本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，具體涉及一種多用途的呼吸道病毒快速檢測試劑盒及其制備方法。

發(fā)明背景

目前已證明，95％的急性上呼吸道疾病和大部分的下呼吸道疾病是由細菌外的病原引起，其中以呼吸道病毒最常見，包括呼吸道合胞病毒(RSV)A型、B型、腺病毒(ADV)、流感病毒A(FluA)、流感病毒B(FluB)、副流感病毒1(PIV1)、副流感病毒2(PIV2)、副流感病毒3(PIV3)、柯薩奇B組病毒等。其中，多種病毒具有感染力強、傳播快、潛伏期短、發(fā)病急等特點，并且近來新的致病性病毒還在不斷地被發(fā)現(xiàn)，如人類偏肺病毒、SARS病毒、高致病性禽流感病毒以及如今風靡全球的H1N1甲型流感病毒等，給臨床疾病診斷和治療造成極大的困難。

呼吸道感染是世界范圍內(nèi)低齡兒童(<5歲)死亡的首位原因，每年可造成約5百萬兒童死亡。兒童上呼吸道感染的患病次數(shù)平均為3-8次/年，下呼吸道感染率比URTI低，在1歲兒童中感染的比例約1～3％，學(xué)齡兒童至5％～10％。呼吸道病毒習(xí)慣上是指侵害呼吸道的病毒，至少涉及到8個科，200多種型別的病毒。臨床常見的可導(dǎo)致呼吸道感染的病毒有腺病毒(AdV)、甲型/乙型流感病毒(FluA和FluB)和呼吸道合胞病毒(RSV)等。

腺病毒(AdV)是一種沒有包膜的直徑為70～90nm的顆粒，線狀雙鏈DNA病毒。分為兩個屬，6個亞群(A-F)，包括51個血清型。腺病毒可通過人、水、媒介物和器械傳播,室溫條件下,腺病毒在污物中存在周期可延長至3周。腺病毒在兒童和軍營人員中更易發(fā)生感染和大規(guī)模流行,大多數(shù)嬰幼兒在出生后的5年內(nèi)至少感染過1種腺病毒株。該病毒可導(dǎo)致肺炎、發(fā)熱上呼吸道疾病、結(jié)膜炎、膀胱炎、腸胃炎等，根據(jù)感染者的免疫和心肺功能的不同可導(dǎo)致嚴重的呼吸窘迫甚至死亡。ADV感染全年散發(fā)，冬春季相對較多，陽性檢出率最高可達15％?？蓮暮粑婪置谖飿吮?、眼拭、咽拭或糞便中分離到病毒，也可采用IFT、RIA或ELISA等方法測定病毒抗原作出快速診斷，在病毒分離陽性的病人中陽性率為60％～65％，在感染后7天可出現(xiàn)中和抗體、血凝抑制抗體和補體結(jié)合抗體。用血清學(xué)方法測定抗體可明確診斷。

甲型流感病毒和乙型流感病毒(FluA和FluB)主要包括內(nèi)部的核心和外部的病毒囊膜，核心是由核蛋白卷曲包繞螺旋形RNA組成，核蛋白的抗原穩(wěn)定，很少發(fā)生變異，具有型特異性。根據(jù)核蛋白抗原性的不同，將流感病毒分甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，三型病毒具有相似的生化和生物學(xué)特征。豬和禽類可攜帶甲型流感，乙、丙型流感僅在人之間轉(zhuǎn)播。甲型和乙型流感的臨床癥狀相似，但是甲型流感病毒導(dǎo)致的住院率四倍于乙型流感病毒。乙型流感通常有肌炎及胃腸道癥狀。丙型流感很少有下呼吸道癥狀，但偶爾會造成上呼吸道疾病?？梢鸺逼鸶邿?、顯著乏力，全身肌肉酸痛，而鼻塞、流涕和噴嚏等上呼吸卡他癥狀相對較輕。本病具有自限性，但在嬰幼兒、老年人和存在心肺基礎(chǔ)疾病的患者容易并發(fā)肺炎等嚴重并發(fā)癥而導(dǎo)致死亡。一般出現(xiàn)于冬季，北半球通常在1、2月份達到高峰，南半球的流行時間較晚，熱帶地區(qū)可常年發(fā)病。世界性大流行常有2～3個流行波，一般流行3～4周會自然停止。世界衛(wèi)生組織估計北半球每年1億人感染流感，5000萬次就診，30萬次住院，主要是高危人群和老年人，每年1萬人死于流感，主要是虛弱的老年人。

呼吸道合胞病毒(RSV)是一種RNA病毒，于1950年首先從實驗室患上呼吸道感染的猩猩中分離而得，是有包膜的單股RNA病毒，直徑為120～200nm，屬于副粘病毒科的肺病毒屬，僅有1個血清型。多見于新生兒和6個月以內(nèi)的嬰兒，可由空氣飛沫和密切接觸傳播，潛伏期3～7日，傳染性強。應(yīng)用單克隆抗體可將RSV分為A、B兩個亞型,有文獻報道RSV A亞型感染起病急,病情重；B亞型感染病情相對較輕。RSV是世界各地嬰幼兒病毒性肺炎和毛細支氣管炎的主要病原體之一，嚴重威脅嬰幼兒健康，尤其是早產(chǎn)兒、先天性心臟病患兒、免疫缺陷的嬰兒和兒童易發(fā)嚴重性RSV感染。從新生兒到成年人任何年齡組都會感染合胞病毒。嬰幼兒癥狀較重，可有高熱、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表現(xiàn)為細支氣管炎及肺炎。少數(shù)病兒可并發(fā)中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年長兒童感染后，主要表現(xiàn)為上呼吸道感染。有研究表明RSV流行季節(jié)集中于每年的冬春季(11月至翌年3月，高峰出現(xiàn)在12月至翌年1月)，我國北京地、杭州、蘇州及其他溫帶國家(如日本、美國)均一致，就診的兒童患者陽性率可達42.50％。

呼吸道病毒感染是臨床最常見的疾病之一，且病原學(xué)復(fù)雜，精確的病原學(xué)分析不僅是確診依據(jù)，也是合理選擇治療方案的基礎(chǔ)。因此了解呼吸道病毒檢測手段和開展快速病毒檢測，已成為當務(wù)之急。臨床目前對于病毒感染主要是檢測機體對病毒產(chǎn)生的相關(guān)抗體，由于受機體免疫力等多種因素的影響而不能滿足臨床診斷需要。檢測呼吸道感染主要病毒，目前國內(nèi)外多采用病毒分離培養(yǎng)法、間接免疫熒光法(IF)、直接免疫熒光法、堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標法(APAAP)、生物素-鏈霉親和素-過氧化物酶法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、病毒快速檢測法、分子生物學(xué)法，如多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(mRT-PCR)、巢式PCR及核酸雜交、多重實時PCR、基因芯片技術(shù)、懸浮陣列技術(shù)等多種檢測手段。

但是上述檢測方法均需要特殊的儀器設(shè)備和專業(yè)培訓(xùn)人員，并且在實驗室才能進行檢測，費用高昂、操作復(fù)雜，耗時長，不適于臨床篩查，更不適宜于現(xiàn)場即時檢測。例如病毒培養(yǎng)是病毒檢測的金標準，但這種檢測方法周期很長，一般要3～7天的時間，靈敏度不高。

RT-PCR能夠4-8小時內(nèi)對樣本實現(xiàn)檢測，且靈敏度和特異性很高，但是并不適于在機場、口岸、火車站、醫(yī)院等人口密度大、人流量大、不易讓人群長時間聚集的公共場所。

因此，目前臨床上急需建立一種快速、簡便、高效，能夠一次同時鑒定多種病毒并能廣泛推廣的快速呼吸道病毒檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測呼吸道病毒的膠體金法檢測試紙及其制備方法。采用本發(fā)明的試紙條或試劑盒，可通過一次操作實現(xiàn)快速檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)，從而簡化操作過程，實現(xiàn)快速檢測的目的。

本發(fā)明所述用于檢測呼吸道病毒的膠體金法檢測試紙，所述試紙包括樣品墊、含有膠體金顆粒標記物的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙，其中樣品墊、含有膠體金顆粒標記物的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙順次搭接粘貼在底板上，所述硝酸纖維素膜包括包被有甲型流感病毒抗體的檢測區(qū)、包被有乙型流感病毒抗體的檢測區(qū)、包被有呼吸道合胞病毒抗體的檢測區(qū)、包被有腺病毒抗體的檢測區(qū)和包被有抗鼠免疫球蛋白抗體的控制區(qū)，所述膠體金顆粒標記物包括膠體金標記抗腺病毒抗體、膠體金標記抗呼吸道合胞病毒抗體、膠體金標記甲型流感病毒抗體和膠體金標記乙型流感毒抗體。

本發(fā)明所述的膠體金法檢測試紙的原理為：將待測樣品滴入檢測試劑板的樣品墊后，玻璃纖維膜上的膠體金顆粒標記物被溶解。若樣品中存在呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)中任一種或其任意組合，則膠體金顆粒標記物分別與樣品中的相應(yīng)病毒抗原形成免疫復(fù)合體。該免疫復(fù)合體因毛細管作用在硝酸纖維素膜中移動，被硝酸纖維素膜相應(yīng)檢測區(qū)中固定化的甲型流感病毒抗體、乙型流感病毒抗體、呼吸道合胞病毒抗體或腺病毒抗體捕捉，因膠體金的作用形成紫紅色條帶。本試紙的紫紅色條帶可以目測確認，判斷樣品中是否存在腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒或乙型流感病毒中的任一種或其任意組合。應(yīng)注意的是，檢測區(qū)固定的抗體與相對應(yīng)同一病毒的膠體金標記的抗體為不同的抗體，例如來源于不同的公司、用不同的方法制備、種屬不同或者針對同一病毒但結(jié)合位點不同的抗體，優(yōu)選的是兩者為針對同一病毒但結(jié)合位點不同的抗體，這樣可以保證膠體金標記免疫復(fù)合體因毛細管作用在硝酸纖維素膜中移動時被相應(yīng)檢測區(qū)中固定化的抗體所識別。

另一方面，無論樣品中是否存在腺病毒、呼吸道合胞病毒抗原、甲型流感病毒或乙型流感病毒中的任一種或其任意組合，剩余的膠體金標記抗體繼續(xù)在硝酸纖維素膜移動，在控制區(qū)被固定化的抗鼠免疫球蛋白抗體捕捉，因膠體金而形成紫紅色條帶。這顯示了膠體金標記抗體的正常移動。

優(yōu)選的，檢測試紙中玻璃纖維膜上的膠體金標記抗腺病毒抗體、膠體金標記抗呼吸道合胞病毒抗體、膠體金標記甲型流感病毒抗體和膠體金標記乙型流感毒抗體的用量分別為25-45μg/cm²，更優(yōu)選為30-36μg/cm²。

優(yōu)選的，檢測試紙中硝酸纖維素膜上檢測區(qū)含有的甲型流感病毒抗體、乙型流感病毒抗體、呼吸道合胞病毒抗體和腺病毒抗體的用量為0.1-0.5μg/mm，更優(yōu)選為0.2-0.3μg/mm。

優(yōu)選的，檢測試紙中硝酸纖維素膜上控制區(qū)含有的抗鼠免疫球蛋白抗體的用量為0.1-0.5μg/mm，更優(yōu)選為0.3-0.4μg/mm。

本發(fā)明檢測試紙中所述的甲型流感病毒抗體、乙型流感病毒抗體、呼吸道合胞病毒抗體和腺病毒抗體均為鼠源抗體，更優(yōu)選為鼠源單克隆抗體。

本發(fā)明檢測試紙中所述的抗鼠免疫球蛋白抗體可以為兔抗鼠免疫球蛋白抗體、羊抗鼠免疫球蛋白抗體或駝羊抗鼠免疫球蛋白抗體，優(yōu)選為羊抗鼠免疫球蛋白抗體。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測呼吸道病毒的膠體金法檢測試紙的制備方法，包括如下步驟：

(1)采用化學(xué)還原法制備膠體金溶液，將抗腺病毒抗體、抗甲型流感病毒抗體和抗乙型流感病毒抗體和抗呼吸道合胞病毒抗體分別加入到膠體金溶液中，將制備得到膠體金-抗體顆粒標記物均勻的結(jié)合在玻璃纖維素膜上，冷凍干燥；

(2)將包被有甲型流感病毒抗體、乙型流感病毒抗體、呼吸道合胞病毒抗體、腺病毒抗體和抗鼠免疫球蛋白抗體的緩沖液分別噴灑于硝酸纖維素膜上形成檢測線和質(zhì)控線，充分干燥；

(3)在底板的一面順次相互搭接地粘附樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙，即得檢測試紙。

上述方法中，檢測試紙中玻璃纖維膜上的膠體金標記抗腺病毒抗體、膠體金標記抗呼吸道合胞病毒抗體、膠體金標記甲型流感病毒抗體和膠體金標記乙型流感毒抗體的用量分別為25-45μg/cm²，更優(yōu)選為30-36μg/cm²。

上述方法中，檢測試紙中硝酸纖維素膜上檢測區(qū)含有的甲型流感病毒抗體、乙型流感病毒抗體、呼吸道合胞病毒抗體和腺病毒抗體的用量為0.1-0.5μg/mm，更優(yōu)選為0.2-0.3μg/mm。

上述方法中，檢測試紙中硝酸纖維素膜上控制區(qū)含有的抗鼠免疫球蛋白抗體的用量為0.1-0.5μg/mm，更優(yōu)選為0.3-0.4μg/mm。

上述方法中，檢測試紙中所述的甲型流感病毒抗體、乙型流感病毒抗體、呼吸道合胞病毒抗體和腺病毒抗體均為鼠源抗體，更優(yōu)選為鼠源單克隆抗體。其中，應(yīng)注意膠體金標記抗體和檢測區(qū)相對應(yīng)的抗體應(yīng)為不同的抗體。

上述方法中，檢測試紙中所述的抗鼠免疫球蛋白抗體可以為兔抗鼠免疫球蛋白抗體、羊抗鼠免疫球蛋白抗體或駝羊抗鼠免疫球蛋白抗體，優(yōu)選為羊抗鼠免疫球蛋白抗體。

上述方法中，確保樣品墊一端壓住玻璃纖維膜一端0.5～1mm，玻璃纖維膜另一端壓住硝酸纖維素膜一端0.5～1mm，吸水紙的一端壓住硝酸纖維素膜另一端0.5～1mm，得檢測試紙。

將組裝后的檢測試紙在切條機上切成0.5cm款的試劑條待用，鋁箔包裝后，即可作為成品入庫。

本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測試劑盒，所述試劑盒包括上述的檢測試紙、使用說明書和包裝盒。

本發(fā)明制備得到的檢測試紙具有較高的靈敏度，具有操作安全(無放射物污染)、簡便(簡單操作一步完成)、適合單人/份檢測(放免、酶免不適合單人/份或少量樣品檢測)和快速(15分鐘左右即可有結(jié)果)等優(yōu)點，可實現(xiàn)對呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)抗原現(xiàn)場和家庭自檢，彌補現(xiàn)階段層析試劑盒靈敏度不高及不能實現(xiàn)分型的缺陷，將能夠最大限度地降低人群聚集感染的風險、在疫情現(xiàn)場減低疾病造成的危害。

本發(fā)明的試紙可以實現(xiàn)在一條紙條上同時檢測4種病毒，縮短了檢測周期，減少因為單一檢測某種分型而漏檢的現(xiàn)象，并節(jié)約了一次性耗材，因而相對于現(xiàn)有檢測試劑盒具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。

附圖說明

圖1：檢測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1為樣品墊，2為玻璃纖維膜，3為硝酸纖維素膜，4為吸水紙，5為底板，6為檢測區(qū)(T線)，7為控制區(qū)(C線)，8為待檢抗原，9為膠體金標記抗體，10為膠體金標記抗體與病毒抗原形成的免疫復(fù)合體，11為檢測區(qū)抗體，12為控制區(qū)抗體。

圖2：含有膠體金顆粒標記物的玻璃纖維膜制備示意圖

具體實施方式

以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步作描述，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

實施例1呼吸道病毒快速檢測試紙的制備

(1)膠體金的制備

采用化學(xué)還原法，向氯金酸水溶液中加入檸檬酸三鈉還原劑，制備成所需要的膠體金顆粒。方法先將0.01％HAuCL4溶液500ml，加熱至沸騰，迅速加入8.0ml的檸檬酸三鈉水溶液，加熱至出現(xiàn)紅色后繼續(xù)煮沸10-15min?；謴?fù)體積至500ml。

(2)膠體金-抗體結(jié)合物制備

a.取膠體金溶液500ml，在磁力攪拌器攪拌的狀態(tài)下，用0.2M的K₂CO3溶液將PH調(diào)制8.0。

b.將抗呼吸道合胞病毒的鼠單克隆抗體(日本tuno公司)用0.01MPBS稀釋成1.5mg/ml，取5支離心管各加入1ml的膠體金溶液，分別在前4管中加入30ul、40ul、45ul、50ul待標記抗體，最后一管作為對照，混合均勻后室溫放置5min。然后在前4管中各加入100ul濃度為10％的NaCl溶液?；靹蚝笫覝胤胖?0min。以沒有變藍色的一管所加入的抗體量作為最佳蛋白標記量。

抗腺病毒的鼠單克隆抗體、抗甲型流感病毒(FluA)的鼠單克隆抗體和抗乙型流感病毒(FluB)的鼠單克隆抗體(均購自日本tuno公司)的制備同上。

c.根據(jù)體積和標記實用量計算所需抗體的量，將1.5mg/ml的上述4種抗體分別緩慢加入到膠體金溶液中，室溫攪拌20min。

d.加10％BSA，至終濃度2％，室溫攪拌5min。

e.加10％PEG，至終濃度1％，室溫攪拌5min。

f.10000rpm/min離心30min，小心吸取上清，用100ml的膠體金保存液懸浮沉淀。置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)金標墊的處理

取15mm*300mm的玻璃纖維素膜擺放在不銹鋼盤上，將膠體金抗體結(jié)合液均勻的含浸在玻璃纖維素膜上，然后放到凍干機上冷凍過夜，至完全干燥。

(4)抗體固相硝酸纖維素膜的制備

a.將抗呼吸道合胞病毒的單克隆抗體(購自Abcam公司)用0.01M的PBS稀釋成濃度2.8±0.1mg/ml的抗體溶液，用點膜儀以1μl/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線。

與此類似，將抗腺病毒的單克隆抗體、抗甲型流感病毒(FluA)的單克隆抗體和抗乙型流感病毒(FluB)的單克隆抗體(購自Abcam公司)用0.01M的PBS稀釋成濃度2.8±0.1mg/ml的抗體溶液，用點膜儀以1μl/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，彼此間隔0.5-0.8cm。

b.將羊抗鼠IgG多克隆抗體(購自Abcam公司)用0.01MPBS稀釋成2.0±0.1mg/ml的抗體溶液，用點膜儀以1μl/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成質(zhì)控線，和檢測線之間的間距為0.8cm。

c.將固定有抗體的硝酸纖維素膜置37℃烘箱中充分干燥。

d.置干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)組裝

a.在塑料襯片中間位置粘貼抗體固相硝酸纖維素膜。

b.在塑料襯片上固定硝酸纖維素膜位置的頂端，粘貼吸水紙；下端粘貼金標墊；吸水墊和金標墊同硝酸纖維素膜邊沿約2mm。

c.標記墊的下方粘貼樣品墊，樣品墊覆蓋金標墊約2mm。

d.組裝后的襯片，在切條機上切成0.5-1cm款的試劑條待用。檢測試紙的成品結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中，1為樣品墊，2為玻璃纖維膜，3為硝酸纖維素膜，4為吸水紙，5為底板，6為檢測區(qū)(T線)，7為控制區(qū)(C線)，8為待檢抗原，9為膠體金標記抗體，10為膠體金標記抗體與病毒抗原形成的免疫復(fù)合體，11為檢測區(qū)抗體，12為控制區(qū)抗體。

(6)包裝

(7)成品入庫。最終成品試劑盒包括上述制備的檢測試紙、使用說明書和包裝盒。

實施例2試劑盒的檢測應(yīng)用

本試劑盒能定性的檢測鼻腔擦拭液、咽喉擦拭液、鼻腔抽吸液樣本中的病毒樣本；通過對臨床樣本的檢測，陽性、陰性的符合率高，具有較高的靈敏度和特異性。

于三家不同醫(yī)院檢測未知感染源病人臨床樣本1180份，其中陽性410份，陰性770份。

靈敏度：410份陽性樣本中檢出陽性399份，靈敏度為97.3％。其中檢測到呼吸道合胞病毒樣本97份，腺病毒114份，甲型流感病毒(FluA)85份，乙型流感病毒(FluB)103份。

特異性：770份陰性樣本中檢測出陰性760份，特異性為98.7％。

實施例3：腺病毒檢測對比研究

利用免疫層析原理，定性檢測咽喉擦拭液標本中的腺病毒抗原。將滅菌棉棒從口腔完全插入咽喉中，以咽后壁、上顎扁桃的發(fā)紅部位為中心，摩擦數(shù)次，采集粘膜表皮。采集時，要注意不要碰到唾液。

預(yù)先在附屬的抽提用管子中加入0.5ml樣本抽提液(到下方的基準線為止)，放在立架上。將采集樣本后的滅菌棉棒浸在抽提用管子中的樣本抽提液中攪拌。從抽提用管子的外側(cè)，用手指擠壓滅菌棉棒數(shù)次，使樣本抽提液充分浸透滅菌棉棒，然后拔出滅菌棉棒，絞出的液體作為樣品待測。擠壓抽提用管子，滴3滴到檢測板的樣品滴下部，15min后讀結(jié)果。

本采樣方式免疫熒光法確認：咽喉擦拭液204例，包括經(jīng)免疫熒光法確認的70例ADV陽性樣本和134例ADV陰性樣本；被考核試劑檢測陽性的為70例，二者檢測陽性一致的為69例；被考核試劑檢測陰性的為134例，二者檢測陰性一致的為133例，詳見下表：

靈敏度＝69/70×100％＝98.6％

特異性＝133/134×100％＝99.2％

總一致性＝(69+133)/(70+134)×100％＝99.0％

實施例4：甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)檢測對比研究

4.1樣品的調(diào)制方法

預(yù)先在采樣用管子中加入0.5ml樣本抽提液，放在立架上。

①鼻腔抽吸液

將鼻腔抽吸液0.5ml懸濁于運輸培養(yǎng)基或2ml生理鹽水中。在已經(jīng)加入了樣本抽提液的采樣用管子中加入0.5ml懸濁液，充分混合后作為樣品待測。

②鼻咽拭子(鼻腔擦拭液)、口咽拭子(咽喉擦拭液)

將采集樣本后的棉棒浸在采樣用管子中的樣本抽提液中攪拌。從采樣用管子的外側(cè)，用手指擠壓棉棒數(shù)次，使樣本抽提液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，絞出的液體作為樣品待測。

4.2.檢測操作方法

①將采樣用管子的樣品滴下100μL(約3滴)到檢測板的樣品滴下部。

②15分鐘后觀察結(jié)果。

4.3、檢測試紙的性能

本品的最小檢出量：甲型流行性感冒病毒最小檢測靈敏度為3.0×10⁴TCID₅₀/每次檢測。乙型流行性感冒病毒最小檢測靈敏度為1.5×10⁵TCID₅₀/每次檢測。

對流行性感冒病毒的反應(yīng)性：

①甲型流感病毒：亞型的H1N1：5株、H2N2：3株、H3N2：7株，全被確認有反應(yīng)。

②流感B病毒：流感B病毒9株，全被確認有反應(yīng)。

實施例5：呼吸道合胞病毒檢測對比研究

呼吸道合胞病毒傳播廣泛，對嬰幼兒危害大，甚至導(dǎo)致死亡，且危害有逐漸上升的趨勢。而現(xiàn)有的檢測的手段，如經(jīng)典的實驗室診斷技術(shù)一病毒分離和培養(yǎng)耗時太長不能做到及時檢測，而血清學(xué)需要等病情達到一定程度后才能檢測完全失去了檢測的意義。而現(xiàn)行醫(yī)院多使用大型的儀器，不僅儀器十分昂貴，即使一次性投入購得儀器后，后續(xù)需要使用到的試劑也是十分昂貴的。

本發(fā)明制備的檢測試紙為呼吸道合胞病毒的快速準確的檢測提供了方便，為盡早診斷、減少疾病的傳播以及確定正確的治療方案，防止濫用抗生素提供重要依據(jù)。

從方法學(xué)角度，膠體金免疫層析法與其他方法學(xué)比較如下：

本發(fā)明產(chǎn)品同市面上同類單一膠體金產(chǎn)品檢測呼吸道合胞病毒性能對比：