本實用新型涉及微流控技術(shù)和免疫熒光技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種聯(lián)合定量檢測卡。

背景技術(shù)：

近年來因自身免疫障礙而導致的不孕問題越發(fā)引起人們的重視，抗精子抗體(AsAb)是免疫性不孕最常見的一種因素?？咕涌贵w(AsAb)是一個復雜的病理產(chǎn)物，其作用主要表現(xiàn)為精子凝集、精子制動，影響精子的運送，抑制精子穿透宮頸黏液，限制精子與卵透明帶粘附，抑制精子頂體的活性，使精子不易穿透包繞卵細胞的放射冠和透明帶，阻礙精子與卵細胞膜的融合，阻止精子與卵子結(jié)合等。

抗繆勒管激素是一種不同于睪酮的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，產(chǎn)生于包括人類在內(nèi)的所有哺乳類動物的睪丸，它能夠?qū)е驴娎展芡嘶？箍娎展芗に貙儆谵D(zhuǎn)化生長因子β超家族的一種多肽，是由兩個相同的70kb亞基組成的二聚糖蛋白，相對分子質(zhì)量為140 000。其在雄性體內(nèi)的唯一作用就是導致胎兒體內(nèi)的繆勒管退化，使其具有男性表型。當缺乏抗繆勒管激素時，繆勒管可發(fā)展成為子宮、輸卵管和陰道上部。

微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米)處理或操縱微小流體(體積為納升到阿升)的一種技術(shù)。當微通道的特征尺寸在微米甚至納米量級時，微通道表面積與其內(nèi)部空間的體積之比很大，通道的結(jié)構(gòu)、形狀和壁面性質(zhì)都將對其中的流體流動狀態(tài)產(chǎn)生極大的影響。流體在微流控的微通道中具有獨特的流體性質(zhì)，如層流和液滴等。借助這些獨特的流體現(xiàn)象，微流控可以實現(xiàn)一系列常規(guī)方法所難以完成的微加工和微操作。

免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)是免疫學方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標記技術(shù)結(jié)合，使用熒光微球標記已知的抗原或抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原(或抗體)。在檢測過程中，采用熒光微球最佳激發(fā)光源進行激發(fā)，發(fā)射出的熒光經(jīng)過濾光片后，用CCD掃描技術(shù)或光纖技術(shù)，將發(fā)射光譜收集、聚集和倍增后，轉(zhuǎn)換成數(shù)值信號，實時檢測熒光變化曲線。

目前市面上尚無抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測產(chǎn)品，單獨的抗精子抗體檢測產(chǎn)品多采用酶聯(lián)免疫吸附法和淺盤凝集法，單獨的抗繆勒管激素檢測產(chǎn)品多采用雙抗夾心ELISA方法，這些方法尚存在以下方面的不足：

酶聯(lián)免疫吸附法是采用正常精子膜抗原包被反應板，加待測標本及酶標記二抗底物顯色，陽性為明顯黃色，陰性孔不顯色。此方法無法定量檢測抗精子抗體的含量，且操作復雜，且影響因素較多，檢測結(jié)果易受外界因素的干擾。

淺盤凝集法是將微量正常精子與待測標本在淺盤中混合，鏡下觀察有無凝集。有活動的凝集精子為陽性。此方法無法定量檢測抗精子抗體的含量，且靈敏度低，且較易受到外界因素的干擾。

雙抗夾心ELISA法只能定性或者半定量檢測血液樣本中抗繆勒管激素的含量，而無法精確定量檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上現(xiàn)有技術(shù)問題，本實用新型的目的在于提供一種聯(lián)合定量檢測卡。采用微流控技術(shù)和免疫熒光技術(shù)制成包括覆有濾紙的加樣區(qū)、噴涂有不同熒光微球標記的抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體的結(jié)合區(qū)、并聯(lián)微通道時間閥、包被有抗精子二抗并具有特殊結(jié)構(gòu)的檢測區(qū)、包被有抗繆勒管激素抗體并具有特殊結(jié)構(gòu)的檢測區(qū)和廢液區(qū)的抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡。具體技術(shù)方案如下：

一種聯(lián)合定量檢測卡，包括底卡和面卡，其中，所述底卡上設有加樣區(qū)，結(jié)合區(qū)，閥，檢測區(qū)以及廢液區(qū)，所述加樣區(qū)連接結(jié)合區(qū)且加樣區(qū)與結(jié)合區(qū)位于閥的一端，所述檢測區(qū)連接廢液區(qū)且位于閥的另一端；所述面卡上設有加樣孔和檢測孔，所述底卡和面卡的背面扣合連接。

進一步地，所述加樣區(qū)覆有濾紙。

進一步地，所述檢測區(qū)包括第一檢測區(qū)和第二檢測區(qū)共兩個檢測區(qū)。

進一步地，所述閥為并聯(lián)微通道時間閥。

進一步地，所述結(jié)合區(qū)和檢測區(qū)分別設置于并聯(lián)微通道時間閥的兩端并直接連接至并聯(lián)微通道時間閥。

進一步地，所述微通道時間閥為通過軟光刻技術(shù)制成的微通道。

進一步地，兩條并聯(lián)微通道時間閥寬度均為3μm。

進一步地，所述濾紙直徑1.5cm、孔徑為1～3μm。

進一步地，所述檢測區(qū)帶有彎型通道。

上述抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的制作方法，包括如下步驟：

(1)制作底卡模板；

(2)制備不同熒光微球標記的抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體混合液；

(3)噴涂抗體混合液；

(4)包被抗體；

(5)濾紙粘覆；

(6)抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的制備。

進一步地，步驟(1)中底卡采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材質(zhì)，利用光刻機設備，經(jīng)過CAD制圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻等工藝過程來完成底卡模板的制作；和/或，步驟(2)中包括如下步驟：

(2-1)取熒光微球A加入抗精子二抗，混勻攪拌，洗滌離心，沉淀用PBS溶液復溶沉淀待用；

(2-2)取熒光微球B加入抗繆勒管激素抗體，混勻攪拌，洗滌離心，沉淀用PBS溶液復溶沉淀待用；

(2-3)將上述制備的抗精子二抗溶液和抗繆勒管激素抗體溶液按比例混合，制成抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體混合液；

和/或，步驟(3)中用噴金機將上述混合好的抗體混合液均勻噴涂至底卡模板的結(jié)合區(qū)，干燥后放于室溫干燥環(huán)境中備用；和/或，步驟(4)中用PBS調(diào)節(jié)抗精子二抗的濃度，用PBS調(diào)節(jié)抗繆勒管激素的濃度，將兩種溶液分別均勻噴涂在底卡模板的兩個檢測區(qū)內(nèi)，干燥并于室溫干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆茫缓?或，步驟(5)中，將濾紙粘覆在底卡模板的加樣區(qū)；和/或，步驟(6)中，將面卡和制備好的底卡按合，壓緊。

上述抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的使用方法，包括如下步驟：

a.平放抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡；

b.將待測血清平衡至室溫；

c.用已滅菌的一次性滴管吸取待測血清滴一滴至加樣孔；

d.立即將檢測卡放至多色熒光檢測儀中；

e.多色熒光檢測儀實時檢測熒光微球在660nm和480nm激發(fā)光源的激發(fā)下所發(fā)出的熒光數(shù)值。

與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型通過微通道控制待測樣品的流速，再利用免疫熒光技術(shù)實時檢測熒光變化曲線，再根據(jù)一定時間內(nèi)熒光變化值換算待測樣品中抗精子抗體的濃度水平值。檢測過程中，采用多色熒光檢測儀實時檢測兩種熒光微球在其最佳激發(fā)光源的激發(fā)下所發(fā)出的熒光數(shù)值，測出熒光變化曲線，對照其標準曲線，取兩點熒光值所對應的抗精子抗體的標準濃度值，通過公式即可換算出待測血清中抗精子抗體和抗繆勒管激素的含量。本實用新型靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定且定量準確。本實用新型使用的熒光微球不受外界環(huán)境的影響，因而熒光穩(wěn)定，而且通過微流控技術(shù)控制待測血液在檢測卡上的流速，為定量檢測提供了良好的條件。具體來說：

1、本實用新型采用熒光微球標記抗體。熒光微球是一種載有熒光分子的功能性微球，有比較穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)光行為，故而不易受到外界因素的干擾。

2、本實用新型采用微流控技術(shù)和免疫熒光技術(shù)，通過微通道時間閥控制待測血液在檢測卡上的流速，加上熒光微球穩(wěn)定高效的發(fā)光效率，并且采用并聯(lián)微通道的方式，以達到同時定量檢測待測血液中抗精子抗體和抗繆勒管激素含量的目的。

3、本實用新型采用檢測卡形式，只需滴一滴待測血液即可完成檢測，操作簡便，靈敏度高。

附圖說明

圖1是抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的底卡結(jié)構(gòu)示意圖

圖2是抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的面卡結(jié)構(gòu)示意圖

具體實施方式

下面根據(jù)附圖對本實用新型進行詳細描述，其為本實用新型多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。

在一個優(yōu)選實施例中，一種聯(lián)合定量檢測卡，包括底卡和面卡，其中，所述底卡上設有加樣區(qū)(11)，結(jié)合區(qū)(12)，閥，檢測區(qū)以及廢液區(qū)(16)，所述加樣區(qū)(11)連接結(jié)合區(qū)(12)且加樣區(qū)(11)與結(jié)合區(qū)(12)位于閥的一端，所述檢測區(qū)連接廢液區(qū)(16)且位于閥的另一端；所述面卡上設有加樣孔(21)和檢測孔(22)，所述底卡和面卡的背面扣合連接。

所述加樣區(qū)(11)覆有濾紙，所述檢測區(qū)包括第一檢測區(qū)(14)和第二檢測區(qū)(15)共兩個檢測區(qū)，所述閥為并聯(lián)微通道時間閥(13)，所述結(jié)合區(qū)(12)和檢測區(qū)分別設置于并聯(lián)微通道時間閥(13)的兩端并直接連接至并聯(lián)微通道時間閥(13)。

該抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡是采用聚二甲基硅氧烷(也稱硅酮彈性體或硅橡膠，PDMS)材質(zhì)制成，由底卡和面卡組成，底卡構(gòu)造包括覆有濾紙的加樣區(qū)11、噴涂有不同熒光微球標記的抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體的結(jié)合區(qū)12、并聯(lián)微通道時間閥13、包被有抗精子二抗并具有特殊結(jié)構(gòu)的檢測區(qū)14、包被有抗繆勒管激素抗體并具有特殊結(jié)構(gòu)的檢測區(qū)15和廢液區(qū)16。面卡包含加樣孔和檢測孔，面卡構(gòu)造包括加樣孔21和檢測孔22。

底卡構(gòu)造中加樣區(qū)粘覆有濾紙，濾紙直徑1.5cm、孔徑為1～3μm，底卡構(gòu)造中包含通過軟光刻技術(shù)制成的微通道，兩條并聯(lián)微通道時間閥寬度均為3μm，底卡中結(jié)合區(qū)不同熒光微球標記的抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體，底卡中檢測區(qū)帶有彎型通道的特殊結(jié)構(gòu)。

一種不同熒光微球標記的抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體混合液的方法：(1)取0.1ml熒光微球A(10mg/ml、粒徑0.51μm、激發(fā)波長660nm、發(fā)射波長690nm)加入6μl抗精子二抗，充分混勻后，室溫攪拌反應3小時，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復溶沉淀0.1ml，待用；(2)取0.1ml熒光微球B(10mg/ml、粒徑0.52μm、激發(fā)波長480nm、發(fā)射波長520nm)加入5μl抗繆勒管激素抗體，充分混勻后，室溫攪拌反應3小時，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復溶沉淀0.1ml，待用；(3)將上述制備的抗精子二抗溶液和抗繆勒管激素抗體溶液按1:1.2混合，制成抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體混合液。

0.1ml熒光微球A(10mg/ml、粒徑0.51μm、激發(fā)波長660nm、發(fā)射波長690nm)中加入6μl抗精子二抗，0.1ml熒光微球B(10mg/ml、粒徑0.52μm、激發(fā)波長480nm、發(fā)射波長520nm)加入5μl抗繆勒管激素抗體，將上述制備的抗精子二抗溶液和抗繆勒管激素抗體溶液按1:1.2混合，制成抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體混合液。

在另一個優(yōu)選實施例中，一種抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡，包括以下步驟：

抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的底卡模板的制作：采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材質(zhì)，利用光刻機設備，經(jīng)過CAD制圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻等工藝過程來完成底卡模板的制作，兩條并聯(lián)微通道時間閥寬度均為3μm。

不同熒光微球標記的抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體混合液的制備：通過兩種不同熒光微球分別標記抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體，再按特定比例混合制成不同熒光微球標記的抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體混合液。

噴涂抗體混合液：用噴金機將熒光微球標記的抗精子二抗按照6μl的量均勻噴涂至底卡模板的結(jié)合區(qū)。

包被抗體：用0.01M PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)調(diào)節(jié)抗精子二抗的濃度為0.6mg/ml，用0.01M PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)調(diào)節(jié)抗繆勒管激素的濃度為0.5mg/ml，將兩種溶液按照2μl的量分別均勻噴涂在底卡模板的兩個檢測區(qū)內(nèi)。

濾紙粘覆：將直徑為1.5cm、孔徑為1～3μm的圓形濾紙粘覆在底卡模板的加樣區(qū)。

抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的制備：將面卡和制備好的底卡按合，壓緊，再將組裝好的檢測卡裝入鋁箔袋中，加入干燥劑后封口保存，與室溫干燥環(huán)境下可保存一年。

在一個優(yōu)選實施例中：

一、抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的底卡模板的制作

本實用新型檢測卡的底卡是采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材質(zhì)，利用光刻機設備，經(jīng)過CAD制圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻等工藝過程來完成底卡模板的制作，兩條并聯(lián)微通道時間閥寬度均為3μm。

二、不同熒光微球標記的抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體混合液的制備

(1)取0.1ml熒光微球A(10mg/ml、粒徑0.51μm、激發(fā)波長660nm、發(fā)射波長690nm)加入6μl抗精子二抗，充分混勻后，室溫攪拌反應3小時，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復溶沉淀0.1ml，待用；

(2)取0.1ml熒光微球B(10mg/ml、粒徑0.52μm、激發(fā)波長480nm、發(fā)射波長520nm)加入5μl抗繆勒管激素抗體，充分混勻后，室溫攪拌反應3小時，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復溶沉淀0.1ml，待用；

(3)將上述制備的抗精子二抗溶液和抗繆勒管激素抗體溶液按1:1.2混合，制成抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體混合液。

三、噴涂抗體混合液

用噴金機將上述混合好的抗體混合液按照6μl的量均勻噴涂至底卡模板的結(jié)合區(qū)，30℃真空干燥1～2h，放于室溫干燥環(huán)境中備用。

四、包被抗體

用0.01M PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)調(diào)節(jié)抗精子二抗的濃度為0.6mg/ml，用0.01M PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)調(diào)節(jié)抗繆勒管激素的濃度為0.5mg/ml，將兩種溶液按照2μl的量分別均勻噴涂在底卡模板的兩個檢測區(qū)內(nèi)，30℃真空干燥12h，于室溫干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

五、濾紙粘覆

將直徑為1.5cm的圓形濾紙粘覆在底卡模板的加樣區(qū)。

六、抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的制備

將面卡和制備好的底卡按合，壓緊，再將組裝好的檢測卡裝入鋁箔袋中，加入干燥劑后封口保存，與室溫干燥環(huán)境下可保存一年。

如圖1所示，該抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的底卡構(gòu)造包括覆有濾紙的加樣區(qū)11、噴涂有不同熒光微球標記的抗精子二抗和抗繆勒管激素抗體的結(jié)合區(qū)12、并聯(lián)微通道時間閥13、包被有抗精子二抗并具有特殊結(jié)構(gòu)的檢測區(qū)14、包被有抗繆勒管激素抗體并具有特殊結(jié)構(gòu)的檢測區(qū)15和廢液區(qū)16。

如圖2所示，該抗精子抗體和抗繆勒管激素聯(lián)合定量檢測卡的面卡構(gòu)造包括加樣孔21和檢測孔22。

1、樣品檢測：平放檢測卡，將待測血清平衡至室溫，用已滅菌的一次性滴管吸取待測血清滴一滴至加樣孔，立即將檢測卡放至多色熒光檢測儀中。多色熒光檢測儀實時檢測熒光微球在660nm和480nm激發(fā)光源的激發(fā)下所發(fā)出的熒光數(shù)值。

2、結(jié)果分析：通過熒光分析軟件分析所測熒光的變化曲線，對照其標準曲線，得出A₁、A₂熒光值所對應的抗精子抗體的標準濃度值AsAb₂、AsAb₁以及A₁’、A₂’熒光值所對應的抗繆勒管激素的標準濃度值AMH₁、AMH₂。

AsAb₀表示待測血清中抗精子抗體的含量，AMH₀表示待測血清中抗繆勒管激素的含量，AsAb₁、AsAb₂表示A₁、A₂熒光值所對應的抗精子抗體的標準濃度值，AMH₁、AMH₂表示A₁^’、A₂^’熒光值所對應的抗繆勒管激素的標準濃度值，V表示在微通道中血清流體的流速，t₁、t₂表示AsAb₁/AMH₁、AsAb₂/AMH₂熒光值所對應的時間，根據(jù)以下公式換算出待測血清中抗精子抗體的含量：

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