本發(fā)明屬于食品貯藏和保鮮領(lǐng)域，涉及綠色蔬菜采后新鮮度的熒光檢測方法。
背景技術(shù)：
葉菜類蔬菜在采后很快會(huì)發(fā)生一系列的變化，如發(fā)黃、萎蔫、腐爛等，保質(zhì)期很短。這使蔬菜在運(yùn)送及貯藏過程中，損耗和成本大大增加。目前已有通過檢測蔬菜品質(zhì)變化，以及利用這些檢測參數(shù)變化來篩選保鮮方法，從而確定新鮮度和選出最佳的蔬菜采后保鮮處理方式。蔬菜新鮮度一般使用感官打分來確定，但其缺少精確數(shù)據(jù)，因此也常常使用理化檢測方法，例如常用丙酮提取蔬菜葉綠素，用水提取維生素c、可溶性蛋白后添加顯色劑，再使用可見光比色法測定其含量。
近年來，隨著無損檢測技術(shù)的發(fā)展，人們使用葉綠素?zé)晒鈨x測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)fm/fo、fv/fm等，還有基于細(xì)胞atp含量光譜的無損檢測技術(shù)，利用高光譜成像技術(shù)測定蔬菜外觀形態(tài)和內(nèi)部葉綠素的變化等，來反映蔬菜的新鮮度。但是這些測定參數(shù)在蔬菜采后的初期變化較小，一般與外觀變化同步，或者稍微早于外觀變化，其主要是有利于定量。很多保鮮處理試驗(yàn)，需要處理后蔬菜貯藏較長時(shí)間，才能比較出處理和對照的差異。
因此，開發(fā)出保鮮處理后品質(zhì)的早期評價(jià)指標(biāo)，將有利于加快研究速度，提高研究效率。利用熒光技術(shù)來研究青菜衰老過程中的早期變化，并尋找比常規(guī)檢測指標(biāo)變化更早的指標(biāo)，有利于未來蔬菜新鮮度的評估和保鮮方法的快速篩選。目前國內(nèi)外未見使用基于特定激發(fā)和發(fā)射熒光波長和強(qiáng)度來檢測蔬菜新鮮度的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能早期和較高區(qū)分度的指標(biāo)來檢測青菜采后新鮮度的熒光檢測方法。
為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：
提供一種青菜新鮮度的熒光檢測方法，包括以下步驟：
(1)取青菜外葉，剪成長條狀后，冷凍干燥；
(2)取0.1g凍干的青菜葉，加入5ml煮沸的乙醇后研磨5min后，再轉(zhuǎn)入離心管中靜置10min，在4℃和4000×g條件下離心15min；沉淀物中加5ml乙醇，重復(fù)提取和離心，合并上清液；提取和離心操作共三次，總共使用15ml乙醇；
(3)在熒光分光光度計(jì)的樣品室中注入5ml上清液，設(shè)定激發(fā)波長255nm、發(fā)射波長347nm，讀取發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度，并根據(jù)其數(shù)值判斷青菜新鮮度：
青菜在25℃下貯藏時(shí)，
如熒光強(qiáng)度為0.2a.u.以下時(shí)，表明是剛采收的青菜；
如熒光強(qiáng)度為0.2-0.3a.u.時(shí)，表明是采收后第1天內(nèi)的青菜；
如熒光強(qiáng)度為0.3-1.08a.u.時(shí)，表明是采收后第2天內(nèi)的青菜；
如熒光強(qiáng)度為1.08-2.86a.u.時(shí)，表明是采收后第3天內(nèi)的青菜；
如熒光強(qiáng)度為2.86-8.70a.u.時(shí)，表明是采收后第4天內(nèi)的青菜；
如熒光強(qiáng)度超過8.70a.-u.時(shí)，表明青菜樣品已采收超過4天以上。
本發(fā)明中，步驟(1)中，將青菜外葉剪成寬0.3cm、長1.0cm的長條狀。
發(fā)明原理描述：
隨著青菜葉片的衰老，某些降解物在特定波長下能發(fā)射特定波長的熒光，該波長的熒光強(qiáng)度隨著葉片的衰老迅速增強(qiáng)，能有效用來即時(shí)評估青菜采后的新鮮度，也可用于保鮮技術(shù)是否具有延緩青菜衰老進(jìn)行早期快速評判。本發(fā)明提供使用特定激發(fā)波長和發(fā)射波長的熒光來檢測青菜衰老，其發(fā)射波長的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著青菜衰老而急速增加。以該熒光激發(fā)和發(fā)射波長，建立起青菜新鮮度的檢測方法的靈敏度會(huì)比葉綠素含量變化高1.5倍(早期)，136倍(后期)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明采用一種簡單快速的熒光檢測方法，建立了青菜新鮮度的新的評估指標(biāo)。相比傳統(tǒng)的理化檢測和無損檢測，其能夠發(fā)現(xiàn)和區(qū)分青菜早期的衰老程度，并且靈敏度也得到極大提高。可以用于青菜新鮮度的檢測，以及保鮮處理方法的快速篩選。
附圖說明
圖1中是青菜衰老過程中乙醇提取物的熒光強(qiáng)度變化曲線(激發(fā)波長255nm)。
具體實(shí)施方式
(1)青菜葉片衰老過程的熒光檢測方法建立
挑選新鮮青菜分裝于0.04mm厚度的聚乙烯薄膜袋中貯藏，袋上每平方分米扎有10個(gè)直徑為0.5mm均勻小孔，常溫(25±2℃)貯藏。分別測定第0d，1d，2d，3d，4d，5d，6d青菜外葉，測定重復(fù)3次。
青菜乙醇提取液制備：取青菜外葉剪碎，寬度和長度為0.3cm和1.0cm左右。冷凍干燥，取0.1g，加入煮沸的乙醇5ml研磨5min，轉(zhuǎn)入離心管中靜置10min，在4000×g4℃下離心15min，沉淀物加5ml乙醇，重復(fù)提取和離心?？傆?jì)三次。合并上清液，取5ml上清液，使用rf-5301pc熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光測定。
最佳發(fā)射波長選擇：由于目前未見有文獻(xiàn)報(bào)道熒光掃描葉菜的最佳激發(fā)波長，且多數(shù)化合物沒有熒光特性，只有具有苯環(huán)和共軛雙鍵的物質(zhì)具有熒光，因此激發(fā)光源一般為短波紫外線激發(fā)熒光(激發(fā)波長為254nm，用于檢測含有苯環(huán)的有機(jī)化合物)和長波紫外線激發(fā)熒光(激發(fā)波長為365nm，用于檢測3個(gè)苯環(huán)共軛的恩醌類化合物)，故選擇254nm和365nm作為初始的激發(fā)波長進(jìn)行發(fā)射光譜的掃描。發(fā)現(xiàn)使用兩種激發(fā)波長，新鮮青菜都只有兩個(gè)發(fā)射波長峰，分別是515nm和693nm?？勺鳛榘l(fā)射波長來篩選最佳激發(fā)波長。衰老青菜使用365nm激發(fā)波長，只有兩個(gè)發(fā)射波長峰，分別是515nm和693nm。但是選擇254nm激發(fā)波長時(shí)，有三個(gè)發(fā)射波長峰，分別是347nm、515nm和693nm。顯然發(fā)射波長347nm的熒光強(qiáng)度不斷增加是衰老引起的。
最佳激發(fā)波長選擇：347nm作為發(fā)射波長，在小于發(fā)射波長的范圍內(nèi)掃描，尋找最強(qiáng)激發(fā)波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在255nm處有最高峰值，故采用255nm作為激發(fā)波長來掃描發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)發(fā)射波長為347nm時(shí)，熒光強(qiáng)度變化最靈敏。因此選擇該條件，來測量青菜衰老過程中乙醇提取物的熒光強(qiáng)度變化。見圖1。
青菜衰老過程中熒光強(qiáng)度的變化：讀出激發(fā)波長255nm，發(fā)射波長347nm處峰值的熒光強(qiáng)度。
(2)青菜葉片新鮮度的熒光檢測方法建立
對青菜外觀品質(zhì)變化進(jìn)行打分，對青菜葉片葉綠素含量進(jìn)行測定，并與青菜葉片熒光檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，獲得新的青菜新鮮度的熒光參數(shù)指標(biāo)。
外觀品質(zhì)變化：采用十分制評定方法。
10分：田間剛采后青菜，外葉綠色飽滿，沒有腐爛。8分：外葉綠色稍淡，仍然較新鮮，沒有腐爛。6分：外葉輕微變黃，沒有腐爛。4分：外葉一半面積以內(nèi)變黃，或有輕微腐爛。2分：外葉完全變黃，或有輕度腐爛。0分：外葉、中葉完全變黃，或外葉大面積腐爛。其中，尚新鮮青菜臨界點(diǎn)為7.5分，青菜可售臨界為5.5分。
葉綠素含量測定：采用可見光比色法。
將青菜葉片剪成細(xì)條狀混合，取0.2g放入25ml試管中，加入8ml乙醇-丙酮溶液(乙醇：丙酮＝1：1)，放入-20℃冰箱中冷凍2h后，拿出放入常溫下、黑暗中浸提16h。此后，取1ml浸提液加4ml乙醇-丙酮溶液(乙醇：丙酮＝1：1)，在645nm和663nm處比色，并計(jì)算葉綠素含量。
在衰老0d-1d，青菜外觀看不出變化，2d青菜外葉綠色稍微變淡，稍有失水萎焉，但仍然較新鮮，能夠看出與剛采收時(shí)候的差異。此后青菜進(jìn)一步變黃和萎焉，在4d時(shí)青菜外葉已經(jīng)失去商品價(jià)值。見表1。
青菜外葉的葉綠素含量與感官品質(zhì)有很高的相關(guān)性(r2＝0.982)，說明青菜葉片的外觀品質(zhì)變化與葉綠素的降解基本同步。葉綠素含量在0d-2d內(nèi)稍有下降，但是沒有顯著差異。在3d和4d時(shí)，其含量分別為1.41mg/gfw(p<0.05)和1.12mg/gfw(p<0.05)顯著低于0d的1.71mg/gfw。其前期差異小，可能是葉綠素降解中間產(chǎn)物脫鎂葉綠素a和脫植基葉綠素a在600-700nm處均有較大吸收波長，對663nm和645nm吸收峰有干擾。見表1。
使用激發(fā)波長255nm，發(fā)射波長347nm時(shí)，0d青菜的熒光強(qiáng)度為0.20a.u.，1d升高到0.3a.u.，2d時(shí)顯著上升到1.08a.u.，此后一直上升，到6d上升到26.89a.u.。347nm發(fā)射峰值與青菜外觀品質(zhì)呈現(xiàn)高度負(fù)相關(guān)(r2＝-0.919)，與葉綠素含量變化同樣呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r2＝-0.894)。說明使用該發(fā)射熒光峰值來評估青菜新鮮度是可行的。見表1。
表1青菜衰老過程中的感官品質(zhì)、葉綠素含量、熒光強(qiáng)度的變化
注：不同字母代表相互之間有顯著差異(p<0.05)
表2青菜衰老過程中的感官品質(zhì)、葉綠素含量、熒光強(qiáng)度變化的百分比
在0d-1d，青菜外葉熒光強(qiáng)度上升50％，而感官品質(zhì)下降0％，葉綠素含量下降2.9％，說明其在采后早期的變化比感官品質(zhì)變化和葉綠素含量變化更靈敏。在還有商品價(jià)值的3d時(shí)，其熒光強(qiáng)度變化達(dá)到1330％，而感官品質(zhì)變化25％，葉綠素變化17.5％。其靈敏度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后兩者指標(biāo)。見表2。
因此可以使用熒光分光光度計(jì)，選擇激發(fā)波長255nm，發(fā)射波長347nm，讀出發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度。青菜在25℃下貯藏時(shí)，0.1g新鮮青菜外葉干重，用15ml乙醇提取液的熒光強(qiáng)度為0.2a.u.以下，為剛采收青菜。熒光強(qiáng)度為0.2-0.3a.u.時(shí)，表明是采收后第1d內(nèi)的青菜；熒光強(qiáng)度為0.3-1.08a.u.時(shí)，表明是采收后第2d內(nèi)的青菜；熒光強(qiáng)度為1.08-2.86a.u.時(shí)，表明是采收后第3d內(nèi)的青菜；熒光強(qiáng)度為2.86-8.70a.u.時(shí)，表明是采收后第4d內(nèi)的青菜；熒光強(qiáng)度超過8.70a.-u.時(shí)，表明青菜樣品已采收超過4d以上。