本發(fā)明涉及生物免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種電流型電化學(xué)傳感器及其制備方法和應(yīng)用，該電流型電化學(xué)傳感器通過降解信號物質(zhì)，從而有效提高傳感器的靈敏度。

背景技術(shù)：

胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90％為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來明顯上升。5年生存率<1％，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌早期的確診率不高，手術(shù)死亡率較高，而治愈率很低。本病發(fā)病率男性高于女性，男女之比為1.5～2:1，男性患者遠(yuǎn)較絕經(jīng)前的婦女多見，絕經(jīng)后婦女的發(fā)病率與男性相仿。ca199是一種粘蛋白型的糖類蛋白腫瘤標(biāo)志物，為細(xì)胞膜上的糖脂質(zhì)，分子量大于1000kd。是迄今報道的對胰腺癌敏感性最高的標(biāo)志物。在血清中它以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎兒胰腺、膽囊、肝、腸和正常成年人胰腺、膽管上皮等處。是存在于血液循環(huán)的胃腸道腫瘤相關(guān)抗原。大部分胰腺癌患者血清ca199水平明顯增高。如果以正常參考范圍上限(37u/ml)為診斷標(biāo)準(zhǔn)，敏感性和特異性均可達(dá)90％以上。

目前，檢測ca199蛋白腫瘤標(biāo)志物的傳感器多為三明治和非標(biāo)型傳感器的結(jié)構(gòu)，例如cn201110127521.x中公開了一種檢測卵巢skov-3癌細(xì)胞的三明治型電化學(xué)傳感器，其采用石墨烯修飾電極。在現(xiàn)有文獻(xiàn)(“novelredoxspeciespolyanilinederivative-au/ptassensingplatformforlabel-freeelectrochemicalimmunoassayofcarbohydrateantigen199”，anlyticachimicaacta,2016,108-113,wang等)中，非標(biāo)傳感器利用在電極表面修飾苯胺衍生物作為基底，然后修飾金鉑合金。對于目前存在的三明治型電化學(xué)傳感器，探針上固定有抗體和封閉劑(如牛血清蛋白)，電信號物質(zhì)也在探針表面固定?？贵w和封閉劑的導(dǎo)電性不好，不利于靈敏度的提高；對于非標(biāo)型電化學(xué)傳感器，電流的變化僅僅是因為抗原被固定到電極表面，存在靈敏度不高，檢測范圍小等問題。

因此仍然需要開發(fā)一種靈敏度、檢測限更高的傳感器。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種電流型電化學(xué)傳感器系統(tǒng)，所述傳感器系統(tǒng)通過降解信號物質(zhì)，從而有效提高傳感器的靈敏度。所述傳感器系統(tǒng)包括傳感器和探針，所述傳感器在電極表面通過ca²⁺交聯(lián)固定金聚亞甲基藍(lán)或者硫堇、還原的氧化石墨烯-血紅素(hemin)-金顆粒和鉑顆粒修飾的海藻酸鈉或者聚丙烯酸的混合物作為基底，然后在該基底上吸附固定ca199抗體1(ab1)，再以牛血清蛋白封閉剩余的活性位點，構(gòu)建電流型電化學(xué)傳感器。

所述探針為金顆粒、葡萄糖氧化酶和ca199抗體2共同修飾的碳酸鈣納米顆粒探針。

優(yōu)選地，所述電極為玻碳電極。

優(yōu)選地，所述金聚亞甲基藍(lán)、還原的氧化石墨烯-血紅素-金顆粒和鉑顆粒修飾的海藻酸鈉的質(zhì)量比例約為4～10:2～5:2～5，優(yōu)選為4～8:2～3:2～3，更優(yōu)選為2:1:1。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種電流型電化學(xué)傳感器系統(tǒng)的制備方法，所述方法包括以下步驟：

1)金聚亞甲基藍(lán)或硫堇的合成，可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行制備(“novelmetal-organicnanocomposites:poly(methyleneblue)-auanditsapplicationforanultrasensitiveelectrochemicalimmunosensingplatform”，sensorsandactuatorsb:chemical237，2016，666-671，shan等)。

2)還原的氧化石墨烯-血紅素-金顆粒的復(fù)合材料的合成，可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行制備(“reducedgrapheneoxide-hemin-aunanohybrids:facileone-potsynthesisandenhancedelectrocatalyticactivitytowardsthereductionofhydrogenperoxide”，biosensorsandbioelectronics78,2016,300-307，gu等)。

3)鉑顆粒修飾的海藻酸鈉或者聚丙烯酸的合成

首先配置2～5ml質(zhì)量百分比濃度約為0.2％的海藻酸鈉或者聚丙烯酸溶液，然后將3～7μl質(zhì)量百分比濃度約為4％的h2ptcl6溶液加入到海藻酸鈉或者聚丙烯酸溶液中，得到的溶液在漩渦儀上進(jìn)行混合。最后將混合好的溶液在微波反應(yīng)器中80-100℃條件下反應(yīng)5-20min，優(yōu)選反應(yīng)5-10min。反應(yīng)之后，混合物的顏色變成棕色，證明成功制備了鉑顆粒修飾的海藻酸鈉或者聚丙烯酸。

4)金顆粒、葡萄糖氧化酶和ca199抗體2共同修飾的碳酸鈣納米顆粒探針的合成

首先5ml濃度為4mm的cacl2溶液和5ml質(zhì)量百分比濃度為0.08％的可溶淀粉溶液混合30min。然后將5ml濃度為3mm的na2co3溶液加入到此混合液中并且劇烈攪拌10min。利用二次水洗滌，8000轉(zhuǎn)離心分離得到制備的caco3顆粒，此過程重復(fù)三次，之后碳酸鈣顆粒分散到2ml二次水中。隨后將10μl質(zhì)量百分比濃度為4％的haucl4溶液加到碳酸鈣顆粒分散液中并攪拌10min。然后加入8μl濃度為1mol/l的nabh4溶液加到混合液中反應(yīng)1h，得到的產(chǎn)物通過離心分離然后分散到2ml二次水中。最后將100μl濃度為1mg/ml的ca199抗體2和200μl濃度為1mg/ml的葡萄糖氧化酶的混合溶液加入到上述修飾過金顆粒的碳酸鈣分散液中在室溫條件下反應(yīng)12h，經(jīng)過離心分離和洗滌得到最后的產(chǎn)物。

5)構(gòu)建傳感器

電極經(jīng)過鋁粉的打磨之后分別用硝酸、乙醇進(jìn)行洗滌，并用氮氣吹干。然后用配置濃度為2～5mg/ml的步驟1)中制備的金聚亞甲基藍(lán)或硫堇溶液、配置濃度為2～5mg/ml的步驟2)中制備的還原的氧化石墨烯-血紅素(hemin)-金顆粒溶液和配置濃度為2～5mg/ml的步驟3)中制備的鉑顆粒修飾的海藻酸鈉或者聚丙烯酸溶液的混合溶液直接滴在電極表面，三種溶液的體積比為2:1:1；烘箱中干燥之后，電極用濃度為20nm的cacl2溶液浸泡5-15min，然后洗滌，之后將80μl濃度為200μg/ml的ca199抗體1溶液滴在電極表面并在冰箱中存放一夜；接著質(zhì)量百分比濃度為1％的bsa溶液封閉剩余的活性位點，烘箱中干燥得到傳感器。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種所述電流型電化學(xué)傳感器系統(tǒng)的應(yīng)用方法，所述方法以下進(jìn)行：

將制備的傳感器在待測液中浸泡1h，再在金顆粒、葡萄糖氧化酶和ca199抗體2修飾的碳酸鈣納米顆粒探針溶液(2mg/ml)中浸泡約1h，然后再在7mm的葡萄糖溶液中浸泡5min。電極用二次水洗滌之后，利用方波伏安法(-0.8to0.4v(vsag/agcl))進(jìn)行檢測最后的電信號，由電化學(xué)響應(yīng)的電流大小來線性檢測待測液中ca199的濃度。

附圖說明

圖1為表示根據(jù)本發(fā)明的電流型電化學(xué)傳感器制備方法及應(yīng)用方法的示意圖；

圖2(a)為制備實施例1中得到的傳感器系統(tǒng)對不同濃度的ca199對應(yīng)響應(yīng)電流；(b)為不同濃度的ca199與響應(yīng)電流之間的線性關(guān)系。

具體實施方式

在下文中，將參照附圖詳細(xì)地描述本公開的優(yōu)選的實施方式。在描述之前，應(yīng)當(dāng)了解在說明書和所附權(quán)利要求中使用的術(shù)語，并不應(yīng)解釋為局限于一般及辭典意義，而是應(yīng)當(dāng)基于允許發(fā)明人為最好的解釋而適當(dāng)定義術(shù)語的原則，基于對應(yīng)于本發(fā)明技術(shù)層面的意義及概念進(jìn)行解釋。因此，在此的描述僅為說明目的的優(yōu)選實例，而并非是意指限制本發(fā)明的范圍，因而應(yīng)當(dāng)了解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以做出其他等同實施和修改。

根據(jù)本發(fā)明的制備的碳酸鈣納米顆粒探針導(dǎo)電性差、攜帶ca199抗體2和葡萄糖氧化酶，因此可以特異性識別目標(biāo)分析物ca199和催化葡萄糖產(chǎn)生過氧化氫。當(dāng)此探針連到基底上時，增加電阻，降低電化學(xué)響應(yīng)電流。在基底上修飾了血紅素，并含有金聚亞甲基藍(lán)作為電信號物質(zhì)，血紅素在過氧化氫的存在時可以催化降解金聚亞甲基藍(lán)。

普通的三明治型電化學(xué)免疫傳感器的信號物質(zhì)在探針上，但是此探針必須修飾抗體和封閉劑(例如牛血清蛋白)，這些蛋白質(zhì)的導(dǎo)電性較差，不利于響應(yīng)電流的增加。

根據(jù)本發(fā)明的傳感器將信號物質(zhì)金聚亞甲基藍(lán)固定在基底之上，引入導(dǎo)電性差的ca199抗體2和葡萄糖氧化酶修飾的碳酸鈣納米顆粒探針可以阻礙電子轉(zhuǎn)移，提高靈敏度。修飾在探針上的蛋白質(zhì)也有利于提高靈敏度。此外，探針上的葡萄糖氧化酶可與固定在基底上催化劑血紅素協(xié)同降解亞甲基藍(lán)，進(jìn)一步提高靈敏度。實驗檢測證明此傳感器具有非常高的靈敏度和較寬的檢出范圍。

以下實施例僅是作為本發(fā)明的實施方案的例子列舉，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在不偏離本發(fā)明的實質(zhì)和構(gòu)思的范圍內(nèi)的修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。除非特別說明，以下實施例中使用的試劑和儀器均為市售可得產(chǎn)品。

ca199、ca199抗體1(ab1)和ca199抗體2(ab2)購買于上海領(lǐng)潮生物有限公司。亞甲基藍(lán)、牛血清蛋白、可溶淀粉、碳酸鈉、氯化鈣、購自北京化學(xué)試劑公司(北京，中國)。氯金酸、氯鉑酸和葡萄糖購自alfaaesar(天津，中國)。血紅素葡萄糖氧化酶、海藻酸鈉和氧化石墨烯購買于sigma-aldrich。所有的電化學(xué)檢測都是在電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)進(jìn)行。

實施例

制備實施例1

1)構(gòu)建傳感器

將玻碳電極利用0.05微米的三氧化二鋁粉末打磨，然后在1:1硝酸、乙醇和二次水中洗滌，最后用氮氣吹干。然后將8μl濃度為2mg/ml的金聚亞甲基藍(lán)溶液、4μl濃度為2mg/ml的金顆粒修飾的還原氧化石墨烯溶液和4μl濃度為2mg/ml的鉑顆粒修飾的海藻酸鈉溶液混合，將混合液滴在電極表面。在37℃烘箱中干燥之后電極放在4℃的冰箱中冷卻，然后在濃度為20nm的cacl2溶液中浸泡10min。用二次水洗滌之后，將80μl濃度為200μg/ml的ca199抗體1(ab1)直接滴在電極表面并在4℃冰箱中存放一夜，接著用牛血清蛋白(bsa)溶液(質(zhì)量百分比濃度為1％)封閉剩余的活性位點，烘箱中干燥得到傳感器。

2)金顆粒、葡萄糖氧化酶和ca199抗體2共同修飾的碳酸鈣納米顆粒探針的合成

首先5ml濃度為4mm的cacl2溶液和5ml質(zhì)量百分比濃度為0.08％的可溶淀粉溶液混合30min。然后將5ml濃度為3mm的na2co3溶液加入到此混合液中并且劇烈攪拌5min。通過離心分離得到制備的caco3顆粒，利用二次水洗滌，8000轉(zhuǎn)離心分離得到制備的caco3顆粒，此過程重復(fù)三次，之后碳酸鈣顆粒分散到2ml二次水中。隨后將10μl質(zhì)量百分比濃度為4％的haucl4溶液加到碳酸鈣顆粒分散液中并攪拌10min。然后加入8μl濃度為1mol/l的nabh4溶液加到混合液中反應(yīng)1h，得到的產(chǎn)物通過離心分離然后分散到2ml二次水中。最后將100μl濃度為1mg/ml的ca199抗體2和200μl濃度為1mg/ml的葡萄糖氧化酶的混合溶液加入到上述修飾過金顆粒的碳酸鈣分散液中在室溫條件下反應(yīng)12h，經(jīng)過離心分離和洗滌得到最后的產(chǎn)物修飾的碳酸鈣納米顆粒探針。

測試實施例1

將室溫下，80μl濃度分別為0.001、0.01、0.1、1、5、10、100和200u/ml(u是酶活性單位)的ca199溶液滴在制備實施例1中得到的傳感器表面上反應(yīng)1h。洗滌之后再將80μl制備實施例1中得到的2mg/ml的碳酸鈣納米顆粒探針溶液滴在電極表面反應(yīng)1h，最后將負(fù)載了探針的傳感器再在7mm的葡萄糖溶液中浸泡5min，用方波伏安法進(jìn)行表征(-0.8to0.4v(vsag/agcl))，并做出響應(yīng)電流與ca199的濃度之間的線性關(guān)系。

圖2(a)為在制備實施例1中得到的傳感器系統(tǒng)對不同濃度的ca199對應(yīng)響應(yīng)電流；(b)為不同濃度的ca199與響應(yīng)電流之間的線性關(guān)系。

測試實施例2

取10份不同的血清，將根據(jù)制備實施例1制備的傳感器在待測血清中浸泡1h，再在金顆粒、葡萄糖氧化酶和ca199抗體2修飾的碳酸鈣納米顆粒探針溶液(2mg/ml)中浸泡約1h，然后再在7mm的葡萄糖溶液中浸泡5min。電極用二次水洗滌之后，利用方波伏安法(-0.8to0.4v(vsag/agcl))進(jìn)行檢測最后的電信號，由電化學(xué)響應(yīng)的電流大小來線性檢測待測液中ca199的濃度，表1中的樣品1。

作為對比，用通用的elisa方法(樣品2)進(jìn)行檢測，兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，結(jié)果如下表1所示。

表1：不同血清樣品中的ca199濃度的比較。

測試實施例3

比較根據(jù)制備實施例1制備的傳感器系統(tǒng)與其他現(xiàn)有技術(shù)中檢測ca199的電化學(xué)傳感器性能，結(jié)果列于下表2中，其中：

樣品1為根據(jù)制備實施例1制備的傳感器系統(tǒng)；

樣品2為根據(jù)文獻(xiàn)(“ultrasensitiveelectrochemicalimmunosensorforcarbohydrateantigen19-9usingau/porousgraphenenanocompositesasplatformandau@pdcore/shellbimetallicfunctionalizedgraphenenanocompositesassignalenhancers”，biosensorsandbioelectronics66(2015)356–362，yang等)制備的傳感器；

樣品3為根據(jù)文獻(xiàn)(“silver-functionalizedg-c3n4nanohybridsassignal-transductiontagsforelectrochemicalimmunoassayofhumancarbohydrateantigen19-9”，analyst,2016,141,4366，sun等)制備的傳感器；

樣品4為根據(jù)文獻(xiàn)(“metalionsdopedchitosan–poly(acrylicacid)nanospheres:synthesisandtheirapplicationinsimultaneouslyelectrochemicaldetectionoffourmarkersofpancreaticcancer”，biosensorsandbioelectronics75(2016)148–154，rong等)制備的傳感器；

樣品5為根據(jù)文獻(xiàn)(“novelelectrochemicalredoxactivespecies:one-stepsynthesisofpolyanilinederivative-au/pdanditsapplicationformultiplexedimmunoassay”，scientificreports5:16855，published:2015,11,18，wang等)制備的傳感器；

樣品6為根據(jù)文獻(xiàn)(“multiplexelectrochemicalorigamiimmunodevicebasedoncuboidsilver-paperelectrodeandmetalionstaggednanoporoussilver–chitosan”，biosensorsandbioelectronics56(2014)167–173，li等)制備的傳感器；

樣品7為根據(jù)文獻(xiàn)(“znoquantumdotlabeledimmunosensorforcarbohydrateantigen19-9”，biosensorsandbioelectronics26(2011)2720–2723gu等)制備的傳感器。

表2：根據(jù)制備實施例1制備的傳感器系統(tǒng)與其他現(xiàn)有技術(shù)中檢測ca199的電化學(xué)傳感器性能的比較。

由表格中的數(shù)據(jù)可得，根據(jù)本發(fā)明制備的傳感器系統(tǒng)具有較寬的檢出范圍，最低檢出限相對較低。本文中的傳感器的斜率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他傳感器，證明此傳感器的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他傳感器。