本發(fā)明屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水解酶活性的熒光檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

水解酶是催化水解反應(yīng)的一類酶的總稱，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物及微生物中。簡(jiǎn)便、快速和靈敏地檢測(cè)水解酶的活性，對(duì)于疾病的早期診斷、療效觀察和預(yù)后監(jiān)測(cè)具有極其重要的意義。

目前，對(duì)于水解酶的活性測(cè)定多采用熒光分析法和比色分析法。其中，熒光分析法是基于溶液中物質(zhì)的熒光強(qiáng)度變化來對(duì)物質(zhì)含量進(jìn)行定量分析的方法，具有檢測(cè)成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高等優(yōu)良特性。以堿性磷酸酶為例，目前可用于其活性測(cè)定的熒光分析方法有以下兩類：(1)基于聚合誘導(dǎo)發(fā)光的原理，堿性磷酸酶將水溶性的磷酸-四苯乙烯水解生成不溶于水的四苯乙烯，四苯乙烯聚合后會(huì)產(chǎn)生熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)堿性磷酸酶的熒光分析，但是該方法存在選擇性差，靈敏度低和抗干擾能力不足等缺陷(1.Gu X,et al.(2013).A new fluorometric turn-on assay for alkaline phosphatase and inhibitor screening based on aggregation and deaggregation of tetraphenylethylene molecules[J].Analyst,138(8):2427-2431；2.Liang J,et al.(2013).Fluorescent light-up probe with aggregation-induced emission characteristics for alkaline phosphatase sensing and activity study[J].ACS Applied Materials&Interfaces,5(17):8784-8789.)；(2)以碳量子點(diǎn)作為熒光探針，碳量子點(diǎn)表面富集的羧基基團(tuán)被引發(fā)聚集時(shí)可導(dǎo)致熒光的猝滅，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)堿性磷酸酶的熒光分析，然而該方法存在檢測(cè)成本高，抗干擾能力差和可能具有毒性等缺陷(1.Qian Z,et al.(2015).Carbon quantum dots-based recyclable real-time fluorescence assay for alkaline phosphatase with adenosine triphosphate as substrate[J].Analytical Chemistry,87(5):2966-2973；2.Qian Z S,et al.(2015).A real-time fluorescent assay for the detection of alkaline phosphatase activity based on carbon quantum dots[J].Biosensors and Bioelectronics,68:675-680.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種水解酶活性的熒光檢測(cè)方法，該方法基于熒光分析測(cè)定水解酶活性，靈敏度高，選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)，可重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，成本低廉，可用于水解酶活性的臨床檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種水解酶活性的熒光檢測(cè)方法，包括以下步驟：將含有底物和Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液與待測(cè)水解酶溶液孵育，生成Cu⁺-浴銅靈二磺酸絡(luò)合物，測(cè)定反應(yīng)液在402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，根據(jù)熒光發(fā)射強(qiáng)度與水解酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系，計(jì)算得到待測(cè)水解酶溶液中水解酶的活性；所述的底物為非還原性底物，與待測(cè)水解酶反應(yīng)生成還原性產(chǎn)物。

所述的Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針由Cu²⁺和浴銅靈二磺酸混合制備。

所述的水解酶選自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、堿性磷酸酶、中性磷酸酶或酸性磷酸酶。

所述的水解酶為α-半乳糖苷酶時(shí)，底物可以是對(duì)氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷。

所述的水解酶為β-半乳糖苷酶時(shí)，底物可以是對(duì)氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷。

所述的水解酶為α-葡萄糖苷酶時(shí)，底物可以是對(duì)氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷。

所述的水解酶為β-葡萄糖苷酶時(shí)，底物可以是對(duì)氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

所述的水解酶為α-甘露糖苷酶時(shí)，底物可以是對(duì)氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷。

所述的水解酶為β-甘露糖苷酶時(shí)，底物可以是對(duì)氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷。

所述的水解酶為堿性磷酸酶時(shí)，底物可以是抗壞血酸-2-磷酸。

所述的水解酶為中性磷酸酶時(shí)，底物可以是抗壞血酸-2-磷酸。

所述的水解酶為酸性磷酸酶時(shí)，底物可以是抗壞血酸-2-磷酸。

本發(fā)明的水解酶活性的熒光檢測(cè)方法，底物不具有還原性，不能還原Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，底物在水解酶的作用下能夠生成還原性產(chǎn)物，產(chǎn)生的還原性產(chǎn)物能將Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針還原成Cu⁺-浴銅靈二磺酸絡(luò)合物。在含有底物和Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液與待測(cè)水解酶溶液孵育過程中，底物與水解酶反應(yīng)生成還原性產(chǎn)物，還原性產(chǎn)物將Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針還原成Cu⁺-浴銅靈二磺酸絡(luò)合物，導(dǎo)致檢測(cè)液在402nm處的熒光發(fā)射信號(hào)下降。本發(fā)明通過測(cè)定反應(yīng)液在402nm的熒光強(qiáng)度，最終根據(jù)熒光強(qiáng)度與水解酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系，得到待測(cè)水解酶溶液中水解酶的活性。

本發(fā)明只需一步操作即可實(shí)現(xiàn)對(duì)水解酶活性的測(cè)定，熒光探針制備過程極其簡(jiǎn)單，具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、水溶性好和生物相容性好等優(yōu)良特性。本發(fā)明的熒光檢測(cè)方法具有靈敏度高，選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)，可重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床樣品中水解酶活性的快速、高靈敏檢測(cè)，極大地降低了檢測(cè)成本。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中含有不同組分的檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜圖，其中，a為不加堿性磷酸酶，b為不加抗壞血酸-2-磷酸，c為不加浴銅靈二磺酸，d為不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，e為所有試劑都加。

圖2是實(shí)施例2中熒光發(fā)射強(qiáng)度與堿性磷酸酶活性之間的關(guān)系曲線圖。

圖3是實(shí)施例3中含有不同蛋白質(zhì)樣品的檢測(cè)液在402nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度的比較圖，其中，a為堿性磷酸酶，b為酸性磷酸酶，c為人血清蛋白酶，d為胰蛋白酶，e為凝血酶，f為血紅蛋白，g為空白對(duì)照。

圖4是實(shí)施例4中熒光發(fā)射強(qiáng)度與血清樣品體積之間的關(guān)系曲線圖。

圖5是實(shí)施例5中含有不同組分的檢測(cè)液的熒光發(fā)射強(qiáng)度光譜圖，其中，a為不加α-半乳糖苷酶，b為不加對(duì)氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷，c為不加浴銅靈二磺酸，d為不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，e為所有試劑都加。

圖6是實(shí)施例6中含有不同組分的檢測(cè)液的熒光發(fā)射強(qiáng)度光譜圖，其中，a為不加β-半乳糖苷酶，b為不加對(duì)氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，c為不加浴銅靈二磺酸，d為不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，e為所有試劑都加。

圖7是實(shí)施例7中含有不同組分的檢測(cè)液的熒光發(fā)射強(qiáng)度光譜圖，其中，a為不加α-葡萄糖苷酶，b為不加對(duì)氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，c為不加浴銅靈二磺酸，d為不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，e為所有試劑都加。

圖8是實(shí)施例8中含有不同組分的檢測(cè)液的熒光發(fā)射強(qiáng)度光譜圖，其中，a為不加β-葡萄糖苷酶，b為不加對(duì)氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，c為不加浴銅靈二磺酸，d為不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，e為所有試劑都加。

圖9是實(shí)施例9中含有不同組分的檢測(cè)液的熒光發(fā)射強(qiáng)度光譜圖，其中，a為不加α-甘露糖苷酶，b為不加對(duì)氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷，c為不加浴銅靈二磺酸，d為不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，e為所有試劑都加。

圖10是實(shí)施例10中含有不同組分的檢測(cè)液的熒光發(fā)射強(qiáng)度光譜圖，其中，a為不加β-甘露糖苷酶，b為不加對(duì)氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷，c為不加浴銅靈二磺酸，d為不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，e為所有試劑都加。

圖11是實(shí)施例11中含有不同組分的檢測(cè)液的熒光發(fā)射強(qiáng)度光譜圖，其中，a為不加中性磷酸酶，b為不加抗壞血酸-2-磷酸，c為不加浴銅靈二磺酸，d為不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，e為所有試劑都加。

圖12是實(shí)施例12中含有不同組分的檢測(cè)液的熒光發(fā)射強(qiáng)度光譜圖，其中，a為不加酸性磷酸酶，b為不加抗壞血酸-2-磷酸，c為不加浴銅靈二磺酸，d為不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針，e為所有試劑都加。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。

實(shí)施例1

本發(fā)明方法用于檢測(cè)堿性磷酸酶活性的可行性分析實(shí)驗(yàn)。

將20μL 0.05mg mL^-1堿性磷酸酶樣品加入到2980μL含有2mM抗壞血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

在可行性分析實(shí)驗(yàn)中，所缺組分用相同體積的緩沖液替代。從圖1可以看出，在檢測(cè)液中不加堿性磷酸酶(a)或底物(b)時(shí)，檢測(cè)液在402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度較強(qiáng)；在檢測(cè)液中不加浴銅靈二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針(d)或所有組分都存在的情況下(e)時(shí)，在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度很弱。由此可見，本發(fā)明的熒光方法可用于檢測(cè)堿性磷酸酶的活性。

實(shí)施例2

本發(fā)明方法用于檢測(cè)堿性磷酸酶活性的熒光發(fā)射強(qiáng)度與堿性磷酸酶活性之間的關(guān)系。

將20μL的濃度為0，20，40，60，80，100，120，140，160，180和220mU mL^-1的堿性磷酸酶樣品分別加入到2980μL含有2mM抗壞血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

從圖2可以看出，隨著樣品中堿性磷酸酶活性的增加，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度相應(yīng)減弱，且熒光發(fā)射強(qiáng)度與堿性磷酸酶活性具有很好的定量關(guān)系。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用于樣品中堿性磷酸酶活性的定量測(cè)定。

實(shí)施例3

本發(fā)明方法用于檢測(cè)堿性磷酸酶活性的選擇性。

將20μL 0.05mg mL^-1的堿性磷酸酶或20μL 0.5mg mL^-1的其他蛋白質(zhì)溶液加入到2980μL含有2mM抗壞血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。

從圖3可以看出，與空白對(duì)照相比，雖然其他蛋白質(zhì)的濃度為堿性磷酸酶濃度的10倍，但是只有當(dāng)加入堿性磷酸酶時(shí)，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度才會(huì)顯著下降。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法用于檢測(cè)堿性磷酸酶活性時(shí)具有很高的選擇性。

實(shí)施例4

本發(fā)明方法用于檢測(cè)堿性磷酸酶活性時(shí)在血清樣品中的檢測(cè)性能。

分別將4，8，12，16和20μL的正常人血清樣品分別加入到含有2mM抗壞血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

從圖4可以看出，隨著血清樣品體積的增加，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度相應(yīng)下降，且熒光發(fā)射強(qiáng)度與血清樣品的體積具有很好的定量關(guān)系。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用于血清樣品中堿性磷酸酶活性的定量測(cè)定，因此具有很好的實(shí)用性。

實(shí)施例5

本發(fā)明方法用于檢測(cè)α-半乳糖苷酶活性的可行性分析實(shí)驗(yàn)。

將20μL 0.01mg mL^-1α-半乳糖苷酶樣品入到2980μL含有2mM對(duì)氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

在可行性分析實(shí)驗(yàn)中，所缺組分用相同體積的緩沖液替代。從圖5可以看出，在檢測(cè)液中不加α-半乳糖苷酶(a)或底物(b)時(shí)，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度較強(qiáng)；在檢測(cè)液中不加浴銅靈二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針(d)或所有組分都存在的情況下(e)時(shí)，在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度很弱。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用于檢測(cè)α-半乳糖苷酶的活性。

實(shí)施例6

本發(fā)明方法用于檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性的可行性分析實(shí)驗(yàn)。

將20μL 0.01mg mL^-1β-半乳糖苷酶樣品加入到2980μL含有2mM對(duì)氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

在可行性分析實(shí)驗(yàn)中，所缺組分用相同體積的緩沖液替代。從圖6可以看出，在檢測(cè)液中不加β-半乳糖苷酶(a)或底物(b)時(shí)，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度較強(qiáng)；在檢測(cè)液中不加浴銅靈二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針(d)或所有組分都存在的情況下(e)時(shí)，在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度很弱。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用于檢測(cè)β-半乳糖苷酶的活性。

實(shí)施例7

本發(fā)明方法用于檢測(cè)α-葡萄糖苷酶活性的可行性分析實(shí)驗(yàn)。

將20μL 0.05mg mL^-1α-葡萄糖苷酶樣品加入到2980μL含有2mM對(duì)氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

在可行性分析實(shí)驗(yàn)中，所缺組分用相同體積的緩沖液替代。從圖7可以看出，在檢測(cè)液中不加α-葡萄糖苷酶(a)或底物(b)時(shí)，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度較強(qiáng)；在檢測(cè)液中不加浴銅靈二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針(d)或所有組分都存在的情況下(e)時(shí)，在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度很弱。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用于檢測(cè)α-葡萄糖苷酶的活性。

實(shí)施例8

本發(fā)明方法用于檢測(cè)β-葡萄糖苷酶活性的可行性分析實(shí)驗(yàn)。

將20μL 0.05mg mL^-1β-葡萄糖苷酶樣品加入到2980μL含有2mM對(duì)氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

在可行性分析實(shí)驗(yàn)中，所缺組分用相同體積的緩沖液替代。從圖8可以看出，在檢測(cè)液中不加β-葡萄糖苷酶(a)或底物(b)時(shí)，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度較強(qiáng)；在檢測(cè)液中不加浴銅靈二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針(d)或所有組分都存在的情況下(e)時(shí)，在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度很弱。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用于檢測(cè)β-葡萄糖苷酶的活性。

實(shí)施例9

本發(fā)明方法用于檢測(cè)α-甘露糖苷酶活性的可行性分析實(shí)驗(yàn)。

將20μL 0.01mg mL^-1α-甘露糖苷酶樣品加入到2980μL含有2mM對(duì)氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

在可行性分析實(shí)驗(yàn)中，所缺組分用相同體積的緩沖液替代。從圖9可以看出，在檢測(cè)液中不加α-甘露糖苷酶(a)或底物(b)時(shí)，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度較強(qiáng)；在檢測(cè)液中不加浴銅靈二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針(d)或所有組分都存在的情況下(e)時(shí)，在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度很弱。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用于檢測(cè)α-甘露糖苷酶的活性。

實(shí)施例10

本發(fā)明方法用于檢測(cè)β-甘露糖苷酶活性的可行性分析實(shí)驗(yàn)。

將20μL 0.01mg mL^-1β-甘露糖苷酶樣品加入到2980μL含有2mM對(duì)氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

在可行性分析實(shí)驗(yàn)中，所缺組分用相同體積的緩沖液替代。從圖10可以看出，在檢測(cè)液中不加β-甘露糖苷酶(a)或底物(b)時(shí)，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度較強(qiáng)；在檢測(cè)液中不加浴銅靈二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針(d)或所有組分都存在的情況下(e)時(shí)，在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度很弱。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用于檢測(cè)β-甘露糖苷酶的活性。

實(shí)施例11

本發(fā)明方法用于檢測(cè)中性磷酸酶活性的可行性分析實(shí)驗(yàn)。

將20μL 0.05mg mL^-1中性磷酸酶樣品加入到2980μL含有2mM抗壞血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

在可行性分析實(shí)驗(yàn)中，所缺組分用相同體積的緩沖液替代。從圖11可以看出，在檢測(cè)液中不加中性磷酸酶(a)或底物(b)時(shí)，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度較強(qiáng)；在檢測(cè)液中不加浴銅靈二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針(d)或所有組分都存在的情況下(e)時(shí)，在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度很弱。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用檢測(cè)中性磷酸酶的活性。

實(shí)施例12

本發(fā)明方法用于檢測(cè)酸性磷酸酶活性的可行性分析實(shí)驗(yàn)。

將20μL 0.05mg mL^-1酸性磷酸酶樣品加入到2980μL含有2mM抗壞血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針的檢測(cè)液中，在25℃下孵育15min后，記錄檢測(cè)液的熒光發(fā)射光譜。

在可行性分析實(shí)驗(yàn)中，所缺組分用相同體積的緩沖液替代。從圖12可以看出，在檢測(cè)液中不加酸性磷酸酶(a)或底物(b)時(shí)，檢測(cè)液在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度較強(qiáng)；在檢測(cè)液中不加浴銅靈二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴銅靈二磺酸熒光探針(d)或所有組分都存在的情況下(e)時(shí)，在～402nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度很弱。由此可見，本發(fā)明的熒光分析方法可用于檢測(cè)酸性磷酸酶的活性。