥用白及的色譜指紋圖譜方法的黃花白及多糖的分子量分布圖;
圖4是本發(fā)明實(shí)施例1提供的一種鑒別三種藥用白及的色譜指紋圖譜方法的小白及多糖的分子量分布圖。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明,本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施,給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
一種鑒別三種藥用白及的色譜指紋圖譜方法,如圖1所示,包括如下步驟:
(1):預(yù)處理
將分別在貴州、云南、四川、安徽四個(gè)地區(qū)按照五點(diǎn)取樣法收集到的三種藥用白及(紫花三叉白及、黃花白及、小白及)的新鮮塊莖切成薄片后,按同種類(lèi)分別混合,于60℃的烘箱中烘干至恒重并粉碎成粉末;
(2):多糖提取
①采用85℃的無(wú)水乙醇索氏提取步驟(1)中所得粉末至回流液無(wú)色,揮干溶劑,將所得白及藥渣按照料液比1:5加入蒸餾水中,并于80℃水浴冷凝回流提取3次,每次3h;
②合并濾液并向?yàn)V液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的活性炭混勻脫色,于60℃環(huán)境下靜置1h后抽濾;
③抽濾后,于60℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行負(fù)壓濃縮為原體積的33%,再加入無(wú)水乙醇,使其終濃度達(dá)到85%(v/v),再于4℃冰箱中靜置3h,接著,4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min后留取沉淀;
④將沉淀用蒸餾水溶解即得藥用白及粗多糖溶液;
(3):多糖純化
對(duì)步驟(2)所得的粗多糖溶液進(jìn)行進(jìn)一步的多糖純化,采用Sevage法:按照樣品與萃取劑體積比4:1加入Sevage試劑(體積比分別為4∶1的氯仿與正丁醇混合液),混勻,振蕩30min,以4000r/min離心15min,棄去除下層氯仿及中層變性蛋白;再取上層水溶液重復(fù)去蛋白操作,至無(wú)明顯中層為止;最后,收集去蛋白后的上層水溶液,通過(guò)超濾裝置超濾,濾膜截留分子量為1K,脫去小分子物質(zhì),即得到純化后的多糖濃縮溶液;
(4):色譜指紋圖譜的建立
①將重均分子量Mw分別為:2000KDa、580KDa、70KDa、10KDa、5KDa的五種葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成5mg/mL的水溶液分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC中,根據(jù)各葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間和分子量對(duì)數(shù),以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)lgMw為縱坐標(biāo),色譜峰保留時(shí)間Rt為橫坐標(biāo),使用線(xiàn)性方程擬合得多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程:lgMw=y(tǒng)=-0.3486x+11.133,R2=0.9968;其中,進(jìn)行高效體積排阻色譜HPSEC檢測(cè)時(shí)相應(yīng)色譜條件為:色譜柱:G6000PWXL 7.8mm ID×300mm;檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器(RID);流動(dòng)相:0.1M醋酸鈉;流速:0.5mL/min;柱溫:45℃,進(jìn)樣量20μL;
②多糖純化后的藥用白及樣品分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC,獲取相應(yīng)色譜圖,再根據(jù)多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出各樣品的色譜曲線(xiàn)各部分的相對(duì)分子量,最終建立相應(yīng)已知的白及樣品的HPSEC代表模式色譜圖譜;圖2-4則分別為三種藥用白及在高效體積排阻色譜HPSEC中得到的峰譜圖,即以橫坐標(biāo)為出峰時(shí)間(單位:分鐘),縱坐標(biāo)為光電信號(hào)的響應(yīng)值(單位:毫伏)的多糖的分子量分布圖,其中,色譜峰上的數(shù)據(jù)為各切割點(diǎn)的相對(duì)分子量Mw,是通過(guò)上述多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算得出;三種白及樣品的HPSEC圖譜的峰按起伏切割成6個(gè)部分,分子量分別為:大于500KDa、500KDa-200KDa、200KDa-100KDa、100KDa-50KDa、50KDa-10Kda、小于10KDa;圖譜經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密性試驗(yàn)和重現(xiàn)性試驗(yàn)等方法學(xué)考察,相對(duì)峰面積變化的RSD均小于3%,符合色譜方法學(xué)要求;
由圖2-4可知,白及多糖的分子量分布較為集中,三種白及屬植物樣品(紫花三叉白及、黃花白及、小白及)的重均分子量(Mw)分別為:590KDa、98KDa、72KDa,即不同品種白及的重均分子量有明顯差異,數(shù)值上白及遠(yuǎn)大于黃花白及和小白及;
因此,圖2-4的三個(gè)圖譜即為三種白及多糖分子量分布的HPSEC色譜指紋圖譜的代表模式圖譜;
(5):未知種類(lèi)白及的鑒定
將未知的兩種白及屬植物新鮮塊莖按照以上步驟(1)-(4)進(jìn)行處理,以得到其對(duì)應(yīng)色譜指紋圖譜,再根據(jù)中國(guó)藥典委員會(huì)出品的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件進(jìn)行判定,將其與已建立的已知的白及樣品的HPSEC色譜指紋圖譜進(jìn)行相似度比較,結(jié)果表明一種白及屬植物的圖譜和物種紫花三叉白及的相似度達(dá)94%,即判定為物種紫花三叉白及,而另一種白及屬植物的圖譜與三種藥用白及代表模式指紋圖譜的相似度均達(dá)不到90%,則判定該白及屬植物非此三種藥用白及。
實(shí)施例2
一種鑒別三種藥用白及的色譜指紋圖譜方法,如圖1所示,包括如下步驟:
(1):預(yù)處理
將分別在貴州、云南、四川、安徽四個(gè)地區(qū)按照五點(diǎn)取樣法收集到的三種藥用白及(紫花三叉白及、黃花白及、小白及)的干燥塊莖切成薄片后,按同種類(lèi)分別混合,于60℃的烘箱中烘干至恒重并粉碎成粉末;
(2):多糖提取
①采用80℃的無(wú)水乙醇索氏提取步驟(1)中所得粉末至回流液無(wú)色,揮干溶劑,將所得白及藥渣按照料液比1:6加入蒸餾水中,并于85℃水浴冷凝回流提取4次,每次3h;
②合并濾液并向?yàn)V液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的活性炭混勻脫色,于65℃環(huán)境下靜置2h后抽濾;
③抽濾后,將上述溶液于65℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行負(fù)壓濃縮為原體積的34%,再加入無(wú)水乙醇,使其終濃度達(dá)到85%(v/v),再于5℃冰箱中靜置2h,接著,3000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min后留取沉淀;
④將沉淀用蒸餾水溶解即得白及粗多糖溶液;
(3):多糖純化
對(duì)步驟(2)所得的粗多糖溶液進(jìn)行進(jìn)一步的多糖純化,采用Sevage法:按照樣品與萃取劑體積比4:1加入Sevage試劑(體積比分別為4∶1的氯仿與正丁醇混合液),混勻,振蕩35min,以4000r/min離心10min,棄去除下層氯仿及中層變性蛋白;再取上層水溶液重復(fù)去蛋白操作,至無(wú)明顯中層為止;最后,收集去蛋白后的上層水溶液,通過(guò)超濾裝置超濾,濾膜截留分子量為1K,脫去小分子物質(zhì),即得到純化后的多糖濃縮溶液;
(4):色譜指紋圖譜的建立
①將重均分子量Mw分別為:2000KDa、580KDa、70KDa、10KDa、5KDa的五種葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成5mg/mL的水溶液分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC中,根據(jù)各葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間和分子量對(duì)數(shù),以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)lgMw為縱坐標(biāo),色譜峰保留時(shí)間Rt為橫坐標(biāo),使用線(xiàn)性方程擬合得多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程:lgMw=y(tǒng)=-0.3486x+11.133,R2=0.9968;其中,進(jìn)行高效體積排阻色譜HPSEC檢測(cè)時(shí)相應(yīng)色譜條件為:色譜柱:G6000PWXL 7.8mm ID×300mm;檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器(RID);流動(dòng)相:0.1M醋酸鈉;流速:0.5mL/min;柱溫:45℃,進(jìn)樣量20μL;
②多糖純化后的藥用白及樣品分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC,獲取相應(yīng)色譜圖,再根據(jù)多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出各樣品的色譜曲線(xiàn)各部分的相對(duì)分子量,最終建立相應(yīng)已知的藥用白及樣品的色譜指紋圖譜;
(5):未知種類(lèi)白及的鑒定
將未知的三種白及屬植物干燥塊莖按照以上步驟(1)-(4)進(jìn)行處理,以得到其對(duì)應(yīng)色譜指紋圖譜,再根據(jù)中國(guó)藥典委員會(huì)出品的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件進(jìn)行判定,將其與已建立的已知的藥用白及樣品的色譜指紋圖譜進(jìn)行相似度比較,結(jié)果表明一種白及屬植物的圖譜和物種黃花白及的相似度達(dá)90%,即判定為黃花白及,一種白及屬植物的圖譜和物種小白及的相似度達(dá)91%,即判定為物種小白及,而第三種白及屬植物的圖譜與上述三種藥用白及代表模式指紋圖譜的相似度均達(dá)不到90%,則判定該白及屬植物非此三種藥用白及。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。