本發(fā)明涉及植物種子生活力快速測定，具體涉及一種魔芋實生種子生活力的快速測定方法。

背景技術(shù)：

1、魔芋是天南星科(araceae)魔芋屬(amorphaphallus?blume)的特種經(jīng)濟作物，其球莖富含魔芋葡萄糖甘露聚糖(konjac?glucomannan，簡稱kgm)，kgm具有凝膠、增稠、保水等40多項理化性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于休閑食品、保健食品、醫(yī)藥膠囊、民族醫(yī)藥、石油鉆探等領(lǐng)域，經(jīng)濟價值極高。目前，魔芋廣泛栽培于西南山區(qū)。魔芋依賴單一的營養(yǎng)繁殖模式擴繁，造成了軟腐病病害嚴重、種性退化、產(chǎn)量銳降、種植風險激增等問題，有性繁殖的實生種子是克服上述問題新的高效途徑。魔芋實生種子具體天然脫毒、多苗接力生長的突出優(yōu)勢，也存在大田生長中苗期過長、出苗不整齊的問題，尤其是由于貯藏不當、催芽不對造成的出苗問題更加突出。魔芋種子的生活力檢測是避免上述問題的關(guān)鍵農(nóng)事操作與核心技術(shù)，能廣泛應(yīng)用于預(yù)測大田出苗率、評價種子質(zhì)量、制定魔芋種子市場流通行業(yè)標準等領(lǐng)域。

2、現(xiàn)有的種子發(fā)芽率測定主要有2類：一是萌發(fā)法直接測定種子發(fā)芽率。該方法準確、直接，對于水稻、玉米、大豆及常見蔬菜等出苗迅速的種子較實用，但對于含水量高、出苗期長的魔芋實生種子來說試驗操作時期長、鑒定結(jié)果準確性差。本技術(shù)發(fā)明人團隊多年來實驗室鑒定實生種子出苗率的問題有2個：①是實驗室萌發(fā)率低，且極顯著低于真實出苗率。實驗室一般只有20—47％的出苗率，而同樣的種子大田出苗率通常為79—95％；②萌發(fā)周期過長。種子本身高達40％以上的高含水量，極易造成種子萌發(fā)時霉變腐爛，從而嚴重降低鑒定萌發(fā)率，同時60天左右的超長出苗期進一步加劇了霉變腐爛的概率。二是染色法測定種子生活力，間接鑒定種子發(fā)芽率。一般根據(jù)染色原理分為3大類，具體來說有7種方法，一類利用種子正常生理代謝功能的特點,分為ttc(四氮唑法)、h2o2(過氧化氫法、i2-ki(碘一碘化鉀法)；二類利用種子萌發(fā)時的呼吸情況,分為btb(澳香草酚藍法),改良石蕊法；三類利用種子細胞是否是活細胞,分為紅墨水法和靛藍法。其中被國際種子檢驗協(xié)會、中國種子檢驗規(guī)程及廣大種子領(lǐng)域科研工作者共同認可和推薦的方法是ttc法，ttc法測定結(jié)果也是被廣為證明與種子發(fā)芽率最接近、正相關(guān)性最好的方法。

3、ttc法在30多種植物種子中高頻報道，其中典型的有糧油作物玉米、水稻、大豆、小麥；蔬菜作物菊芋、肉蓯蓉、茄子、任豆；林木作物唐古特白刺、永瓣藤、油桐、南京椴、檀香、工業(yè)大麻、麻瘋樹、豆梨、毛竹、山龍眼、蒲葵；中藥材桃兒七、窄葉藍盆花、北烏頭、葛根、菘藍、多花黃精、白花前胡、榅桲、針茅、女貞子、結(jié)縷草等。不同植物種子在形態(tài)外觀、千粒重大小、種皮透性、種子營養(yǎng)物質(zhì)化學成分、貯藏期含水量、種子貯藏后生活力、種子萌發(fā)特性等方面差異巨大，導致雖然都是用ttc法染色鑒定種子生活力，但是每一種種子的鑒定條件都不一樣，公認的是在浸種時間和溫度、染色溫度和時間、ttc溶液濃度等方面優(yōu)化，其中浸種時間為40min-48h、浸種溫度為20℃-35℃、染色溫度為25-55℃(35℃左右最常用)、染色時間為40min-24h、ttc溶液溶度為0.1％-2％(0.5％左右最常用)。2020年，劉二喜等采用四唑法測定花魔芋實生種子生活力。試驗條件為：種子經(jīng)室溫純水浸泡5～6h后，沿種子縱切后均分成2份分別裝入小網(wǎng)袋，然后完全浸沒于40ml?0.5％四唑溶液中染色時間5h，染色溫度25℃、40℃。試驗同時發(fā)現(xiàn)2個問題：一是魔芋實生種子含有高黏度的魔芋葡甘聚糖植物膠，切開后的種子切面容易互相黏結(jié)或切面黏結(jié)燒杯的杯底、杯壁，造成ttc染色液無法充分與種子切面接觸，導致染色不準確；二是染色后的實生種子，褪色較快，如處理的樣品數(shù)量偏多，不能及時統(tǒng)計染色數(shù)據(jù)，容易導致后期的判定不準確。

4、為克服魔芋實生種子直接萌發(fā)法鑒定時間長、鑒定出苗率低，而ttc法染色鑒定種子生活力中切面黏結(jié)、褪色快，測定方法準確性、重復性差的問題，魔芋實生種子ttc法鑒定生活力的研究與應(yīng)用必要且迫切。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種快速測定魔芋實生種子生活力的方法，克服了ttc法染色鑒定種子生活力中切面黏結(jié)、褪色快等缺陷。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

2、一種快速測定魔芋實生種子生活力的方法，包括如下步驟：

3、(1)種子含水量檢測、浸泡：取魔芋實生種子待測，先檢測待測種子的含水量，其中含水量低于35％不進行后續(xù)處理，判斷生活力幾乎為零；

4、具體的，取待測種子總數(shù)的20％進行含水量檢測，單組種子總數(shù)控制在70-1000粒，測得含水量高于35％的，將剩余待測種子用純水浸泡5-24h，至其達到飽和吸水量；

5、(2)ttc染色：將浸泡后達到飽和吸水量的種子縱向?qū)Π肭虚_，切開后的兩半種子，每半顆種子利用0.5％無菌ttc溶液在30-40℃恒溫避光染色5h，每另外半顆種子作為對照，不做任何處理，拍照時用來做染色前后顏色的對比；

6、(3)染色種子的固定和拍照：立即將染色后種子進行固定處理和拍照；

7、(4)標準比色卡的構(gòu)建：選擇具有典型染色特征的種子構(gòu)建標準比色卡，比色卡分為3個比色區(qū)域；所述典型染色特征是指結(jié)構(gòu)清晰、染色效果明顯，如說明書附圖圖6所示。

8、(5)種子生活力的判定與統(tǒng)計：將染色后的種子與標準比色卡對比，同時將種子分為三類并分別計數(shù)；

9、(6)種子生活力的計算：種子生活力＝完全染上色的種子數(shù)*100％/種子總數(shù)；

10、(7)種子半致死含水量的計算：通過步驟(1)檢測得到的種子含水量計算種子平均含水量，與步驟(6)計算得到的種子生活力，根據(jù)所述種子平均含水量與種子生活力做散點曲線，利用excel擬合回歸方程，計算半致死含水量；

11、進一步地，所述的步驟(1)中種子浸泡的具體時間分為3檔：一檔為種子含水量56.8-62.2％，浸泡5h；二檔為種子含水量46.41-56.7％，浸泡15h；三檔為種子含水量35-46.40％，浸泡24h。關(guān)于含水量和浸泡時間的分檔處理的原因在于，首先，由于魔芋種子收獲的時間不一致，自然風干貯藏時間也有差異，導致種子播種前或測定生活力前的含水量不一樣：

12、同時通過發(fā)明人長期的研究實踐發(fā)現(xiàn)，對于魔芋類實生種子來說，不同含水量的種子，其吸水量、吸水速度均差異較大，達到接近飽和吸水量的時間差異較大；具體來說有3個特征：一是含水量越低的種子，其吸水量越大，接近或達到飽和吸水量所需時間越長；二是含水量為59.4％的種子在5h內(nèi)吸水較快，含水量為56.8％的種子在5h內(nèi)吸水較快；三是含水量為48.9％的種子在10-20h內(nèi)接近飽和吸水量，期間的吸水速度較慢；四是含水量為42.7％的種子在20h-25h期間吸水量仍然在增長，通過種子測定的效率和種皮溶脹的具體情況，24h的吸水處理時間合適。吸水曲線圖見說明書附圖圖1。

13、進一步地，所述的步驟(2)中ttc染色的具體方法為：切半的種子每1～2h攪拌一次，防止由于切面粘連或切面緊貼燒杯的杯底、杯壁，造成ttc染色液無法充分與種子切面接觸，導致染色不準確。

14、進一步地，所述的步驟(3)中染色后的種子固定和拍照，其中種子固定方法采取以下3種中的一種：一是將染色后的種子切面朝上依照顏色深淺依次垂直壓入細河沙，切面露出河沙1-3mm；二是在a4打印紙上用雙面膠制造等距的水平條20-40條，水平條間距為0-0.5cm，然后將染色后的種子切面朝上依照顏色深淺依次粘貼在雙面膠上；三是將黑色黏土(也可用面粉+黑色墨水制作替代)用搟面杖搟平，然后將染色后的種子切面朝上依照顏色深淺依次按壓入其中；由于切半種子的形狀不規(guī)則，拍照時切面無法保持在同一平面，會影響染色結(jié)果的正確記錄，故采取了上述的切半種子固定方法，同時為了避免快速褪色，本步驟總的處理時間控制在0.5-2h。

15、進一步地，所述的步驟(4)標準比色卡的構(gòu)建，第1區(qū)域：種子完全染上色，且顏色較紅，種子生活力強；第2區(qū)域：種子部分染上色，且顏色較淺，種子生活力弱；第3區(qū)域：種子完全染不上色，種子生活力無。

16、進一步地，所述的步驟(7)半致死含水量的計算：將步驟(1)每種處理的種子設(shè)置至少3組重復，根據(jù)所述種子平均含水量與種子生活力做散點曲線，利用excel擬合回歸方程，以種子平均含水量為x軸，以種子生活力為y軸，當y值為0.5時，代入所得到的方程，計算出的x值即為半致死含水量。

17、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和有益效果：

18、本發(fā)明提供了一種快速測定魔芋實生種子生活力的方法，包括了3個關(guān)鍵技術(shù)：首先，利用種子本身含水量分檔確定浸種時間；其次，染色中增加攪拌操作，防止種子切面黏結(jié)影響測定準確性；最后，在染色充分的前提下，配合特有的固定和拍照方式迅速固化染色得到的顏色，防止快速褪色影響數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。本發(fā)明采用種子含水量檢測、浸泡→ttc染色→種子的拍照→標準比色卡的構(gòu)建→種子生活力的判定與統(tǒng)計→種子生活力的計算的6步操作法，不僅提高了鑒定種子生活力的效率，而且提高了鑒定的準確性和重復性，更系統(tǒng)構(gòu)建了標準化、流程化、數(shù)據(jù)化、可視化的魔芋實生種子生活力ttc鑒定法。本發(fā)明成功實現(xiàn)了魔芋實生種子生活力的快速測定方法，替換了魔芋實生種子直接萌發(fā)法的低效率、低發(fā)芽率的操作方式，將測定時間由60天縮短到2-3天完成，提高效率20-30倍，同時也克服了ttc法染色鑒定種子生活力中切面黏結(jié)、褪色快，測定方法準確性、重復性差的缺陷，本發(fā)明可帶來魔芋實生種子生活力鑒定的變革性進步。具體而言，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

19、1)根據(jù)種子本身含水量分檔確定浸種時間。已有文獻中，不同植物種子，浸種時間均不同，通常含水量低、種皮厚實緊致的種子浸種時間長一些，同一類種子，浸種時間通常為恒定值。但本技術(shù)明人在長期的實踐過程中發(fā)現(xiàn)，對于魔芋類實生種子來說，不同含水量的種子，其吸水量、吸水速度均差異較大，由此，本發(fā)明的技術(shù)方案設(shè)置了分類分檔的浸種時間，提高試驗效率、試驗準確性。本發(fā)明將種子浸泡的具體時間分為3檔：一檔為種子含水量56.8-62.2％，浸泡5h；二檔為種子含水量46.41-56.7％，浸泡15h；三檔為種子含水量35-46.40％，浸泡24h。另外，檢測出種子含水量低于35％的，其種子生活力或田間萌發(fā)率均極低，沒有鑒定的實際價值了，故含水量低于35％的種子在本技術(shù)方案中被直接判定為生活力極低，不參與檢測含水量后續(xù)的處理，也不再進行生活力計算。

20、2)染色中增加攪拌操作，防止種子切面黏結(jié)影響測定準確性?，F(xiàn)有文獻中公開報道的其他類植物種子，染色過程中均沒有攪拌的操作，但是魔芋實生種子含有高黏度的魔芋葡甘聚糖植物膠，切開后的種子切面容易互相黏結(jié)或切面黏結(jié)燒杯的杯底、杯壁，造成ttc染色液無法充分與種子切面接觸，導致染色不準確。染色過程中采用攪拌的操作，可以分離種子與種子的黏結(jié)，也可以很好的分離種子切面貼合燒杯杯底、杯壁的種子。確保染色液充分與種子切面接觸、染色、滲透，提高染色的準確性。

21、3)利用特有的固定方式配合拍照固化染色后的顏色，防止快速褪色影響數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。ttc染色后，其切面的紅色容易褪色，影響種子生活力的判定分類，從而影響實驗的準確性和重復性。利用本技術(shù)特別設(shè)置的固定方式配合拍照，不僅可以固化染色后的顏色，同時，可以提高拍照的真實性，更加可以建立標準化的種子生活力判定標準比色卡，利于種子類相關(guān)生活力鑒定的研究者參考。