本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型酶聯(lián)免疫分析方法。

背景技術(shù)：

酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked immunoassay，簡稱ELISA)，是一種利用抗原抗體之間專一性鍵結(jié)的特性對檢體進行檢測的方法。ELISA分析法由于其快速、簡便的分析特性，廣泛用于血清、血漿、尿、便、組織液等樣品中各種生化指標、疾病標志物的臨床檢驗。其中，雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的ELISA分析方法，其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上的兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量在檢測范圍內(nèi)成正比。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量，即可確定待測抗原含量。

已有的酶聯(lián)免疫分析試劑盒，多基于抗原與抗體特異性識別的原理構(gòu)建。其中，辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)由于其比活性高、穩(wěn)定、分子量小且純酶容易制備的特性，常常被用作信號介導(dǎo)物質(zhì)，來實現(xiàn)對目標對象的信號讀出。HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H₂O₂)和供氫體(DH₂)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。HRP催化反應(yīng)的過程如下：

DH₂+H₂O₂→D+2H₂O

利用HRP催化過氧化氫(H₂O₂)氧化染料產(chǎn)生顯色反應(yīng)，并采用光度檢測儀器得到定性或定量分析結(jié)果，來實現(xiàn)對待測物質(zhì)的檢測。因此，所有以HRP作為信號介導(dǎo)的免疫試劑盒，均需要外源性H₂O₂作為顯色反應(yīng)試劑配套使用。

H₂O₂由于分子結(jié)構(gòu)的低對稱性及過氧鍵的存在，導(dǎo)致其化學(xué)穩(wěn)定性較差，易發(fā)生自分解反應(yīng)或與共存組分發(fā)生氧化還原反應(yīng)。另外，H₂O₂在高溫、光照或與一些不兼容化學(xué)物質(zhì)(如過渡態(tài)金屬離子、有機可燃物等)作用下，會迅速分解生成水和氧氣并放出大量的熱，激發(fā)其熱危險性，進而引發(fā)熱失控反應(yīng)，最終導(dǎo)致爆炸事故的發(fā)生。因此，H₂O₂屬易燃易爆品，無論在試劑盒的生產(chǎn)、運輸、儲存等環(huán)節(jié)，均需要較為苛刻的存放環(huán)境和包裝材料；由于不得與其他試劑共存，通常要求使用單獨的包裝；H₂O₂的自分解，會導(dǎo)致不同批次試劑盒檢測結(jié)果的可比性變差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述采用HRP作為抗體標記物進行酶聯(lián)免疫分析存在的缺點，提供一種簡便、快速且能夠高通量檢測的酶聯(lián)免疫分析方法。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：

1、將待測抗原標準品加入pH值為7.4的PBS緩沖液中，配制1～10000pg/L抗原標準品溶液，將抗原標準品溶液加入到包被抗體的固相載體表面，使抗原與抗體鍵合，隨后用洗滌緩沖液洗滌固相載體并拍干。

2、將葡萄糖氧化酶標記的單克隆抗體溶解于pH值為7.4的PBS緩沖液后，加入到步驟1中鍵合抗原的固相載體表面，與鍵合在固相載體表面的抗原反應(yīng)，隨后用洗滌緩沖液洗滌固相載體并拍干。

3、將葡萄糖水溶液加入到步驟2中獲得的固相載體表面，30～37℃反應(yīng)10～20分鐘，加入葡萄糖氧化酶顯色劑和催化量的辣根過氧化物酶進行顯色反應(yīng)，并測定光密度，繪制光密度隨抗原標準品濃度的對數(shù)值變化的標準曲線。

4、按照上述步驟1～3的方法測試待測抗原樣品對應(yīng)的光密度，結(jié)合標準曲線的線性方程即可確定待測抗原樣品中抗原的含量。

上述步驟3中，所述的葡萄糖氧化酶顯色劑優(yōu)選4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽的顯色體系。

上述的洗滌緩沖液是由pH值為7.4的PBS緩沖液和吐溫-20組成，其中吐溫-20占洗滌緩沖液質(zhì)量的0.1％。

上述的固相載體為聚苯乙烯酶標板。

上述葡萄糖氧化酶標記的單克隆抗體用戊二醛二步法制備得到，具體制備方法如下：

1、將25mg葡萄糖氧化酶溶于1mL質(zhì)量分數(shù)為1.25％的戊二醛水溶液中，室溫靜置12小時，所得反應(yīng)液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫，流速為1mL/min，收集棕色流出液。若收集得到的棕色流出液體積大于5mL，用聚乙二醇濃縮至5mL，置于25mL燒杯中。

2、將12.5mg待標記的單克隆抗體用生理鹽水稀釋至5mL，攪拌下逐滴加入到步驟1得到的酶溶液中，并加入0.25mL 1mol/L pH＝9.5的碳酸緩沖液，繼續(xù)攪拌3小時，再加入0.25mL 0.2mol/L賴氨酸水溶液，混勻后，室溫下放置2小時，然后在攪拌下逐滴加入與反應(yīng)混合液等體積的飽和硫酸銨，4℃靜置1小時，3000rpm離心0.5小時，取下層沉淀物用半飽和硫酸銨洗滌兩次，將沉淀物溶于5mL0.15mol/L pH＝7.4的PBS緩沖液后裝入透析袋中，用0.15mol/L pH＝7.4的PBS緩沖液透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)10000rpm離心30min去除沉淀物，上清液即為葡萄糖氧化酶標記的單克隆抗體。

本發(fā)明的免疫分析方法通過葡萄糖氧化酶(GOD)與單克隆抗體鍵合形成酶標抗體復(fù)合物，被檢測抗原與酶標復(fù)合物特異性結(jié)合后，加入酶反應(yīng)底物葡萄糖，與GOD作用產(chǎn)生初生態(tài)活性氧，然后在催化量的HRP催化作用下，初生態(tài)活性氧與顯色劑經(jīng)顯色反應(yīng)放大信號實現(xiàn)對待測抗原的檢測。本發(fā)明通過被標記GOD和底物葡萄糖作用產(chǎn)生的初生態(tài)氧代替外源性H₂O₂，成功地避免了H₂O₂易分解不穩(wěn)定從而導(dǎo)致檢測結(jié)果穩(wěn)定性差的缺點，并且檢測結(jié)果準確、可靠。

本發(fā)明建立的免疫分析方法為夾心法酶聯(lián)免疫分析法，是一種簡便、快速且能夠高通量檢測的免疫分析方法，且在生產(chǎn)成本、運輸儲存特性、使用安全性和環(huán)保性等幾個方面均具有顯著的意義。本發(fā)明方法既可以制作成試劑盒商品化廣泛使用，也可用作公司或?qū)嶒炇易詼y樣使用，具有很高的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1是實施例1中光密度隨血管內(nèi)皮生長因子標準品濃度的對數(shù)值變化的標準曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于這些實施例。

實施例1

測定血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的含量，具體步驟如下：

1、將VEGF標準品加入0.1mol/L pH值為7.4的PBS緩沖液中，分別配制1pg/L、10pg/L、100pg/L、1000pg/L和10000pg/L的VEGF標準品溶液；將包被Anti-VEGF抗體的聚苯乙烯酶標板的各個孔分別用洗滌稀釋液(由0.05mol/L pH值為7.4的PBS緩沖液和吐溫-20組成，其中吐溫-20占洗滌緩沖液質(zhì)量的0.05％)洗滌后拍干(1次)，分別設(shè)空白孔(空白孔不加待測樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔，在標準孔中分別加入50μL濃度為1pg/L、10pg/L、100pg/L、1000pg/L和10000pg/L的VEGF標準品溶液，待測樣品孔中先加40μL 0.1mol/L pH為7.4的PBS緩沖液，然后再加10μL血清樣本(待測樣品最終稀釋度為5倍)，37℃溫育1小時，棄去酶標板中液體，拍干，隨后用洗滌緩沖液(由pH值為7.4的PBS緩沖液和吐溫-20組成，其中吐溫-20占洗滌緩沖液質(zhì)量的0.1％)洗滌酶標板并拍干(3次)。

2、將葡萄糖氧化酶標記的單克隆抗體(Recombinant人VEGF 165A protein)加入0.1mol/L pH值為7.4的PBS緩沖液中，配制成0.038U/mL的溶液，在每個標準孔和待測樣品孔中各加入50μL該溶液，空白孔除外，37℃溫育1小時，棄去酶標板中液體，拍干，隨后用洗滌緩沖液(與步驟1相同)洗滌酶標板并拍干(3次)。

3、在每個標準孔、待測樣品孔、空白孔中均加入50μL 1mol/L的葡萄糖水溶液，30℃反應(yīng)10分鐘，再加入50μL 0.005mol/L 4-氨基安替比林水溶液和50μL0.004mol/L N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽水溶液、10μL 40U/mL HRP水溶液，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘；采用酶標儀，以空白孔調(diào)零，在555nm波長下分別測量各個孔的光密度，以VEGF標準品濃度的對數(shù)值(lgC)為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制光密度隨VEGF標準品濃度的對數(shù)值變化的標準曲線(結(jié)果見圖1)，其檢出限為3.24×10^-4ng/L。

4、根據(jù)上述步驟1～3得到的待測樣品孔對應(yīng)的光密度，結(jié)合標準曲線的線性方程，計算出血清樣本中VEGF的含量為5.30ng/L，再乘以稀釋倍數(shù)，即為待測樣品的實際含量。