專利名稱：利用非熒光標記檢測配體對結合的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總的來說涉及分析核酸分子的方法和組合物，更具體地說，涉及特定的標記和接頭的用途，該標記和接頭用來提高各種以生物學為基礎的測定的靈敏度。
背景技術：
核酸分子的檢測和分析是生物學中的最重要技術之一。它們處于分子生物學的核心位置，并在其它生物學中扮演著快速擴展的角色。
一般地，在本質上所有生化反應之后，對分析而言某些形式的檢測步驟是必需的。其中特別重要的是核酸雜交和抗體-抗原結合的檢測。理想地，檢測應該是靈敏的并能進行多樣品的處理。然而，當前的檢測技術在這兩個特征上有某些程度的限制。
當雜交探針包含放射性標記時，一般由放射自顯影術或者磷光圖象分析檢測核酸分子的雜交，當雜交探針包含如生物素或者地高辛的標記(通過酶偶聯(lián)的抗體或者配體識別)時，則由光密度計檢測。當利用放射性標記的探針時，利用放射自顯影術的檢測受到膠片的限制，如照相材料的光化當量差和非線性。通過利用磷光圖象分析檢測標記可以克服這些膠片的局限性。然而，放射性標記有安全需要、要求增加資源利用以及必須有專門的設備和人員訓練。為此，非放射性標記的利用漸漸受到大眾的歡迎。在這樣的系統(tǒng)中，核苷酸包含如生物素或者地高辛的標記，該標記可以由抗體或者其它分子(由具有顯色底物的酶反應標記)檢測?？梢砸部梢圆焕脽晒鈽擞?。這些系統(tǒng)不需要如上所述的安全上的考慮，但是利用了經(jīng)常不穩(wěn)定的并且能產(chǎn)生非特異性反應的組分，因而導致了高的背景(即低的信噪比)。
抗體-抗原結合反應可以由幾個過程之一檢測。至于核酸雜交，標記(無論是放射性的或者非放射性的)則典型地綴合到抗體上。標記類型是類似的標記都與顯色底物、熒光、半抗原(由配體或者另一個抗體檢測)等進行酶促反應。如同核酸雜交的檢測一樣，類似的局限性是這些檢測方法所固有的。
本發(fā)明提供了新的組合物，該組合物可以用于各種以核酸為基礎的或者以蛋白質(例如抗體)為基礎的方法，同時還提供了其它相關優(yōu)點。
發(fā)明概要簡言之，本發(fā)明提供了能用來在各種基礎分析中提高靈敏度和樣品處理量的組合物和方法。尤其是，基于這里所描述的發(fā)明，許多迄今曾花費長時間完成的分析現(xiàn)在能夠以快十至一百多倍的速度完成。因此相對于以前可供使用的分析方法，這里所描述的方法闡述了一種戲劇性和重要的改進。
例如，在本發(fā)明方法的一個方面中，本發(fā)明提供了檢測配體對的第一成員與第二成員的結合的方法，包含步驟(a)在足以使第一成員結合到第二成員的條件和時間下，把一系列第一標記的成員與可能包含一個或多個第二成員的生物樣品組合在一起，其中所說的標記與特定的第一成員相關且可由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測；(b)將未結合的成員與結合的第一和第二成員分離；(c)從所標記的第一成員切割標記；以及(d)由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測標記，并從此檢測第一成員和第二成員的結合。
各種第一和第二成員對可以用于本發(fā)明的方法中，包括例如核酸分子(例如DNA、RNA、如PNA的核酸類似物戊糖核酸、或者這些物質的任一混合物)、蛋白質或者多肽(例如抗體或者抗體片段(如單克隆抗體、多克隆抗體或者如CDR的結合合作者))、低聚糖、激素、有機分子和其它底物(例如諸如葡糖醛酸酶-藥物分子之類的生物異源物質)或者任一其它配體。在本發(fā)明的各種實施方案中，第一和第二成員可以是同類型或者不同類型的分子。例如，代表性第一成員第二成員配體對包括核酸分子/核酸分子、抗體/核酸分子、抗體/激素、抗體/生物異源物質以及抗體/蛋白質。
優(yōu)選地，第一成員將識別特定的選擇的第二成員(即排除其它相關分子)或者一類相關的第二成員分子(例如一類相關的受體)。優(yōu)選地，第一成員將結合至少具有大約10-5/M(優(yōu)選為10-6/M、10-7/M、10-8/M、10-9/M或者大于10-12/M)親和性的第二成員。第一個分子對第二個分子的親和性能夠易于由本領域的一般方法測定(參見Scatchard,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660-672,1949)。
在本發(fā)明的其它相關方面中，本發(fā)明提供了分析選擇的生物樣品的基因表達模式的方法，該方法包括步驟(a)從生物樣品中暴露核酸，(b)在足以使所說的探針雜交到上述核酸上的條件和時間下，把所說的暴露的核酸與一個或多個選擇的標記的核酸(其中所說的標記與特定的核酸探針相關且可由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測)的探針組合在一起，(c)把雜交的探針與未雜交的探針分離，(d)從加標記的片段切割標記，以及(e)由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測標記并由此測定生物樣品的基因表達模式。在一個實施方案中，生物樣品可以在暴露核酸的步驟之前用選擇的分子刺激?！按碳の铩钡拇硇岳影ê怂岱肿?、重組基因送遞載體、有機分子、激素、蛋白質、炎性因子、細胞因子、藥物、藥物候選者、旁分泌以及自分泌因子等等。
在本發(fā)明的上下文中，“生物樣品”應該理解為不僅包括得自活有機體(例如哺乳動物、魚、細菌、寄生蟲、病毒、真菌等等)或者環(huán)境(例如空氣、水或者固體樣品)的樣品，而且包括可以人工或者合成產(chǎn)生的生物材料(例如噬菌體文庫、有機分子文庫、基因組克隆文庫等)。生物樣品的代表性例子包括生物體液(例如血液、精液、腦部脊髓液、尿)、生物細胞(例如干細胞、B或者T細胞、肝細胞、成纖維細胞等等)以及生物組織。
在上述方法的各種實施方案中，本發(fā)明的核酸探針和/或分子可以由例如連接、切割或者延伸(例如PCR)產(chǎn)生。在其它相關方面，核酸探針或者分子可以標記在5’-末端，并且所標記的分子的功能如同寡核苷酸引物或者雙脫氧核苷酸終止子一樣。
在本發(fā)明的其它實施方案中，4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450或者500個以上的不同和唯一的標記的分子可以同時用于所給定的反應中，其中每一個標記對選擇的核酸片段、探針、或者第一或者第二成員是唯一的，并且可以單獨地鑒別。
在本發(fā)明的進一步的實施方案中，標記可以由熒光測定法、質譜法、紅外光譜法、紫外分光法或者恒電勢電流分析法(例如利用庫侖滴定或者安培滴定檢測器)檢測。合適的光譜技術的代表性例子包括飛行時間質譜法、四極質譜法、磁掃描質譜法和電掃描質譜法。這樣技術的具體實施方案包括離子陷阱質譜法、電噴射離子化質譜法、離子噴射質譜法、液態(tài)離子化質譜法，氣壓離子化質譜法、電子離子化質譜法、快原子轟擊質譜法、MALDI質譜法、光離子化飛行時間質譜法、激光滴質譜法、MALDI-TOF質譜法、APCI質譜法、毫微噴射質譜法、霧狀噴射質譜法、化學離子化質譜法、共振離子化質譜法、二級離子化質譜法和熱噴射質譜法。
在本發(fā)明的其它進一步的實施方案中，結合的第一和第二成員或者暴露的核酸可以用諸如凝膠電泳、毛細管電泳、微通道電泳、HPLC、排阻色譜法、過濾、聚丙烯酰胺凝膠電泳、液相色譜、顛倒排阻色譜法、離子交換色譜、反相液相色譜、脈沖電場電泳、倒轉電場電泳、透析和熒光活化的液滴分類法之類的方法與非結合成員或者分子分離。另外，第一或第二成員或者暴露的核酸可以結合到固相支持體(例如空心的人造纖維(Amicon公司，Danvers,Mass.)、珠粒(Polysciences,Warrington,Pa.)、磁珠(Robbin Scientific,Mountain View,Calif.)、平板、皿以及燒瓶(Corning Glass Works,Corning,N.Y.)、篩目(Becton Dickinson,Mountain View,Calif.)、篩網(wǎng)以及固體纖維(參見Edelman等，美國專利號3,843,324；也參見Kuroda etijal.，美國專利號4,416,777)、膜(MilliporeCorp.,Bedford,Mass.)以及測桿)上。如果第一或第二成員或者暴露的核酸結合到固相支持體上，那么在本發(fā)明的某些實施方案中，這里所揭示的方法還可以包含洗滌未結合材料的固相支持體的步驟。
在其它實施方案中，可以用如化學、氧化、還原、酸不穩(wěn)定、堿不穩(wěn)定、酶促、電化學、熱以及光不穩(wěn)定方法的方法切割所標記的第一成員。在其他實施方案中，分離、切割和檢測步驟可以以連續(xù)方式(例如，象連續(xù)流一樣)進行，例如在可以自動操作的單一裝置上進行。
當參考下列詳細描述與附圖時，本發(fā)明的這些和其它方面將變得明顯。此外，這里列出了各種參考文獻，這些參考文獻更詳細地描述了某些方法或者組合物(例如質粒等等)，并因此以其整體本文一并參考。
附圖簡要描述

圖1描述可化學切割的質譜標記(釋放具有羧酸末端的標記)的五氟苯酯的合成的流程圖。
圖2描述以化學方法切割的質譜標記(釋放具有羧酸末端的標記)的五氟苯酯的合成的流程圖。
圖3-6和8描述一系列36種可光化學切割的質譜標記的四氟苯酯的合成的流程圖。
圖7描述一系列36種胺末端化可光化學切割的質譜標記的合成的流程圖。
圖9描述36種可光化學切割的質譜標記的寡核苷酸(從相應的一系列36種可光化學切割的質譜標記酸的四氟苯酯制備)的合成。
圖10描述36種可光化學切割的質譜標記的寡核苷酸(從相應的一系列36種胺末端化的可光化學切割的質譜標記制備)的合成。
圖11說明由質譜法同時進行的多個標記的檢測。
圖12顯示單獨的α-氰基基質的質譜。
圖13描述以模構建的標記的核酸片段。
發(fā)明詳細描述如上所述，本發(fā)明提供了可以用來在各種基于生物學的分析中提高靈敏度和處理的樣品的量的標記和接頭。下面更詳細地描述了可以利用的代表性標記和接頭、其中標記可以是有用的各種方法以及用于檢測標記的方法。
簡言之，在一個方面本發(fā)明提供了化合物，其中興趣分子或者其前體經(jīng)由一個不穩(wěn)定鍵(或者多個不穩(wěn)定鍵)與標記連接。因此，可以認為本發(fā)明的化合物具有通式T-L-X其中T是標記組分，L是或者包含一個不穩(wěn)定鍵的接頭組分，X是興趣分子(MOI)組分或者是官能團組分(Lh)(MOI可以通過其連接到T-L上)。因此，本發(fā)明的化合物可以由更具體的通式描繪T-L-MOI和T-L-Lh由于下面詳盡描述的理由，可以有目的地使T-L-MOI化合物系列處于一定的條件下，該條件致使不穩(wěn)定鍵斷裂，由此從化合物的剩余部分釋放出標記部分。然后標記部分由一種或多種分析技術鑒定，由此提供了關于標記部分的結構的直接信息以及(更重要地)關于相應的MOI的特性的間接信息。
作為本發(fā)明的代表性化合物的一個簡單的說明性例子(其中L是直接鍵)，本發(fā)明給出下列結構作為參考(ⅰ)結構(ⅰ)
在結構(ⅰ)中，T是結合到羰基上的、包含氮的多環(huán)芳香族部分，X是MOI(具體地說是終止在胺基團上的核酸片段)，L是形成酰胺基團的鍵。酰胺鍵相對于T中的鍵是不穩(wěn)定的，因為正如本領域所認識到的，酰胺鍵可以由酸性或者堿性條件以化學方法切割(斷裂)，這些條件在標記組分不變的情況下切割鍵。因此，標記部分(即包含T的裂解產(chǎn)物)可以釋放為如下所示結構結構(ⅰ)
然而，如下列說明性例子所示，接頭可以不僅僅是一個直接鍵，這兒給出本發(fā)明的另一個代表性化合物作為參考，該化合物具有如下所示的結構(ⅱ)結構(ⅱ)
眾所周知，具有正硝基芐胺部分(參見結構(ⅱ)中的加框原子)的化合物是光解不穩(wěn)定的，因為這樣的化合物暴露于特定波長的光化輻射中將造成芐胺鍵的選擇性切割(參見結構(ⅱ)中以粗線指示的鍵)。因此，結構(ⅱ)具有與結構(ⅰ)相同的T和MOI基團，然而接頭基團包含多個原子和鍵(其中有一個特別不穩(wěn)定的鍵)。因此結構(ⅱ)的光解從化合物的剩余部分釋放出標記部分(包含T的部分)，如下所示結構(ⅱ)
因此本發(fā)明提供了這樣的化合物，當其暴露于適當?shù)那懈顥l件下時，其經(jīng)歷裂解反應以致從化合物的剩余部分釋放出標記部分?？梢愿鶕?jù)標記部分、MOI(或其前體，Lh)以及不穩(wěn)定鍵(其將上述兩基團結合在一起)描述本發(fā)明的化合物。另外，可以根據(jù)形成它們的組分描述本發(fā)明的化合物。因此，如下所述，化合物可以描述為標記反應物、接頭反應物以及MOI反應物的反應產(chǎn)物。
標記反應物由化學柄(Th)和一個可變組分(Tvc)組成，所以認為標記反應物具有一般結構Tvc-Th為了說明其名稱，指定其為結構(ⅲ)，該結構顯示了可以用來制備結構(ⅱ)的化合物的標記反應物。具有結構(ⅲ)的標記反應物包含標記可變組分和標記柄，如下所示結構(ⅲ)
在結構(ⅲ)中，標記柄(-C(=O)-A)只是提供用于形成T-L部分的標記反應物與接頭反應物反應的途徑。結構(ⅲ)中的基團“A”表明羧基處于化學活性狀態(tài)，因此它易于與其它柄偶聯(lián)?！癆”可以是，例如羥基或者五氟苯氧基，以及許多其它可能的基團。如下所詳盡討論的，本發(fā)明提供了大量的可以結合標記可變組分的可能的標記柄。因此，標記可變組分是T-L-X式中的“T”的一部分，并且也將是標記部分(從切割L的反應中形成)的一部分。
也如下所詳盡討論的，標記可變組分之所以如此命名，是因為在按照本發(fā)明制備化合物系列的過程中，要求一系列成員具有唯一的可變組分，以便可以用一種分析技術將個體成員與另一個成員區(qū)別開來。作為一個例子，結構(ⅲ)的標記可變組分可以是下列系列的成員之一(其中系列成員可以由他們的UV或者質譜區(qū)別開來)
同樣地，接頭反應物可以按照它的化學柄(至少必須具有兩個化學柄，其每個可以指定為Lh)描述，該化學柄側面連結接頭不穩(wěn)定組分，其中接頭不穩(wěn)定組分由所需的不穩(wěn)定部分(L2)和可有可無的不穩(wěn)定部分(L1和L3)組成，其中可有可無的不穩(wěn)定部分有效地用來分離L2與柄Lh，并且所需的不穩(wěn)定部分用來在接頭不穩(wěn)定組分中提供不穩(wěn)定鍵。因此，可以認為接頭反應物具有通式Lh-L1-L2-L3-Lh用于描述接頭反應物的名稱可以以結構(ⅳ)的觀點來說明，其又是得自結構(ⅱ)的化合物結構(ⅳ)
正如結構(ⅳ)所說明的，原子可以不僅起一種功能作用。因此，在結構(ⅳ)中，芐基氮在經(jīng)由酰胺形成反應使接頭反應物結合至標記反應物的過程中起作為化學柄的作用，并且其后也用作不穩(wěn)定部分L2的結構的必要部分，因為芐型碳-氮鍵對光解切割特別敏感。結構(ⅳ)也說明接頭反應物雖然不具有L1基團，但是可以具有L3基團(在這種情況下是一個亞甲基)。同樣地，接頭反應物可以具有L1基團但不具有L3基團，或者可以同時具有L1和L3基團，或者可以既不具有L1基團也不具有L3基團。在結構(ⅳ)中，緊跟于羰基之后的“P”基團的存在表明羰基被保護而不參與反應。如果給定這一構型，標記反應物(ⅲ)的活化的羧基可以干凈地與接頭反應物(ⅳ)的胺基進行反應而形成酰胺鍵并產(chǎn)生T-L-Lh式的化合物。
MOI反應物是一種合適反應形式的興趣分子。其中興趣分子是一個核酸片段，合適的MOI反應物是一個通過其5’羥基與磷酸二酯基團結合然后與終止于氨基的亞烷基鏈結合的核酸片段。然后這種氨基可以與結構(ⅳ)的羰基進行反應(當然在羰基脫保護之后，優(yōu)選的是在其后激活羰基朝著與胺基反應的方向之后)而由此使MOI結合到接頭上。
當以時序觀察時，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明采用標記反應物(具有化學標記柄和標記可變組分)、接頭反應物(具有兩個化學接頭柄，一個必需的不穩(wěn)定部分以及0-2種可有可無的不穩(wěn)定部分)和MOI反應物(具有一種興趣分子的組分以及一個興趣分子的化學柄)以形成T-L-MOI。因此，為了形成T-L-MOI，任一標記反應物和接頭反應物都首先一起反應以提供T-L-Lh，然后MOI反應物與T-L-Lh進行反應而提供T-L-MOI；或者另外(不太優(yōu)選)接頭反應物與MOI反應物首先一起反應以提供Lh-L-MOI，然后Lh-L-MOI與標記反應物進行反應以提供T-L-MOI。為了方便的目的，將按照標記反應物、接頭反應物以及可以用來形成這樣的化合物的MOI反應物來描述具有T-L-MOI式的化合物。當然，相同的T-L-MOI式的化合物可以由其它(典型地是更為艱辛的)方法制備，并且仍然落在本發(fā)明的T-L-MOI化合物的范圍之內。
在任何情況下，本發(fā)明提供了使T-L-MOT化合物處于切割條件下，結果是標記部分可從化合物的剩余部分釋放出來。標記部分將至少包含標記可變組分，并且將典型地另外包含來源于標記柄的一些或者所有原子、來源于接頭柄的一些或者所有原子(其用于使標記反應物與接頭反應物結合)、可有可無的不穩(wěn)定部分L1(如果這一基團出現(xiàn)在T-L-MOI中)，并且或許將包含所需的不穩(wěn)定部分L2(其取決于L2的精確結構和切割化學的性質)的一部分。為方便起見，標記部分可以稱作包含T的部分，因為T將典型地構成標記部分的主要部分(按照質量)。
如果將這引入本發(fā)明的一個方面，各組分T、L和X將得到詳盡的描述。這一描述從下列的特定術語的定義開始，下文將用該術語描述T、L和X。
如本文所使用的，術語“核酸片段”意指一個分子，該分子互補于一個選擇的靶核酸分子(即互補于其所有或者部分)，并且可以得自天然的或者合成或者重組產(chǎn)生的產(chǎn)物(包括非天然存在的分子)，并且可以是適合存在的雙鏈或者單鏈形式；該分子同時包括寡核苷酸(例如DNA或者RNA)、引物、探針、核酸類似物(例如PNA)、由聚合酶在5’至3，方向上伸展的寡核苷酸、以化學方法或者以酶促方法切割的核酸、用雙脫氧終止子終止的或者用化合物(其阻止在5’或3’末端聚合)在3’或5’末端加帽的核酸以及其混合物。核酸片段對一個選擇的靶核酸分子的互補性一般意指在整個片段的長度中顯示至少大約70％特定的堿基配對。優(yōu)選地，核酸片段顯示出至少大約80％特定的堿基配對；更最優(yōu)選地至少大約90％。用于測定錯配百分率的分析方法是本領域所熟知的，并且當參考充分配對的堿基對照時該分析方法基于作為Tm的函數(shù)的錯配百分率。
如本文所使用的，術語“烷基”(單獨地或者結合形式的)指的是飽和的、包含1至10(優(yōu)選為1至6，更優(yōu)選為1至4)個碳原子的直鏈或者支鏈烴基。這樣的基團的例子包括(但并不限于)甲基、乙基、N-丙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、癸基等等。術語“亞烷基”指的是飽和的、包含1至10(優(yōu)選為1至6，更優(yōu)選為1至4)個碳原子的直鏈或者支鏈烴雙基。這樣的雙基的例子包括(但并不限于)亞甲基、1,2-亞乙基(-CH2-CH2-)、1,2-亞丙基等等。
術語“烯基”(單獨地或者結合形式的)指的是總計為2至10(優(yōu)選為2至6，更優(yōu)選為2至4)個碳原子的、至少具有一個碳-碳雙鍵的直鏈或者支鏈烴基。這樣的基團的例子包括(但并不限于)乙烯基、E-和Z-丙烯基、異丙烯基、E-和Z-丁烯基、E-和Z-異丁烯基、E-和Z-戊烯基、癸烯?；鹊?。術語“亞烯基(alkenylene)”指的是總計為2至10(優(yōu)選為2至6，更優(yōu)選為2至4)個碳原子的、至少具有一個碳-碳雙鍵的直鏈或者支鏈烴雙基。這樣的雙基的例子包括(但并不限于)亞甲基(=CH2)、亞乙基(-CH=CH-)、亞丙基(-CH2-CH=CH-)等等。
術語“炔基”(單獨地或者結合形式的)指的是總計為2至10(優(yōu)選為2至6，更優(yōu)選為2至4)個碳原子的、具有至少一個碳-碳三鍵的直鏈或者支鏈烴基。這樣的基團的例子包括(但并不限于)乙炔基(acetylenyl)、2-丙炔基(炔丙基)、丁炔基、己炔基、癸炔基等等。術語“亞炔基(alkynylene)”(單獨地或者結合形式的)指的是總計為2至10(優(yōu)選為2至6，更優(yōu)選為2至4)個碳原子的、具有至少一個碳-碳三鍵的直鏈或者支鏈烴雙基。這樣的基團的例子包括(但并不限于)亞乙炔基(-C≡C-)、亞炔丙基(-CH2-C≡C-)等等。
術語“環(huán)烷基”(單獨地或者結合形式的)指的是飽和的、碳原子(碳原子數(shù)目為3至8，優(yōu)選為3至6)環(huán)排列的基團。這樣的環(huán)烷基的例子包括(但并不限于)環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等等。術語“亞環(huán)烷基(cycloalkylene)”指環(huán)烷基的雙基形式。
“環(huán)烯基”(單獨地或者結合形式的)指的是包含4至8(優(yōu)選為5或6)個碳原子和一個或多個雙鍵的環(huán)狀碳環(huán)。這樣的環(huán)烯基的例子包括(但并不限于)環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)戊二烯基等等。術語“亞環(huán)烯基(cycloalkenylene)”指環(huán)烯基的雙基形式。
術語“芳基”指的是選自由苯基、萘基、茚基、2,3-二氫化茚基、azulenyl、芴基以及蒽基組成的組的碳環(huán)(全部由碳和氫組成)芳基；或者指的是選自由呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、異噁唑基、異噻唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,3-三唑基、1,3,4-噻二唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基、1,3,5-三硫茚基、中氮茚基、吲哚基、異氮茚基、3H-吲哚基、二氫吲哚基、苯并呋喃基、2,3-二氫苯并呋喃基、苯并噻吩基、1H-吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、肉啉基、2,3-二氮雜萘基、喹唑啉基、喹喔啉基、1,8-二氮雜萘基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基以及吩噁吡基組成的組的雜環(huán)芳基。
如本申請所定義的，“芳基”基團可以分別包含一至四個取代基，該取代基分別選自由氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、烯基、炔基、氰基、羧基、碳烷氧基、1,2-二氧亞乙基、烷氧基、烯氧基或者炔氧基、烷氨基、烯氨基、炔基胺、脂肪族或者芳香族?；?、烷氧基-碳酰氨基、烷基磺酰氨基、嗎啉碳酰氨基嗎啉代碳的氨基、硫代嗎啉碳酰氨基、N-烷基胍基、芳烷氨基磺?；?、芳烷氧基烷基、N-芳烷氧基脲、N-羥基脲、N-烯基脲、N,N-(烷基，羥基)脲、雜環(huán)、硫代芳氧基取代的芳基、N,N-(芳基，烷基)烷基肼基、Ar’取代的磺酰雜環(huán)、芳烷基取代的雜環(huán)、環(huán)烷基和環(huán)烯基取代的雜環(huán)、環(huán)烷基稠合的芳基、芳氧基取代的烷基、雜環(huán)氨基、脂肪族或者芳香族酰氨基碳酰、脂肪族或者芳香族?；〈南┗?、Ar’取代的氨基碳酰氧基、Ar’,Ar’雙取代的芳基、脂肪族或者芳香族?；〈孽；?、環(huán)烷基碳酰烷基、環(huán)烷基取代的氨基、芳氧基碳酰烷基、二氨基磷酸或者酯組成的組；”Ar’”是如上所定義的具有一至三個取代基的碳環(huán)或者雜環(huán)芳基，該取代基選自由氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、烯基、炔基、1,2-二氧亞甲基、1,2-二氧亞乙基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氨基、烯氨基或者炔氨基、烷基碳酰氧基、脂肪族或者芳香族酰基、烷基碳酰氨基、烷氧基碳酰氨基、烷基磺酰氨基、N-烷基或者N,N-二烴基脲組成的組。
術語“烷氧基”(單獨地或者結合形式的)指的是烷基醚基團，其中術語“烷基”如上所定義。合適的烷基醚基團的例子包括(但并不限于)甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等等。
術語“烯氧基”(單獨地或者結合形式的)指的是烯基-O-式的基團，其中只要基團不是烯醇醚，術語“烯基”就如上所定義。合適的烯氧基的例子包括(但并不限于)烯丙氧基、E-和Z-3-甲基-2-丙烯氧基等等。
術語“炔氧基”(單獨地或者結合形式的)指的是炔基-O-式的基團，其中只要基團不是炔醇醚(ynol ether)，術語“炔基”就如上所定義。合適的炔氧基的例子包括(但并不限于)炔丙氧基、2-丁炔氧基等等。
術語“硫代烷氧基”指的是烷基-S-式的硫醚基團，其中烷基是如上所定義的。
術語“烷氨基”(單獨地或者結合形式的)指的是單或雙烷基取代的氨基基團(即烷基-NH-或者(烷基)2-N-式的基團)，其中術語“烷基”如上所定義。合適的烷氨基的例子包括(但并不限于)甲氨基、乙氨基、丙氨基、異丙氨基、叔丁氨基、N,N-二乙氨基等等。
術語“烯氨基”(單獨地或者結合形式的)指的是烯基-NH-或者(烯基)2N-式的基團，其中只要基團不是烯胺，術語“烯基”就如上所定義。這樣的烯氨基的例子是丙烯氨基。
術語“炔氨基”(單獨地或者結合形式的))指的是炔基-NH-或者(炔基)2N-式的基團，其中只要基團不是炔胺，術語“炔基”是如上所定義的。這樣的炔氨基的例子是丙炔氨基。
術語“酰胺”指的是-N(R1)-C(=O)-或者-C(=O)-N(R1)-，其中這里定義R1包括氫以及其它基團。術語“取代的酰胺”指的是其中R1不是氫的情形，而術語“非取代的酰胺”指的是R1是氫的情形。
術語“芳氧基”(單獨地或者結合形式的)指的是芳基-O-式的基團，其中芳基如上所定義。芳氧基的例子包括(但并不限于)苯氧基、萘氧基、吡啶氧基等等。
術語“芳氨基”(單獨地或者結合形式的)指的是芳基-NH-式的基團，其中芳基如上所定義。芳氨基的例子包括(但并不限于)苯氨基(N-酰苯胺)、萘氨基、2-,3-和4-吡啶氨基等等。
術語“芳基稠合的環(huán)烷基”(單獨地或者結合形式的)指的是環(huán)烷基基團，該基團與芳基共享兩個鄰近的原子，其中術語“環(huán)烷基”和“芳基”如上所定義。芳基稠合的環(huán)烷基的例子是苯稠合的環(huán)丁基。
術語“烷基碳酰氨基”(單獨地或者結合形式的)指的是烷基-COMH式的基團，其中術語“烷基”如上所定義。
術語“烷氧基碳酰氨基”(單獨地或者結合形式的)指的是烷基-OCONH-式的基團，其中術語“烷基”如上所定義。
術語“烷基磺酰氨基”(單獨地或者結合形式的)指的是烷基-SO2NH-式的基團，其中術語“烷基”如上所定義。
術語“芳基磺酰氨基”(單獨地或者結合形式的)指的是芳基-SO2NH-式的基團，其中術語“芳基”如上所定義。
術語“N-烷基脲”(單獨地或者結合形式的)指的是烷基-NH-CO-NH-式的基團，其中術語“烷基”如上所定義。
術語“N-芳基脲”(單獨地或者結合形式的)指的是芳基-NH-CO-NH-式的基團，其中術語“芳基”如上所定義。
術語“鹵素”意指氟、氯、溴和碘。
術語“烴基團”指的是碳和氫原子的排列，其僅僅需要一個氫原子以便成為一個獨立的穩(wěn)定分子。因此，烴基在碳原子上具有一個打開的價位，上述烴基團可以通過該價位結合到其它原子上。烷基、烯基、環(huán)烷基等等都是烴基團的例子。
術語“烴雙基”指的是碳和氫原子的排列，其需要兩個氫原子以便形成一個獨立的穩(wěn)定分子。因此，一個烴基團在一或者兩碳原子上具有兩個打開價位，通過該價位烴基團可以結合到其它原子上。亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基等等都是烴雙基的例子。
術語“烴基”指的是由碳和氫組成的、具有單一價位的任一穩(wěn)定排列，烴基通過該單一價位與另一部分結合，并因此包括如烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基(沒有雜原子并入芳環(huán)中)、芳烷基、烷芳基等等所熟知的基團。烴基團是烴基的另一個名稱。
術語“亞烴基(hydrocarbylene)”指的是由碳和氫組成的、具有兩個價位的任一穩(wěn)定排列，亞烴基通過該價位與其它部分結合，并因此包括亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)烯基、亞芳基(沒有雜原子并入亞芳基環(huán)中)、亞芳烷基、亞烷芳基等等。烴雙基是亞烴基的另一個名稱。
術語“烴基-O-亞烴基”指的是結合到一個氧原子上的烴基，其中氧原子同樣在兩個價位之一的位點處(在該位點亞烴基結合到其它部分上)結合到一個亞烴基上。術語“烴基-S-亞烴基”、“烴基-NH-亞烴基”和“烴基-酰胺-亞烴基”具有等同的意義，其中氧分別為硫、-NH-或者酰胺基團所取代。
術語“N-(烴基)亞烴基”指的是其中兩個價位之一結合到氮原子(該氮原子同時結合到氫和烴基上)上的亞烴基。術語“N,N-二(烴基)亞烴基”指的是其中兩個價位之一結合到氮原子(該氮原子同時結合到兩個烴基上)上的亞烴基。
術語“烴基?；?亞烴基”指的是通過?；?-C(=O)-)結合到亞烴基的兩個價位之一上的烴基。
術語“雜環(huán)烴基”和“雜環(huán)基(heterocylyl)”指的是穩(wěn)定的、環(huán)狀的原子排列，該原子包括碳原子以及可多達四個原子的雜原子(其選自氧、氮、磷和硫)。環(huán)排列可以是3-7個原子的單環(huán)形式、或者8-11個原子的雙環(huán)形式。環(huán)可以是飽和的或者不飽和的(包括芳香環(huán))，并且可以是可以不是苯稠合的。環(huán)中的氮和硫原子可以是任一氧化形式的，包括季銨化形式的氮。雜環(huán)烴基可以連接到任一橋環(huán)碳原子或者雜原子上，其結果是建立了穩(wěn)定的結構。優(yōu)選的雜環(huán)烴基包括5-7個成員的單環(huán)雜環(huán)(包含一個或者兩個氮雜原子)。
取代的雜環(huán)烴基指的是如上所定義的、其中至少一個其環(huán)原子結合到一所指出的取代基(該取代基伸展出環(huán))上的雜環(huán)烴基。
關于烴基和亞烴基基團，術語“任一前述的、其中一個或多個氫為相等數(shù)量的氟原子所取代的衍生物”指的是包含碳、氫和氟原子但不含有其它原子的分子。
術語“活化的酯”是包含“離去基團”的酯，該基團易于為如胺和醇或者巰基親核體之類的親核體所取代。這樣的離去基團是眾所周知的，并且包括(但并不限于)N-羥基琥珀酰亞胺、N-苯并三唑、鹵素(鹵化物)、包括四氟苯酚鹽的烷氧基，硫代烷氧基等等。術語“保護的酯”指的是其被掩蔽或者不以其它方式進行反應的酯基團。參見，例如Greene的“在有機溶液中的保護基”。
鑒于上述定義，遍及于本申請的其它化學術語能夠由本領域技術人員容易地理解。術語可以單獨使用或者在其任一結合中使用?；鶊F的優(yōu)選的和更優(yōu)選的鏈長運用于所有的這樣結合中。A．加標記的核酸片段的產(chǎn)生如上所述，本發(fā)明的一個方面提供了DNA測序的一般方案，該方案允許在每一條泳道上利用超過16個的標記；通過連續(xù)檢測，可以檢測到標記，并且出現(xiàn)大小分離的序列，正如用常規(guī)的基于熒光的測序一樣。這一方案適用于基于標記分子的大小分離的任一DNA測序技術。用于在本發(fā)明中的合適的標記和接頭以及用于測序核酸的方法都將在下面給以更詳細的討論。
1．標記如本文所使用的，“標記”一般指的是化學部分(其用于獨一無二地鑒定“興趣分子”)，更具體地說指的是標記可變組分以及在任一標記反應物、標記組分和標記部分中可以最緊密地結合到其上的任何基團。
用于本發(fā)明的標記具有以下幾個屬性1)它能夠與所有其它標記區(qū)別開來。與其它化學部分區(qū)別開來的鑒別能夠基于標記的色譜行為(具體是在切割反應之后)、分光或電位性質或者其綜合性質。標記可有益地區(qū)別開來的分光方法包括質譜法(MS)、紅外(IR)、紫外(UV)以及熒光，其中MS、IR和UV是優(yōu)選的，并且MS是更優(yōu)選的分光方法。電位電流分析是一種優(yōu)選的電位滴定法。
2)當存在10-22至10-6摩爾的量時，能夠檢測到標記。
3)標記具有一個化學柄，通過該化學柄標記連接到MOI(標記是用來獨一無二地鑒定它的)上。可以直接或者通過“接頭”基團間接地連接到MOI上。
4)標記對所有對其進行的操作來說是化學上穩(wěn)定的，該操作包括連接和從MOI上切割以及當標記連接到其上時MOI的任一操作。
5)當標記連接到MOI上時，標記不嚴重地干擾對MOI所進行的操作。例如，如果標記連接到寡核苷酸上，標記不應該嚴重干擾在寡核苷酸上進行的任一雜交或者酶促反應(例如PCR測序反應)。同樣地，如果標記連接到抗體上，它不應該嚴重干擾抗體的抗原識別。
標記部分(其旨在由一定的分光或者電位滴定方法檢測)應該具有這些可提高上述方法的檢測靈敏度和專一性的性質。典型地，標記部分將具有這些性質，因為它們已設計成標記可變組分(其將典型地構成標記部分的主要組分)。在下列討論中，“標記”一詞的使用典型地指的是標記部分(即包含標記可變組分的切割產(chǎn)物)，然而也能夠認為其指的是標記可變組分自身，因為其是標記部分的一部分(該部分典型地負責提供獨一無二的可檢測的性質)。在T-L-X式的化合物中，“T”部分將包含標記可變組分。當標記可變組分設計成可由如質譜法鑒定時，T-L-X的“T”部分可以稱作為Tms。同樣地，得自T-L-X的、包含T的切割產(chǎn)物可以稱作為包含Tms的部分。下列分光和電位滴定方法可以用來鑒定包含Tms的部分。
a．MS標記的特征當標記可由質譜法分析時(即當標記是MS易讀標記(在這里也稱作MS標記或者“包含Tms的部分”)時)，標記的基本特征是能夠離子化。因此在其中合并一個化學官能團(其在MS中的離子化條件之下能夠攜帶正或負電荷)，這在易讀標記的設計中是優(yōu)選的因素。這一特征使離子形成的效率提高和賦予更大的總體檢測靈敏度，特別是在電噴射離子化中。攜帶離子化電荷的化學官能團可以得自Tms或L或者兩者。在例如Sunner,J.等，分析化學，60:1300-1307(1988)中討論了能夠增加分析物(由質譜法檢測)的相對靈敏度的因素。
便利于攜帶負電荷的優(yōu)選官能團是有機酸，例如酚式羥基、羧酸、膦酸酯、磷酸酯、四唑、磺?；?、全氟醇和磺酸。
在離子化條件之下便利于攜帶正電荷的優(yōu)選官能團是脂肪族或者芳香族胺類。胺官能團(其使得MS標記的檢測限提高)的例子包括季銨類(即具有四個鍵的、每一個都結合到碳原子上的胺類，參見Aebersold，美國專利5,240,859)和叔胺類(即具有三個鍵的、每一個鍵都結合碳原子的胺類，該胺類包括如存在于吡啶中的C=N-C基團，參見Hess等，分析生物化學，224:373,1995:Bures等，分析生物化學，224:364,1995)。特別優(yōu)選的是有立體障礙的叔胺類。叔胺類和季胺類可以是烷基或者芳基。包含Tms的部分必須攜帶至少一個可離子化的物種，但是可以具有超過一個的可離子化的物種。優(yōu)選的電荷狀態(tài)是每個標記攜帶單一的離子化的產(chǎn)物。因此，優(yōu)選的是每一個包含Tms的部分(和每一個標記可變組分)僅僅包含單一的有立體障礙的胺或者有機酸基團。
合適的包含胺的基團(可以形成包含Tms的部分的一部分)包括下列基團
利用質譜法的標記的鑒定優(yōu)選基于它的分子量與電荷比率(m/z)。MS標記的優(yōu)選的分子量范圍為大約100至2,000道爾頓，優(yōu)選的包含Tms的部分具有至少大約250道爾頓的質量，更優(yōu)選的至少大約300道爾頓，更加優(yōu)選的大約350道爾頓。由質譜儀區(qū)別含有小于大約200-250道爾頓(取決于精確的儀器)的質量的母離子的部分通常是困難的，因此優(yōu)選的本發(fā)明的包含Tms的部分具有大于該范圍的質量。
如上所說明的，包含Tms的部分可以包含不同于存在于標記可變組分中的那些原子的原子，事實上是不同于存在于Tms本身中的那些原子。因此，Tms本身的質量可以少于大約250道爾頓，只要包含Tms的部分具有至少大約250道爾頓的質量。因此，Tms的質量可以變化于15(即一個甲基基團)至大約10,000道爾頓的范圍之內，優(yōu)選的變化于100至大約5,000道爾頓的范圍之內，更優(yōu)選的變化于大約200至大約1000道爾頓的范圍之內。
當那些標記合并到具有多于一種的同位素處于十分豐富狀態(tài)的那些原子上時，由質譜法區(qū)別標記是比較困難的。因此，優(yōu)選的T基團(其預期用于質量分光鑒定(Tms基團))包含至少一個碳、氫和氟原子以及可有可無的原子(選自原子氧、氮、硫、磷和碘)。而其它原子可以存在于Tms中，他們的存在可能有點使質譜數(shù)據(jù)的分析更困難。優(yōu)選地，除氫和/或氟原子之外，Tms基團僅僅具有碳、氮和氧原子。
氟原子也是可有可無的存在于Tms基團中的優(yōu)選原子。與氫相比，當然氟原子重得多。因此，氟原子原子的存在比氫原子更易導致高質量的Tms，由此使得Tms基團達到和超過大于250道爾頓的質量(該質量如上所說明是所需的)。此外，用氟原子置換氫能賦予包含Tms的部分以更大的揮發(fā)性，分析物的更大揮發(fā)性提高了靈敏度(當質譜法用作為檢測方法時)。
Tms的分子式落在C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ的范圍之內，其中α、β和δ的總數(shù)足以滿足C、N、O、S和P原子所沒有滿足的價。C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ表達式意指Tms至少包含一個且可以包含1至500個任意數(shù)目的碳原子，此外還可選擇地包含多達100個氮原子(“N0-”意指Tms不包含任一氮原子)和多達100個氧原子以及多達10個硫原子和多達10個磷原子。符號α、β和δ表示在Tms中氫、氟原子以及碘化物原子的數(shù)量，其中這些數(shù)量的任兩個可以是零，并且其中這些數(shù)量的總數(shù)等于C、N、O、S和P原子所沒有滿足的價的總數(shù)。優(yōu)選地，Tms具有落在C1-50N0-10O0-10HαFβ的范圍之內的分子式，其中α和β的總數(shù)分別等于存在于部分中的氫和氟原子原子的數(shù)量。
b．IR標記的特征有兩種基本形式的有機化學基團的IR檢測法拉曼散射IR和吸收IR。拉曼散射IR光譜和吸收IR光譜是互補分光方法。一般來說，拉曼激發(fā)取決于鍵極化度變化而IR吸收取決于鍵偶極矩變化。弱IR吸收線成為強拉曼線，反之亦然。波數(shù)是IR光譜的特征單位。有3個光譜區(qū)域用于IR標記，這些標記單獨應用在12500至4000cm-1的近IR、在4000至600cm-1的中IR、在600至30cm-1的遠IR。對于這里所描述的應用(其中化合物用作為標記以鑒定MOI、探針或者引物)來說，中光譜區(qū)域將是優(yōu)選的。例如，羰基段(1850至1750cm-1)將用于測量羧酸，羧酸酯和酰胺，以及烷基和芳基碳酸鹽、氨基甲酸酯和酮。N-H彎曲(1750至160cm-1)將用來鑒定胺類、銨離子以及酰胺類。在1400至1250cm-1,R-OH彎曲以及在酰胺中的C-N段得到檢測。在900至690cm-1檢測芳族取代模式(ArNH的C-H彎曲、N-H彎曲)。飽和的C-H、烯烴、芳香環(huán)、雙鍵和三鍵、酯類、乙縮醛、酮縮醇、銨鹽、N-O化合物(如肟、硝基、N-氧化物以及硝酸鹽)、偶氮、腙類、醌類、羧酸、酰胺以及內酰胺，這所有都具有振動紅外相關數(shù)據(jù)(參見Pretsch等，有機化合物結構測定的光譜數(shù)據(jù)，Springer-Verlag，紐約，1989)。優(yōu)選的化合物將包括芳香族腈，其在2230至2210cm-1顯示了十分強大的腈拉伸振動。其它有用的化合物類型是芳香族炔，其具有強大的拉伸振動(該振動在2140和2100cm-1之間引起的一個強烈的吸收譜帶)。第三種化合物類型是芳香族疊氮化物，其在2160至2120cm-1之間顯示一個強烈的吸收譜帶。硫氰酸鹽是在2275至2263cm-1之間具有強烈吸收的代表性化合物。
c．UV標記的特征有機生色團類型和他們各自的UV-可見性質的匯編在Scott(天然產(chǎn)物的UV光譜的解讀，Permagon出版社，紐約，1962)中給出。生色團是負責具體的光吸收的一個原子或者一組原子或者電子。對于共軛體系中的π至π*最大值而言，存在經(jīng)驗性的法則(參見Pretsch等，有機化合物結構測定的光譜數(shù)據(jù)，P.B65和B70,Springer-Verlag，紐約，1989)。優(yōu)選的化合物(伴隨共軛體系)將具有n至π和π至π*過渡。這樣的化合物的例子有酸性紫7、吖啶橙、吖啶黃G、亮藍G、剛果紅、結晶紫、孔雀綠草酸鹽、酸性間胺黃、亞甲藍、甲基橙、甲基紫B、萘酚綠B、油藍N、油紅O、4-苯偶氮基酚、Safranie O(堿性藏紅O)、溶劑綠3以及蘇丹橙G，所有這些都是有市售的(Aldrich,Milwaukee,WI)。其它合適的化合物列出在例如Jane,I.等，J.Chron 323:191-225(1985)中。
d．熒光標記的特征熒光探針由他們的吸收和熒光發(fā)射的波長和強度來最直接地鑒定和量化。發(fā)射光譜(熒光和磷光)更為靈敏，并且相比于吸收光譜而言允許進行更具體的測量。其它的光物理特征(如激發(fā)態(tài)壽命和熒光各向異性)是較少廣泛地利用的。最一般利用的強度參數(shù)是吸收的摩爾消光系數(shù)(ε)以及熒光的量子產(chǎn)額(QY)。ε值具體到單一波長(通常指探針的最大吸收值)，而QY是覆蓋整個熒光光譜輪廓的總光子發(fā)射量的測量值。一種狹窄的光學帶寬(＜20nm)通常用于熒光激發(fā)(經(jīng)由吸收)，而熒光檢測帶寬則是更為可變的，變化范圍為從最大靈敏度的全光譜至最大分辨率的狹窄帶(～20nm)。每探針分子的熒光強度是與ε和QY的測定結果成比例的。在具有當前的實際重要性的熒光團中的這些參數(shù)的范圍是ε為大約10,000至100,000cm-1M-1,QY為0.1至1.0。能夠用作熒光標記的化合物如下熒光素、羅丹明、λ藍470、λ綠、λ紅664、λ紅665、吖啶橙以及碘化丙錠，這些都是由λ熒光公司(Pleasant Gap,PA)市售的。熒光化合物(如尼羅紅、德克薩斯紅、lissamineTM、BODIPYTMs)是由MolecularProbes(Eugene,OR)提供的。
e．電位滴定標記的特征電化檢測(ECD)的原則是基于化合物的氧化或者還原(在一定的應用電壓下，將供給或者接受電子因而產(chǎn)生可以測量到的電流)。當使一定的化合物處于電勢差下時，在工作電極表面，分子隨著電子的失去(氧化)或者獲得(還原)經(jīng)歷了分子重排，一般認為這樣的化合物是電子的并且經(jīng)歷了電化學反應。EC檢測器施加電壓于電極表面(HPLC洗脫液流動于其上)。從柱上洗脫的電活化化合物或者給出電子(氧化)或者獲取電子(還原)從而及時產(chǎn)生一個電流峰。重要地，所產(chǎn)生的電流量取決于分析物的濃度和所施加的電壓(每一化合物具有具體的電壓，在該電壓下該化合物開始氧化和還原)兩個方面。當前最普及的電化學檢測器是電流檢測器(其中電勢保持常量，然后測量由電化學反應產(chǎn)生的電流)。當前將這種類型光譜測定法稱為“恒電位電流分析法”。市售電流計由ESA Inc.,Chelmford,MA提供。
當檢測的效率是100％時，專門的檢測器名為“庫侖檢測器”。庫侖檢測器是靈敏的，該靈敏性具有關于選擇性和靈敏度方面(使這些類型的檢測器有用于成批檢測中)的許多實用性優(yōu)點。在庫侖檢測器中，對于一種給定濃度的分析物，信號電流設定為施加于工作電極的電勢(電壓)的函數(shù)。所產(chǎn)生的S形曲線圖稱為電流-電壓曲線或者流體動力電量圖(hydrodynamic voltammagram)(HDV)。HDV使施加于工作電極(使檢測器最大化所觀察的信號)的電勢得到最好的選擇。ECD的主要優(yōu)點在于它的在亞飛姆托摩爾(subfemtomole)范圍內對檢測的電流水平的固有靈敏度。
許多化學藥品和化合物在電化學方面是活躍的，包括許多生物化學藥品、藥物和殺蟲劑。能夠有效地分辨以色譜方法共洗脫的化合物，即使半波電勢(在半信號最大值的電勢)由僅僅30-60mV區(qū)別。
當在基于液相色譜的分離中用作為檢測器時，前不久發(fā)展的遺傳庫侖傳感器提供了共洗脫化合物的選擇性、鑒定特征以及分辨率。因此，這些組合的檢測器加入另一系列的在檢測器自身中完成的分離。當前的儀器具有16個通道，其在理論上僅僅受速率(數(shù)據(jù)能夠以該速率獲取)限制。在EC系統(tǒng)上能夠分辨的化合物的數(shù)量受到色譜方面的限制(即平板計數(shù)限制)。然而，如果以色譜共洗脫的兩個或者多個化合物在30-60mV的半波電勢中有差別，則系統(tǒng)能夠區(qū)別該化合物?；衔锾幱陔娀瘜W活性狀態(tài)的能力取決于是否具有EC活性基團(即-OH-、-O、-N、-S)。
利用庫侖檢測器已成功地檢測出的化合物包括5-羥基色胺、3-甲氧基-4-羥苯基-乙二醇、尿黑酸、多巴胺、間甲腎上腺素、3-羥基犬尿氨酸、acetominophen、3-羥基色醇、5-羥基吲哚乙酸、辛基磺酸、酚、O-甲酚、焦櫚酚、2-硝化苯酚、4-硝化苯酚、2,4-二硝化苯酚、4,6-二硝基甲酚、3-甲基-2-硝化苯酚、2,4-二氯酚、2,6-二氯酚、2,4,5-三氯酚、4-氯-3-甲酚、5-甲酚，4-甲基-2-硝化苯酚、2-羥基苯胺、4-羥基苯胺、1,2-苯二胺、苯并兒茶素、丁脲酮(buturon)、chlortboluron、二脲酮(diuron)、isoproturon、利農(nóng)倫、methobromuron、metoxuron、單利農(nóng)倫、monuron、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸、4-氨氨基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基香豆酸、7-甲氧基香豆素、芹菜苷配基黃芩黃素、咖啡酸、兒茶素、棕鱗矢車菊苷、綠原酸、黃豆苷原、橡精、地奧亭、表兒茶素焙酸鹽、表焙兒茶素、表焙兒茶素焙酸鹽、丁子香酚、半齒澤蘭素、阿魏酸、非瑟酸、高良姜精、鎵酸、梔子素、染料木黃酮、龍膽酸、橙皮苷、野鳶尾黃素、莰非醇、leucoyanidin、木犀草素、楝子素、桑色素、楊梅黃酮、柚苷、narirutin、花葵素、甲基花青素、根皮素、紅車軸草素、原兒茶酸、鼠李亭、五羥黃酮、櫻花亭、黃芩配基、莨菪亭、丁香醛、丁香酸、柑桔黃酮、三羥乙基蘆丁、傘形酮、香草酸、1,3-二甲基四氫異喹啉、6-羥基多巴胺、r-沙索林酚(r-salsolinol)、N-甲基-r-沙索林酚、四氫異喹啉、阿米替林、阿樸嗎啡、辣椒堿、利眠寧、氯丙嗪、道諾紅菌素、去郁敏、多塞平、fluoxetine、氟西泮、丙咪榛、異丙基腎上腺素、甲氧明、嗎啡、嗎啡-3-葡萄糖醛酸化物、去甲替林、奧沙西泮、苯福林、三甲丙咪嗪、抗壞血酸、N-乙酰血清素、3,4-二羥基芐胺、3,4-二羥基苦杏仁酸(DOMA)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、3,4-二羥基苯基丙氨酸(L-DOPA)、3,4-二羥基苯乙二醇(DHPG)、3-羥基鄰氨基苯甲酸、2-羥基苯乙酸(2HPAC)、4-羥基苯甲酸(4HBAC)、5-羥基吲哚3-乙酸(SHIAA)、3-羥基犬尿氨酸、3-羥基苦杏仁酸，3-羥基-4-甲氧基苯乙胺、4-羥基苯乙酸(4HPAC)、4-羥苯基乳酸(4HPLA)、5-羥基脲(5HTP)、5-羥基色醇(5HTOL)、5-羥色胺(5HT)、5-羥色胺硫酸鹽、3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇(MHPG)、5-甲氧基色胺、5-甲氧基色氨酸、5-甲氧基色醇、3-甲氧基酪胺(3MT)、3-甲氧基酪氨酸(3-OM-DOPA)、5-甲基半胱氨酸、3-甲基鳥嘌呤、蟾毒色胺、多巴胺、多巴胺-3-葡萄糖醛酸化物、多巴胺-3-硫酸鹽、多巴胺-4-硫酸鹽、腎上腺素、麻黃寧、葉酸、谷胱甘肽(還原的)、鳥嘌呤、鳥苷、尿黑酸(HGA)、高香草酸(HVA)、高香草醇(HVOL)、高藜蘆酸、hva硫酸鹽、次黃嘌呤、吲哚、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乳酸、犬尿氨酸、褪黑素、間甲腎上腺素、N-甲基色胺、N-甲基酪胺、N,N-二甲基色胺、N,N-二甲基酪胺、去甲腎上腺素、去甲變腎上腺素、真蛸胺、吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆胺、脫氧腎上腺素、色醇、色胺、酪胺、尿酸、香草扁桃酸(vma)、黃嘌呤和黃苷。其它合適的化合物發(fā)表在例如Jane,I.等，色譜學雜志323:191-225(1985)和Musch,G.等，色譜學雜志348:97-110(1985)中。這些化合物可以用本領域所熟知的方法結合到T-L-X式的化合物中。例如，具有羧酸基團的化合物可以與胺、羥基等進行反應從而形成酰胺、酯和其它的T與L之間的鍵。
除上述性質之外，不論打算使用何種檢測方法，標記具有模塊的化學結構是優(yōu)選的。這有助于利用組合化學的技術構建大量的在結構上相關的標記。例如，Tms基團需要具有幾個性質。當對包含Tms的部分進行質譜法分析時，它需要包含攜帶單一的離子化電荷狀態(tài)的官能團(還簡稱為“質譜靈敏度增強子”基團或者MSSE)。此外，它需要能夠作為包含Tms的部分的家族中的一個成員，該家族成員的每一個都具有不同的質量/電荷比，但在質譜儀中都具有近似相同的靈敏度。因此，家族成員需要具有相同的MSSE。為了使上述的化合物家族得以建立，發(fā)現(xiàn)經(jīng)由模塊合成方案產(chǎn)生標記反應物是便利的，所以可以認為組分本身包含模塊。
在優(yōu)選的產(chǎn)生Tms基團的結構的方法中，Tms具有式T2-(J-T3-)n-其中T2是由碳和一個或多個氫、氟、碘、氧、氮、硫以及磷形成的有機部分(具有15至500道爾頓的質量范圍)；T3是由碳和一個或多個氫、氟、碘、氧、氮、硫以及磷形成的有機部分(具有50至1000道爾頓的質量范圍)；J是一個直接鍵或者官能團(如酰胺、酯、胺、硫化物、醚、硫酯、二硫化物、硫醚、脲、硫脲、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸鹽、席夫堿、還原的席夫堿、亞胺、肟、腙、磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺(phosphonamide)、磺酸酯、氨磺酰或者碳-碳鍵；n是1至50之間的整數(shù)，所以當n大于1時每個T3和J是分別選擇的。
模塊結構T2-(J-T3-)n-提供了一種方便地得到T-L-X化合物的家族的方法，其中家族的每一個成員都具有不同的T基團。例如，當T是Tms且每一家族成員需要具有相同的MSSE時，T3基團之一可以提供該MSSE結構。為了提供按照Tms質量的家族成員之間的變異性，T2基團可以在家族成員之間變化。例如，一個家族成員可以有T2=甲基，而另一個有T2=乙基，另一個有T2=丙基，等等。
為了在質量方面提供的“重的”或者大的跳躍基團，可以通過加入有效的(例如一或者幾百)質量單位于T-L-X中來設計T3基團。這樣的T3基團可以稱作分子量范圍調節(jié)基團(“WRA”)。如果其與單一系列的T2基團一起起作用(其中將有質量伸展超出限定的范圍)，WRA是十分有用。僅僅通過把一個或多個WRA T3基團結合到Tms中，就可以用單一系列的T2基團來產(chǎn)生具有寬廣的質量范圍的Tms基團。因此，利用一個簡單的例子，如果一系列T2基團為Tms提供了250-340道爾頓的質量范圍，那么單一WRA(具有如T3基團一樣的100道爾頓的范例數(shù))的加入提供了產(chǎn)生350-440道爾頓質量范圍的方法(當利用相同系列T2基團時)。同樣地，兩個100道爾頓的MWA基團的加入(每個作為一個T3基團)提供了產(chǎn)生450-540道爾頓的質量范圍的方法，其中WRA基團的逐漸加入不斷地提供了產(chǎn)生大質量范圍Tms基團的方法。優(yōu)選的T2-(J-T3-)n-L-X式的化合物具有RVWC-(RVWA)W-RMSSE-L-X式，其中VWC是“T2”基團，并且每一個WRA和MSSE基團都是“T3”基團。在圖12中說明了這一結構，該結構表示Tms制劑的模塊近似值。
在T2-(J-T3-)n-式中，T2和T3優(yōu)選地選自烴基、烴基-O-亞烴基、烴基-S-亞烴基、烴基-NH-亞烴基、烴基-酰胺-亞烴基、N-(烴基)亞烴基、N,N-二(烴基)亞烴基、烴基?；?亞烴基、雜環(huán)烴基(其中雜原子選自氧、氮、硫和磷)、取代的雜環(huán)烴基(其中雜原子選自氧、氮、硫和磷，取代基選自烴基、烴基-O-亞烴基、烴基-NH-亞烴基、烴基-S-亞烴基、N-(烴基)亞烴基、N,N-二(烴基)亞烴基和烴基?；?亞烴基)。此外，T2和/或T3可以是上列之任一的潛在的T2/T3基團的衍生物(結果是其中的一個或多個氫為氟原子所取代)。
此外關于T2-(J-T3-)n-式，優(yōu)選T3具有-G(R2)-式，其中G是具有單一R2取代基的C1-6亞烷基鏈。因此，如果G是1,2-亞乙基(-CH2-CH2-)，那么1,2-亞乙基的兩個碳之任一個可以具有R2取代基，并且R2選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基稠合的環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、芳烷基、芳基取代的烯基或者炔基、環(huán)烷基取代的烷基、環(huán)烯基取代的環(huán)烷基、聯(lián)芳基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、芳基取代的烯氧基或者炔氧基、烷氨基、烯氨基或者炔氨基、芳基取代的烷氨基、芳基取代的烯氨基或者炔氨基、芳氧基、芳氨基、N-烷基脲取代的烷基、N-芳基脲取代的烷基、烷基碳酰氨基取代的烷基、氨基碳酰取代的烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基取代的烷基、雜環(huán)基取代的氨基、羧基烷基取代的芳烷基、氧代碳環(huán)稠合的芳基和雜環(huán)烷基；環(huán)烯基、芳基取代的烷基和芳烷基、羥基取代的烷基、烷氧基取代的烷基、芳烷氧基取代的烷基、烷氧基取代的烷基、芳烷氧基取代的烷基、氨基取代的烷基、(芳基取代的烷氧碳酰氨基)取代的烷基、巰基取代的烷基、烷基磺酰取代的烷基、(羥基取代的烷基硫代)取代的烷基、硫代烷氧基取代的烷基、烴基酰氨基取代的烷基、雜環(huán)酰氨基取代的烷基、烴基取代的雜環(huán)酰氨基取代的烷基、烷基磺酰氨基取代的烷基、芳基磺酰氨基取代的烷基、嗎啉烷基、硫代嗎啉烷基、嗎啉羰基取代的烷基、硫代嗎啉羰基取代的烷基、[N-(烷基、烯基或者炔基)-或者N,N-[二烷基、二烯基、二炔基或者(烷基、烯基)-氨基]羰基取代的烷基、雜環(huán)氨基碳酰、雜環(huán)亞烷氨基碳酰、雜環(huán)氨基碳酰取代的烷基、雜環(huán)亞烷氨基碳酰取代的烷基、N,N-[二烷基]亞烷氨基碳酰、N,N-[二烷基]亞烷氨基碳酰取代的烷基、烷基取代的雜環(huán)羰基、烷基取代的雜環(huán)羰基-烷基、羧基取代的烷基、二烷氨基取代的酰氨基烷基和氨基酸側鏈(選自精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、S-甲基半胱氨酸、甲硫氨酸以及其相應的亞砜和砜衍生物、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、別異亮氨酸、叔亮氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、組氨酸、谷酰胺、纈氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天門冬氨酸、β氰丙氨酸和別蘇氨酸)；alynyl和雜環(huán)羰基、氨基碳酰、酰氨基、單或者二烷氨基碳酰、單或者二芳氨基碳酰、烷芳氨基碳酰、二芳氨基碳酰、單或者二酰氨基碳酰、芳香族或者脂肪族?；⒖梢砸部梢圆挥蛇x自氨基、羧基、羥基、巰基、單或者二烷氨基、單或者二芳氨基、烷芳氨基、二芳氨基、單或者二酰氨基、烷氧基、烯氧基、芳氧基、硫代烷氧基、硫代烯氧基、硫代炔氧基、硫代芳氧基和雜環(huán)的取代基取代的烷基。
式T2-(J-T3-)n-L-X的優(yōu)選化合物具有結構
其中G是(CH2)1-6(由此在一個而且僅有一個CH2基團(由單一“G”表示)上的氫為-(CH2)c-酰胺-T4取代)；T2和T4是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機部分(由此α和β的總數(shù)足以滿足C、N和O原子所沒有滿足價)；酰胺是-N(R1)-CO-或-CO-N(R1)-；R1是氫或者C1-10烷基；c是0至4之間的整數(shù)；n是1至50之間的整數(shù)(由此當n大于1時，G、c、酰胺、R1和T4分別選擇)。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，T2-(J-T3-)n-L-X式的化合物具有結構
其中T5是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機部分(由此α和β的總數(shù)足以滿足C、N以及O原子所沒有滿足的價)；T5包括叔或季銨或者有機酸；m是0-49之間的整數(shù)，T2、T4、RI、L和X如前所定義。
另一個優(yōu)選的具有T2-(J-T3-)n-L-X式的化合物具有具體的結構
其中T5是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機部分(由此α和β的總數(shù)足以滿足C、N以及O原子所沒有滿足的價)；T5包括叔或者季銨或者有機酸；m是0-49之間的整數(shù)，T2、T4、c、R1、“酰胺”、L和X如前所定義。
在具有T5基團的上述結構中，-酰胺-T5優(yōu)選地是下列結構之一，這些結構可便利地由使有機酸與伸展出“G”的游離氨基進行反應來得到
其中上述化合物具有T5基團，并且“G”基團具有游離的羧基(或者其活性等價物)，下列是優(yōu)選的-酰胺-T5基團，該基團可以便利地通過使適當?shù)挠袡C胺與伸展出“G”基團的羧基進行反應來制備
在本發(fā)明的三個優(yōu)選實施方案中，T-L-MOI具有結構
或者結構
或者結構
其中T2和T4是式C1-25N0-9O0-9S0-3P0-3HαFβIδ的有機部分(由此α、β和δ的總數(shù)足以滿足C、N、O、S和P原子所沒有滿足的價)；G是(CH2)1-6(其中一個而且只有一個在由每個G表示的CH2基團上的氫為-(CH2)c-酰胺-T4所取代；酰胺是-N(R1)-CO-或-CO-N(R1)-；R1是氫或者C1-10烷基；c是0至4之間的整數(shù)；“C2-C10”表示具有2至10個碳原子的亞烴基基團，“ODN-3’-OH”表示具有3’末端的羥基的核酸片段(即在除核酸片段的3’末端外的其它部位處結合至(C1-C10)的核酸片段；n是1至50之間的整數(shù)(此時當n大于1時，G、c、酰胺、R1和T4是分別選擇的)。優(yōu)選地，沒有三個雜原子結合到單一碳原子上。
在上述的結構(包含T2-C(=O)-N(R1)-基團)中，T2-C(=O)-N(R1)-基團可以通過使HN(R1)-式的胺與選自下列有機酸的有機酸進行反應來形成(這僅僅是一個范例而并不構成所有潛在的有機酸的詳盡列表)甲酸、乙酸、丙炔酸、丙酸、氟乙酸、2-丁炔酸、環(huán)丙烷羧酸、丁酸、甲氧基乙酸、二氟乙酸、4-戊炔酸、環(huán)丁烷羧酸、3,3-甲基丙烯酸、戊酸、N,N-二甲基甘氨酸、N-甲?；?甘氨酸-OH、乙氧基乙酸、(甲硫基)乙酸、吡咯-2-羧酸、3-呋喃甲酸、異噁唑-5-羧酸、反-3-己烯酸、三氟乙酸、己酸、Ac-甘氨酸-OH、2-羥基-2-甲基丁酸、苯甲酸、煙酸、2-吡嗪羧酸、1-甲基-2-吡咯羧酸、2-環(huán)戊烯-1-乙酸、環(huán)戊基乙酸、(S)-(-)-2-吡咯烷酮-5-羧酸、N-甲基-L-脯氨酸、庚酸、Ac-B-丙氨酸-OH、2-乙基-2-羥基丁酸、2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸、對甲苯甲酸、6-甲基煙酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、2,5-二甲基吡咯-3-羧酸、4-氟苯甲酸、3,5-二甲基異噁唑-4-羧酸、3-環(huán)戊基丙酸、辛酸、N,N-二甲基琥珀酰胺酸、苯丙炔酸、肉桂酸、4-乙基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸、1,2,5-三甲基吡咯-3-羧酸、3-氟-4-甲基苯甲酸、Ac-DL-炔丙基甘氨酸、3-(三氟甲基)丁酸、1-哌啶丙酸、N-乙酰脯氨酸、3,5-二氟苯甲酸、Ac-L-纈氨酸-OH、吲哚-2-羧酸、2-苯并呋喃羧酸、苯并三唑-5-羧酸、4-正丙基苯甲酸、3-二甲氨基苯甲酸、4-乙氧基苯甲酸、4-(甲硫基)苯甲酸、N-(2-糠酰)甘氨酸、2-(甲硫基)煙酸、3-氟-4-甲氧基苯甲酸、Tfa-甘氨酸-OH、2-萘甲酸(Napthoic acid)、喹哪啶酸、Ac-L-異亮氨酸-OH、3-甲基茚-2-羧酸、2-喹喔啉羧酸、1-甲基吲哚-2-羧酸、2,3,6-三氟苯甲酸、N-甲?；?L-蛋氨酸-OH、2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸、4-正丁基苯甲酸、N-苯甲酰甘氨酸、5-氟代吲哚-2-羧酸、4-正丙氧基苯甲酸、4-乙?；?3,5-二甲基-2-吡咯羧酸、3,5-二甲氧基苯甲酸、2,6-二甲氧基煙酸、環(huán)己烷戊酸、2-萘乙酸、4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸、吲哚-3-丙酸、間三氟甲基苯甲酸、5-甲氧基吲哚-2-羧酸、4-戊基苯甲酸、Bz-b-丙氨酸-OH、4-二乙氨基苯甲酸、4-正丁氧基苯甲酸、3-甲基-5-CF3-異噁唑-4-羧酸、3,4-二甲氧苯基乙酸、4-聯(lián)苯羧酸、新戊酰-脯氨酸-OH、辛?；?甘氨酸-OH、(2-萘氧基)乙酸、吲哚-3-丁酸、4-(三氟甲基)苯乙酸、5-甲氧基吲哚-3-乙酸、4-(三氟甲氧基)苯甲酸。Ac-L-苯丙氨酸-OH、4-戊氧基苯甲酸、Z-甘氨酸-OH、4-羧基-N-(呋喃-2-甲基)吡咯烷-2-酮、3,4-二乙氧基苯甲酸、2,4-二甲基-5-CO2Et-吡咯-3-羧酸、N-(2-氟苯)琥珀酰胺酸、3,4,5-三甲氧基苯甲酸、N-苯氨茴酸、3-苯氧基苯甲酸、壬酰-甘氨酸-OH、2-苯氧基吡啶-3-羧酸、2,5-二甲基-1-苯基吡咯-3-羧酸、反-4-(三氟甲基)肉桂酸、(5-甲基-2-苯基噁唑-4-基)乙酸、4-(2-環(huán)己烯氧基)苯甲酸、5-甲氧基-2-甲基吲哚-3-乙酸、反-4-可替寧羧酸、Bz-5-氨基戊酸、4-己氧基苯甲酸、N-(3-甲氧苯基)琥珀酰胺酸、Z-Sar-OH、4-(3,4-二甲氧苯基)丁酸、Ac-o-氟代-DL-苯丙氨酸-OH、N-(4-氟苯)戊酰胺酸、4’-乙基-4-聯(lián)苯羧酸、1,2,3,4-四氫化吖啶羧酸、3-苯氧基苯乙酸、N-(2,4-二氟苯基)琥珀酰胺酸、N-癸?；?甘氨酸-OH、(+)-6-甲氧基-a-甲基-2-萘乙酸、3-(三氟甲氧基)肉桂酸、N-甲?；鵇L-Trp-OH、(R)-(+)-a-甲氧基-a-(三氟甲基)苯乙酸、Bz-DL-亮氨酸-OH、4-(三氟甲氧基)苯氧基乙酸、4-庚氧基苯甲酸、2,3,4-三甲氧基肉桂酸、2,6-二甲氧苯甲酰-甘氨酸-OH、3-(3,4,5-三甲氧苯基)丙酸、2,3,4,5,6-五氟苯氧基乙酸、N-(2,4-二氟苯基)戊酰胺酸、N-十一酰-甘氨酸-OH、2-(4-氟代苯甲?；?苯甲酸、5-三氟甲氧基吲哚-2-羧酸、N-(2,4-二氟苯基)二甘醇酰胺酸、Ac-L-Trp-OH、Tfa-L-苯基甘氨酸-OH、3-碘代苯甲酸、3-(4-正戊基苯甲酰)丙酸、2-苯基-4-喹啉羧酸、4-辛氧基苯甲酸、Bz-L-蛋氨酸-OH、3,4,5-三乙氧基苯甲酸、N-月桂酰-甘氨酸-OH、3,5-雙(三氟甲基)苯甲酸、Ac-5-甲基-DL-Trp-OH、2-碘代苯乙酸、3-碘代-4-甲基苯甲酸、3-(4-正己基苯甲酰)丙酸、N-己酰-L-苯丙氨酸-OH、4-壬氧基苯甲酸、4’-(三氟甲基)-2-聯(lián)苯羧酸、Bz-L-苯丙氨酸-OH、N-十三酰-甘氨酸-OH、3,5-雙(三氟甲基)苯乙酸、3-(4-正庚基苯甲酰)丙酸、N-庚酰(Hepytanoyl)-L-苯丙氨酸-OH、4-癸氧基苯甲酸、N-(α,α,α-三氟間甲苯基)鄰氨基苯甲酸、尼氟滅酸、4-(2-羥基六氟異丙基)苯甲酸、N-豆蔻酰-甘氨酸-OH、3-(4-正辛基苯甲酰)丙酸、N-辛酰-L-苯丙氨酸-OH、4-十一烷氧基苯甲酸、3-(3,4,5-三甲氧苯基)丙酰-甘氨酸-OH、8-碘代萘甲酸、N-十五酰-甘氨酸-OH、4-十二烷氧基苯甲酸、N-棕櫚酰-甘氨酸-OH以及N-硬脂酰-甘氨酸-OH。這些有機酸可獲自一個或多個廠商現(xiàn)代化學技術公司，Louisville,KY；Bachem生物科學公司，Torrance,CA；Calbiochem-Novabiochem公司，San Diego,CA；Farchan實驗室公司，GainesvilleFL；Lancaster Synthesis,Windham NH；以及MayBridge化學公司(c/oRyan科學公司)，Columbia,SC。來自這些公司的商品目錄利用以上用于限定酸的縮寫。
f用于制備標記的組合化學組合化學是一種合成方法，該方法導致化學文庫(參見，例如PCT申請出版物WO94/08051)的大量產(chǎn)生。這些組合文庫能夠用作為鑒定興趣(MOIs)分子的標記。組合化學可以被定義為系統(tǒng)的和重復的共價連接一系列相互變化結構(結構之間的相互變化產(chǎn)生大量的多樣化分子實體)的不同“構件”。構件可以采取多種形式，天然存在的和合成的均可，如親核試劑、親電子試劑、二烯類、烷化劑或者?；瘎⒍?、核苷酸、氨基酸、食糖、脂類、有機單體、合成纖維以及上述物質的混合物。用于連接構件的化學反應可以包括烷基化、?；⒀趸?、還原、水解、取代、消去、加成、環(huán)化、縮合等等。這種方法能夠產(chǎn)生化合物的文庫，該化合物是寡聚體、-非寡聚體或者其混合物。如果是寡聚的，那么化合物能夠是支鏈的、無支鏈的或者環(huán)狀的。寡聚結構的例子(其可以用組合方法制備)包括寡肽、寡核苷酸、低聚糖、聚脂類、聚酯、酰胺、聚氨基甲酸乙酯、聚脲、聚醚、聚(磷衍生物)(如磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、亞磷酸酯、亞膦酸酰胺等等)以及聚(硫衍生物)(如砜、磺酸酯、亞硫酸酯、氨磺酰、亞磺酰胺等等。
一種普通類型的寡聚組合文庫是肽組合文庫。在肽化學和分子生物學中的最近革新曾使由十個至數(shù)千萬個的不同肽序列組成的文庫能夠得到制備和利用。這樣的文庫可以劃分成三大類。一類文庫包括可溶性的、非支持體結合肽文庫的化學合成物(例如Houghten等，自然，354:84,1991)。第二類文庫包括支持體結合肽文庫(存在于如如塑料針狀體、樹脂小珠或者棉花的固相支持體上)的化學合成物(Geysen等，分子免疫學，23:709,1986；Lam等，自然，354:82,1991；Eichler和Houghten，生物化學，32:11035,1993)。在上述兩類文庫中，構件典型地是L-氨基酸、D-氨基酸、非天然的氨基酸、或者一些其混合物或者組合物。第三類文庫利用分子生物學方法在絲狀噬菌體顆?；蛘哔|粒表面上制備肽或者蛋白質(Scott和Craig,Curr.opinion Biotech.,5:40,1994)。可溶性的、非支持體結合的肽文庫似乎適合于許多應用方面，包括用作為標記。在肽文庫中的化學多樣性的所有可用部分由如過甲基化(Ostresh等，美國科學院院報，91:11138,1994)的步驟擴展。
肽組合文庫的許多變體可能存在，其中肽主鏈被修飾和/或酰胺鍵為模擬基團所取代。可以利用的酰胺模擬基團包括脲、氨基甲酸乙酯以及羰基亞甲基基團。調整上述的主鏈(此時側鏈從每個氨基酸的酰胺氮發(fā)出，而不從α-碳發(fā)出)給出已知是類胨的化合物文庫(Simon等，美國科學院院報，美國，89:9367,1992)。
另一個普通類型的寡聚組合文庫是寡核苷酸組合文庫，其中構件是某些形式的天然存在的或者非天然的核苷酸或者多糖衍生物，包括其中各種有機和無機基團可以取代磷酸鍵以及氮或者硫可以取代醚鍵中的氧的化合物(Schneider等，生物化學，34:9599,1995；Freier等，醫(yī)藥化學雜志，38:344,1995；Frank，生物技術雜志，41:259,1995；Schneider等，出版號PCT WO 942052；Ecker等，核酸研究，21:1853,1993)。
最近，非寡聚的小分子化合物的文庫的組合產(chǎn)物已為有關文獻(DeWitt等，美國科學院院報，90:690,1993；Bunin等，美國科學院院報，91:4708,1994)所描述。適合于加工成小分子文庫的結構包括各種有機分子，例如雜環(huán)族化合物、芳族化合物、脂環(huán)化合物、脂族化合物、甾族化合物、抗菌素、酶抑制劑、配體、激素、藥物、生物堿類、阿片樣物質、萜烯、卟啉、毒素、催化劑以及其混合物。
g．標記組合合成的具體方法用于制備和利用各種系列的包含胺的MS標記的兩種方法概述如下在這兩種方法中，利用組合化學技術，實施固相合成以使大量的標記接頭能夠同時地平行合成。在第一種方法中，寡核苷酸的標記的最后切割導致羧基酰胺的釋放。在第二個種方法中，標記的切割產(chǎn)生羧酸。用于這些方法中的化學組分和連接元件縮寫如下R = 樹脂F(xiàn)MOC = 芴基甲氧羰基保護基AII = 烯丙基保護基CO2H =羧酸基團CONH2=羧化酰胺基團NH2=氨基OH =羥基CONH=酰胺鍵COO =酯鍵MH2-Rink- =4-[(α-氨基)-2，4-二甲氧芐基]-苯氧基CO2H丁酸(Rink linker)OH-1MeO-=(4-羥甲基)苯氧基丁酸CO2HOH-2MeO-=(4-羥甲基-3-甲氧基)苯氧基丁酸CO2HMH2-A-COOH =在側鏈上具有脂肪胺或者芳香胺官能團的氨基酸X1…Xn-COOH =n個具有唯一分子量的羧酸的系列oligol…oligo(n)=n個寡核苷酸的系列HBTU=O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲(tetramethyluronium)六氟磷酸酯在方法1中的步驟的順序如下OH-2MeO-CONH-R↓FMOC-NH-Rink-CO2H；偶聯(lián)(如HBTU)FMOC-NH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓哌啶(除去FMOC)NH2-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓FMOC-NH-A-COOH；偶聯(lián)(如HBTU)FMOC-NH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓哌啶(除去FMOC)NH2-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R
↓ 分成n個等分部分↓↓↓↓↓ 偶聯(lián)到n個不同酸X1…Xn-COOH上X1 … Xn-CONH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓↓↓↓↓ 用1％TFA從樹脂上切割標記的接頭X1 … Xn-CONH-A-CONH-Rink-CO2H↓↓↓↓↓ 偶聯(lián)到n個寡核苷酸上(例如經(jīng)由Pfp酯)X1 … Xn-CONH-A-CONH-Rink-CONH-oligol…oligo(n)↓ 收集標記的寡核苷酸↓ 進行測序反應↓ 從測序反應中分離不同長度的片段(例如經(jīng)由HPLC或CE)↓ 用25％-100％TFA從接頭切割標記X1 … Xn-CONH-A-CONH↓用質譜法分析在方法2中的步驟的順序如下OH-1MeO-CO2-All↓ FMOC-NH-A-CO2H；偶聯(lián)(例如HBTU)FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO2-All↓ 鈀(除去烯丙基)FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO2H↓ OH-2MeO-CONH-R；偶聯(lián)(如HBTU)FMOC-NH-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R↓ 哌啶(除去FMOC)NH2-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R↓分成n個等分部分↓↓↓↓↓↓偶聯(lián)到n個不同的酸上X1…Xn-CONH-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R↓↓↓↓↓ 用1％TFA從樹脂上切割標記的接頭X1…Xn-CONH-A-COO-1MeO-CO2H↓↓↓↓↓↓ 偶聯(lián)到n個寡核苷酸上(如經(jīng)由Pfp酯)X1 …Xn-CONH-A-COO-1MeO-CONH-oligol…oligo(n)↓ 收集標記的寡核苷酸↓ 進行測序反應↓ 從測序反應中分離不同長度的片段(如經(jīng)由HPLC或CE)↓ 用25-100％TFA從接頭上切割標記X1 … Xn-CONH-A-CO2H↓用質譜法分析2．接頭如本文所使用的“接頭”組分(或者L)意指一個直接的共價鍵或者一個有機化學基團，該基團用來通過共價化學鍵把一個“標記”(或者T)與“興趣分子”(或者MOI)相連接。此外，在使得T可以從T-L-X化合物(包括MOI組分)的剩余部分釋放(換句話說，切割)的條件下，直接鍵本身或者接頭組分中的一個或多個鍵是可切割的。存在于T中的標記可變組分在切割條件下應該是穩(wěn)定的。優(yōu)選地，切割可以快速完成；在幾分鐘內，優(yōu)選的在大約15分鐘或更少的時間內。
一般來說，接頭用來把一大系列標記的每一個與同樣大系列的MOI的每一個相連接。典型地，單一標記-接頭結合連接到每一個MOI上(以產(chǎn)生各種T-L-MOI)，但是在某些情況下，多于一個的標記-接頭結合可以連接到每一個體MOI上(以產(chǎn)生各種(T-L)n-MOI)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，兩個或多個標記通過多個在接頭上的獨立位點結合到單一接頭上，然后這一多標記-接頭結合到一個單一MOI上(以產(chǎn)生各種(T)n-L-MOI)。
在標記的MOI的系列的各種操作之后，特異的化學和/或物理條件用來切割一個或多個在接頭中的共價鍵，結果使得標記從MOI中釋放。可切割的鍵可以是或可以不是一些相同的鍵(當標記、接頭以及MOI連接在一起時所形成的鍵)。在很大程度上，接頭的設計將決定完成切割的條件。因此，接頭可以由切割條件(它們對該條件也特別敏感)確定接頭。當接頭是光不穩(wěn)定(即傾向于為在光化輻射下的暴露所切割)時，可以給接頭指定為LhU名稱。同樣地，名稱Lacid、Lbase、L[O］、L[R]、Lenz、Lelc、LΔ和LSS可以分別用來指特別敏感于為酸、堿、化學氧化、化學還原、酶催化活性(簡稱為“酶”)、電化學氧化或者還原、升溫(“熱”)和巰基交換切割的接頭。
特定類型的接頭對單一類型的切割條件是不穩(wěn)定的，而其它類型的接頭對不同類型的切割條件是不穩(wěn)定的。此外，在能夠結合多個標記(以產(chǎn)生(T)n-L-MOI類型結構)的接頭中，每個結合標記的位點可以對不同的切割條件是不穩(wěn)定的。例如，在有兩個標記結合到其上的接頭中，標記之一可以是僅僅對堿不穩(wěn)定，而另一個僅僅對光解不穩(wěn)定。
用于本發(fā)明的接頭具有幾個屬性1)接頭具有化學柄(Lh)，通過該化學柄接頭能夠連接到MOI上。
2)接頭具有另一個單獨的化學柄(Lh)，通過該化學柄標記連接到接頭上。如果多個標記連接到單一接頭((T)n-L-MOI類型結構)上，那么每一個標記存在一個單獨的化學柄。
3)除了允許切割的條件(切割的結果是包含T的部分從化合物的剩余部分(包括MOI)中釋放出來)外，接頭對所有對其進行的操作都是穩(wěn)定的。因此，在標記連接到接頭、接頭連接到MOI以及MOI的任一操作(當接頭和標記(T-L)連接到其上時)期間，接頭是穩(wěn)定的。
4)當T-L連接到MOI上時，接頭不嚴重干擾對MOI所進行的操作。例如，如果T-L連接到寡核苷酸上時，T-L不應該嚴重干擾在寡核苷酸上進行的任一雜交或者酶促反應(例如PCR)。同樣地，如果T-L連接到抗體上，它不應該嚴重干擾抗體的抗原識別。
5)利用不對標記的檢測限產(chǎn)生不利影響的物理或者化學方法，用一種高度控制的方式使從化合物的剩余部分上的標記的切割發(fā)生。
對于任一所給定的接頭，優(yōu)選的是接頭連接到各種MOI上，并且各種標記連接到接頭上。這樣的柔性是有利的，因為它使得T-L綴合物的文庫(一旦制備)可以與幾個不同系列的MOI一起使用。
如上所說明的，優(yōu)選的接頭具有式
Lh-L1-L2-L3-Lh其中每個Lh是能夠用來把接頭與標記反應物和興趣分子的反應物相連接的活性柄。L2是接頭的基本部分，因為L2向接頭傳遞不穩(wěn)性。L1和L3是可有可無的基團，該基團有效地用于分離L2和柄Lh。
L1(按照定義，其更接近于T而非L3)用于把T從所需的不穩(wěn)定部分L2中分離出來。當切割反應產(chǎn)生具體的活性產(chǎn)物(例如游離的基團)(其可以造成包含T的部分的結構方面的隨機變化)時，可以利用這一分離步驟。當切割位點進一步從包含T的部分中分離出來時，形成于切割位點的活性組分破裂成包含T的部分的結構的可能性減少。此外，由于L1中的原子將典型地存在于包含T的部分中，這些L1原子可以向包含T的部分傳遞所需的質量。例如，其中包含T的部分是包含Tms的部分，同時有立體障礙的胺理想地存在作為包含Tms的部分的結構的一部分(作為如MSSE)，有立體障礙的胺可以存在于L1不穩(wěn)定的部分中。
在其它實例中，L1和/或L3可以存在于接頭組分中，這僅僅是因為接頭的供應商選擇以具有如L1和/或L3基團的形式出售接頭。在這樣的例子中，在利用具有L1和/或L3基團的接頭期間沒有任何傷害，(只要這些基團不抑制切割反應)即使它們不能向與它們結合的化合物傳遞任一特異效能優(yōu)點。因此，本發(fā)明允許L1和/或L3基團存在于接頭組分中。
L1和/或L3基團可以是一個直接鍵(在該情況下上述基團不能有效地存在)、亞烴基基團(如亞烷基、亞芳基、亞環(huán)烷基等等)、-O-亞烴基(如-O-CH2-、O-CH2CH(CH3)-等等)或者亞烴基-(O-亞烴基)w-(其中W是1至大約10之間的整數(shù))(如-CH2-O-Ar-、-CH2-(O-CH2CH2)4-等)。
隨著固相合成的出現(xiàn)，發(fā)表了大量的關于對具體的反應條件不穩(wěn)定的接頭的文獻。在典型的固相合成中，固相支持體通過不穩(wěn)定的接頭結合到活性位點上，在活性位點產(chǎn)生合成的分子。當分子全合成時，使固相支持體-接頭-分子構建體處于切割條件(其使分子從固相支持體中釋放出來)下。已發(fā)展用于本文中(或者可以用于本文中)的不穩(wěn)定接頭也易于在本發(fā)明中用作為接頭反應物。
Lloyd-Williams,P.等，“固相肽的匯集合成”，四面體報告號347，49(48):11065-11133(1993)提供了一次關于對光化輻射以及酸、堿和其它切割條件不穩(wěn)定的接頭的廣泛討論。關于不穩(wěn)定接頭的其它信息來源是本領域所熟知的。
如上所描述，不同的接頭設計將傳遞在不同的具體物理或者化學條件之下的可切割性(“不穩(wěn)性”)。用于切割各種設計的接頭的條件的例子包括酸、堿、氧化、還原、氟原子、巰基交換、光解以及酶促條件。
以上列出的可切割接頭(滿足接頭的一般標準)的例子將是本領域技術人員所熟知的，并且包括在由Pierce(Rockford,IL)提供的目錄中發(fā)現(xiàn)的那些例子。例子包括●1,2-亞乙基二醇雙(琥珀酰亞胺基丁二酸鹽)(EGS)，一種為羥胺(1M,37℃，歷時3-6小時)所切割的胺活性的交聯(lián)試劑；●二琥珀酰亞胺基酒石酸鹽(DST)和硫代-DST，其是可由0.015M高碘酸鈉切割的胺活性的交聯(lián)試劑；●雙[2-(氧化琥珀酰亞胺基羰氧基(succinimidyloxycarbonyloxy))乙基]砜(BSOCOES)和硫代-BSOCOES，該胺活性的交聯(lián)試劑可由堿(pH11.6)切割；●1.4-二-[3’-(2’-砒啶基二硫代(丙酰胺基))丁烷(DPDPB)，一種可由巰基交換或者還原所切割的砒啶基二硫代交聯(lián)劑；●N-[4-(對疊氮水楊酰氨基)-丁基]-3’-(2’-砒啶基二硫代)丙酰胺(APDP)，一種可由巰基交換或者還原所切割的二硫代交聯(lián)劑；●雙-[β-4-(對疊氮水楊酰氨基)乙基]-二硫化物，一種可由巰基交換或者還原所切割的光敏交聯(lián)劑；●N-琥珀酰亞胺基-(4-疊氮苯基)-1,3’二硫代丙酸酯(SADP)，一種可由巰基交換或者還原所切割的光敏交聯(lián)劑；●硫代琥珀酰亞胺基-2-(7-疊氮-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3’-二硫代丙酸酯(SAED)，一種可由巰基交換或者還原所切割的光敏交聯(lián)劑；●硫代琥珀酰亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲酰氨基)-乙基-1,3’二硫代丙酸酯(SAND)，一種可由巰基交換或者還原所切割的光敏交聯(lián)劑。
其它可切割的接頭和能夠用來釋放標記的切割條件的例子如下。甲硅烷基連接基團能夠由氟原子或者在酸性條件下切割。3-,4-,5-或者6-取代-2-硝基芐氧基或者2-,3-,5-或者6-取代-4-硝基芐氧基連接基團能夠由光子源(光解)切割。3-,4-,5-或者6-取代-2-烷氧基苯氧基或者2-,3-,5-或者6-取代-4-烷氧基苯氧基連接基團能夠由Ce(NH4)2(NO3)6(氧化)切割。NCO2(尿烷)接頭能夠由氫氧化物(堿)、酸或者LiA1H(還原)切割。3-戊烯基、2-丁烯基或者1-丁烯基連接基團能夠由O3、OsO4/IO4-或者KMnO4(氧化)切割。2-[3-,4-或者5-取代-呋喃基]氧化連接基團能夠由O2、Br2、MeOH或者酸切割。
其它不穩(wěn)定的連接基團的切割條件包括能夠由酸切割的叔烷氧基，能夠由H3O-切割的甲基(二烴基)甲氧基或者4-取代-2-烷基-1,3-二氧戊環(huán)-2-基連接基團，能夠由氟原子或者酸切割的2-甲硅烷基乙氧基連接基團，能夠在堿性條件下切割的2-(X)-乙氧基(X=酮基、酯酰胺、氰基、NO2、硫化物、亞砜、砜)連接基團，能夠由酸或者在還原條件下切割的2-,3-,4-,5-或者6-取代-芐氧基連接基團，能夠由(Ph3P)3RhCl(H)切割的2-丁烯氧基連接基團，能夠由鋰、鎂或者BuLi切割的3-,4-,5-或者6-取代-2-溴代苯氧基連接基團，能夠由Hg2+切割的甲基硫代甲氧基連接基團，能夠由鋅或者鎂切割的2-(X)-乙氧基(其中X=鹵素)連接基團，能夠由氧化切割(例如用Pb(OAc)4)的2-羥基乙氧基連接基團。
優(yōu)選的接頭是那些由酸或者光解切割的接頭。幾個已發(fā)展為固相肽合成的酸不穩(wěn)定接頭可用于把標記與MOI相連接。某些上述接頭描述在一份由Lloyd-Williams等寫的最新的綜述(四面體，49:11065-11133,1993)中。一種有用類型的接頭基于對烷氧基芐醇，其中的兩個-4-氫化甲基苯氧基乙酸和4-(4-氫化甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸是由AdvancedChemTech(Louisville,KY)市售的。這兩種接頭能夠經(jīng)由與芐醇結合的酯鍵連接到標記上，以及經(jīng)由與羧酸結合的酰胺鍵連接到包含胺的MOI上。用不同濃度的三氟乙酸從MOI中釋放由這些分子連接的標記。這些接頭的切割導致了在標記上的羧酸的釋放。通過相關接頭(如2,4-二甲氧基-4’-(羧甲氧基)-二苯甲基胺(由Advanced ChemTech以保護的FMOC形式提供))連接的標記的酸切割導致了在釋放的標記上的羧化酰胺的釋放。
可用于本申請的光不穩(wěn)定接頭也已用于大多數(shù)已發(fā)展為固相肽合成的接頭(參見Lloyd-Williams的綜述)。這些接頭通?；?-二硝基芐酯或者2-硝基苯甲酰胺。最近在文獻中報道的兩個光不穩(wěn)定接頭的例子是4-(4-(1-Fmoc-氨基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸(Holmes和Jones，有機化學雜志，60:2318-2319,1995)和3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯)丙酸(Brown等，分子多樣性，1:4-12,1995)。這兩種接頭能夠經(jīng)由羧酸連接到在MOI中的胺上。標記在接頭上的連接通過在標記上的羧酸和接頭上的胺之間形成酰胺來實現(xiàn)。光不穩(wěn)定接頭的切割通常用350nm波長的UV光線以本領域所知的強度和時間來完成。接頭的切割導致在標記上的一級酰胺的釋放。可光切割的接頭的例子包括硝基苯甘氨酸酯、外和內2-苯并降冰片(benzonorborneyl)氮化物和甲烷磺酸酯以及3-氨基-3(2-硝基苯)丙酸。酶促切割的例子包括切割酯鍵的酯酶、切割磷酸二酯鍵的核酸酶、切割肽鍵的蛋白酶等等。
一個優(yōu)選的接頭組分具有如下所示的鄰硝基芐基結構
其中在a、b、c、d或e位的一個碳原子為-L3-X所取代，并且L1(其優(yōu)選的是一個直接鍵)存在于上述結構中的N(R1)的左側。這樣接頭組分對鍵(在標記“a”的碳和N(R1)之間)的選擇性的光誘導切割是靈敏的。典型地，R1的同一性不是切割反應的關鍵，然而R1優(yōu)選地選自氫和烴基。本發(fā)明提供了在上述結構中，-N(R1)-可以為-O-所取代。還在上述結構中，a、b、c、d或e位的一個或多個基團可以由也可以不由烷基、烷氧基、氟原子、氯原子、羥基、羧基或者酰胺基取代，其中這些取代基在每次取代時是分別選擇的。
具有化學柄Lh的更優(yōu)選的接頭組分具有下列結構
其中b、c、d或e位的一個或多個由氫、烷基、烷氧基、氟原子、氯原子、羥基、羧基或者酰胺基取代，R1是氫或者烴基，R2是-OH或者是保護或激活與另一部分偶聯(lián)的羧酸的基團。碳氟化合物和氫化碳氟化合物基團是優(yōu)選的基團，該基團激活羧酸與另一部分偶聯(lián)。
3．感興趣的分子(MOI)MOI的例子包括核酸或者核酸類似物(例如PNA)、核酸的片段(即核酸片段)、合成的核酸或者片段、寡核苷酸(例如DNA或者RNA)、蛋白質、肽、抗體或者抗體片段、受體、受體配體、配體對的成員、細胞因子、激素、低聚糖、合成的有機分子、藥物以及其混合物。
優(yōu)選的MOI包括核酸片段。優(yōu)選的核酸片段是互補于存在于載體中的序列的引物序列，其中載體用于堿基測序。優(yōu)選地，核酸片段是直接或者在除了片段的3’末端之外的其它部位間接地連接到標記上的；最優(yōu)選的是連接到片段的5’末端上。核酸片段可以購買或者基于遺傳學數(shù)據(jù)庫(例如Dib等，自然，380:152-154，1996和CEPH基因型數(shù)據(jù)庫，http://www.cephb.fr)和商業(yè)賣主(例如Promega,Madison,WI)制備。
如本文所使用的，MOI包括MOI的衍生物(包含可用于把MOI與T-L-Lh化合物結合的官能團)。例如，在5’末端具有磷酸二酯的核酸片段(其中磷酸二酯也結合到亞烷基胺上)是一種MOI。這樣的MOI描述在例如美國專利4,762,779(其并入本文作為參考)中。一種具有內部修飾的核酸片段也是一種MOI。核酸片段的內部修飾范例是其中堿基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶)被修飾從而增加一個活性官能團。這樣的內部修飾的核酸片段是由例如Glen Research,Herndon,VA市售的。另一個核酸片段的內部修飾的范例是其中無堿基的氨基磷酸酯用來合成修飾的磷酸二酯(其插入核酸片段的糖和磷酸基團之間)。無堿基的氨基磷酸酯包含一個活性基團，該基團使得核酸片段(包含氨基磷酸酯衍生的部分)可以與另一部分(例如T-L-Lh化合物)結合。這樣的無堿基的氨基磷酸酯是由例如Clonetech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA市售的。
4．化學柄(Lh)化學柄也是一種作為一級分子的部分存在的穩(wěn)定的活性原子排列，其中該柄能夠進行與互補化學柄(作為二級分子的部分存在)之間的化學反應，以致在兩個分子之間形成共價鍵。例如，化學柄可以是羥基基團，互補化學柄可以是羧酸基團(或者其活化的衍生物，例如氫氟芳基酯(hydrofluroaryl ester))，其中這兩個柄之間的反應形成了將上述兩個分子結合在一起的共價鍵(具體地說，酯基團)。
化學柄可以用于大量的形成共價鍵的反應中，該反應適合于連接標記于接頭上以及連接接頭于MOI上。這樣的反應包括烷基化(例如形成醚、硫醚)、?；?例如形成酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲)、磷酸化(例如形成磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺)、磺?；?例如形成磺酸酯、氨磺酰)、縮合(例如形成亞胺、肟、腙類)、硅烷化、二硫化物形成以及活性中間體(如氮賓或者卡賓)的光解產(chǎn)生。一般來說，適合于連接標記于接頭上的柄和形成鍵的反應也適合于連接接頭于MOI上，反過來也是。在某些情況下，MOI可以預先進行修飾或者衍生化以提供連接接頭所需要的柄。
特別有用于連接接頭于MOI上的一類鍵是二硫鍵。它的形成要求在接頭上存在一個巰基團(“柄”)以及在MOI上存在另一個巰基。然后輕度氧化條件足以將兩個巰基結合在一起而成為二硫化物。二硫化物的形成也可以通過利用過量的適當?shù)亩蚧锝粨Q試劑(例如吡啶基二硫化物)來誘導。因為二硫化物的形成是容易可逆的，所以如果需要，二硫化物也可以用作為釋放標記的可切割鍵。典型地，該過程是在同樣的輕度條件下利用過量的適當?shù)膸€基交換試劑(如二硫蘇糖醇)完成的。
對連接標記(或者具有接頭的標記)與寡核苷酸特別興趣是酰胺鍵的形成。一級脂肪族胺柄能夠易于用如6-單甲氧基三苯甲基己基氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺的亞磷酰胺(由Glenn Research,Sterling,VA市售的引入到合成的寡核苷酸上。當與引入的一級胺比較時，在天然的核苷酸上發(fā)現(xiàn)的胺類(如腺苷和鳥苷)實際上是非反應的。這種在反應性方面的區(qū)別構成了用引入的一級胺(而非核苷酸胺類)選擇地形成酰胺和相關結合基團(例如脲、硫脲、氨磺酰)的能力的基礎。
如分子探針目錄(Eugene,OR)中所列，胺活性的官能團的部分細目包括活化的羧酸酯、異氰酸鹽、異硫氰酸鹽、磺?；u化物以及二氯三氮烯?；钚怎ナ前沸揎椀臉O好試劑，因為所形成的酰胺產(chǎn)物是十分穩(wěn)定的。此外，這些試劑具有與脂肪族胺類的良好反應性以及與寡核苷酸的核苷酸胺類的低反應性?；钚怎サ睦影∟-羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯酯、四氟苯酯以及對硝基苯酯?；钚怎ナ强衫玫?，因為實際上它們能夠由任一包含羧酸的分子制備。制備活性酯的方法由Bodansky(肽化學的原則(第二次編著)，Springer Verlag，倫敦，1993)列出。
5．接頭附著典型地，單一類型的接頭用來把具體系列或者家族的標記與具體系列或者家族的MOI相連接。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，可以遵循一個統(tǒng)一的方法以產(chǎn)生所有各種T-L-MOI結構。當T-L-MOI結構的系列大時，這是特別有利的，因為它使得可以利用組合化學或者其它平行的處理技術來制備系列。按照一種類似的方式，單一類型的利用使得可以使用一個統(tǒng)一的方法來切割所有各種T-L-MOI結構。此外，這對于大系列的T-L-MOI結構是有利的，因為該系列可以以平行的、重復的和/或自動的方式處理。
然而，存在本發(fā)明的其它實施方案，其中兩個或者多個類型的接頭用來把不同的子集標記與相應子集的MOI相連接。既然是這樣，選擇性的切割條件可以用來分別切割每個接頭，而不切割存在于其它MOI的子集上的接頭。
許多形成共價鍵的反應都適合于連接標記于接頭上，以及連接接頭于MOI上。這樣的反應包括烷基化(例如形成醚、硫醚)、酰化(例如形成酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲)、磷酸化(例如形成磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺)、磺?；?例如形成磺酸酯、氨磺酰)、縮合(例如形成亞胺、肟、腙類)、硅烷化、二硫化物形成以及活性中間體(如氮賓或者卡賓)的光解產(chǎn)生。一般來說，適合于連接標記于接頭上的柄和形成鍵的反應也適合于連接接頭于MOI上，反過來也是。在某些情況下，MOI可以預先進行修飾或者衍生化以提供連接接頭所需要的柄。
一類特別有用于連接接頭于MOI上的鍵是二硫鍵。它的形成要求在接頭上存在一個巰基團(“柄”)以及在MOI上存在另一個巰基。然后輕度氧化條件足以將兩個巰基結合在一起成為二硫化物。二硫化物的形成也可以通過利用過量的適當?shù)亩蚧锝粨Q試劑(例如吡啶基二硫化物)來誘導。因為二硫化物的形成是容易可逆的，所以如果需要，二硫化物也可以用作為釋放標記的可切割鍵。典型地，該過程是在同樣的輕度條件下利用過量的適當?shù)膸€基交換試劑(如二硫蘇糖醇)完成的。
對連接標記(或者具有接頭的標記)與寡核苷酸特別有興趣的是酰胺鍵的形成。一級脂肪族胺柄能夠易于用如6-單甲氧基三苯甲基己基氰乙基-N,N-二異丙基亞磷酰胺的亞磷酰胺(由Glenn Research,Sterling,VA市售的)引入到合成的寡核苷酸上。當與引入的一級胺比較時，在天然的核苷酸上發(fā)現(xiàn)的胺類(如腺苷和鳥苷)實際上是非反應性的。這種在反應性方面的區(qū)別構成了用引入的一級胺(而非核苷酸胺類)選擇地形成酰胺和相關結合基團(例如脲、硫脲、氨磺酰)的能力的基礎。
如分子探針目錄(Eugene,OR)中所列，胺活性的官能團的部分細目包括活化的羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、磺?；u化物以及二氯三氮烯。活性酯是胺修飾的極好試劑，因為所形成的酰胺產(chǎn)物是十分穩(wěn)定的。此外，這些試劑具有與脂肪族胺類的良好反應性以及與寡核苷酸的核苷酸胺類的低反應性。活性酯的例子包括N-羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯酯、四氟苯酯以及對硝基苯酯?；钚怎ナ强衫玫?，因為實際上它們能夠由任一包含羧酸的分子制備。制備活性酯的方法由Bodansky(肽化學的原則(第二次編著)，Springer Verlag，倫敦，1993)列出。
存在著許多商業(yè)的交聯(lián)試劑，其可以用作為接頭(例如參見PierceCross-linkers,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)。在這些交聯(lián)試劑中有同基雙功能胺活性的交聯(lián)試劑(其以同基雙功能亞氨酸酯和N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)酯為例說明)。其中也有異基雙功能交聯(lián)試劑，該試劑具有兩個或者多個不同的活性基團(其使得測序反應可以進行)。亞氨酸酯在堿性pH下快速地與胺類進行反應。當與一級或者二級胺類進行反應時，NHS-酯給出穩(wěn)定的產(chǎn)物。馬來酰亞胺、烷基和芳基鹵化物、α-鹵代?；约斑拎せ蚧锸菐€基活性的。具體地說，馬來酰亞胺是在6.5至7.5的pH范圍中用于巰基(硫氫基)基團的，在該堿性pH下馬來酰亞胺可以變成胺活性的。硫醚鍵在生理條件下是穩(wěn)定的。α-鹵代乙?；宦?lián)試劑包含碘代乙?；鶊F，并且是對硫氫基活性的。咪唑能夠與碘代乙酰基部分進行反應，但是反應十分緩慢。吡啶基二硫化物與巰基團進行反應從而形成二硫鍵。碳二亞胺偶聯(lián)羧基到酰肼的一級胺上，該酰肼導致?；?酰肼鍵的形成。芳基疊氮化物是光親和試劑，該試劑在化學方面是惰性的直到暴露于UV或者可見光中。當這樣的化合物在250-460nm光解時，形成了一種活性芳基氮賓?；钚苑蓟e是比較非特異的。乙二醛對精氨酸的胍基部分是活性的。
在本發(fā)明的一個典型實施方案中，首先使標記結合到接頭上，然后將標記和接頭的結合物結合到MOI上，從而產(chǎn)生T-L-MOI結構。另外，通過首先結合接頭到MOI上然后結合接頭和MOI的結合物到標記上可形成同樣的結構。一個例子是其中MOI是DNA引物或者寡核苷酸。在該情況下，標記典型地首先結合到接頭上然后T-L結合到DNA引物或者寡核苷酸上，然后將其用于例如測序反應中。
一種有用的形式(其中標記可以反過來連接到MOI(例如寡核苷酸或者DNA測序引物)上)是通過一個化學上不穩(wěn)定的接頭。一種優(yōu)選的接頭的設計使得當暴露于易揮發(fā)的有機酸(例如三氟乙酸(TFA))時接頭可以被切割。尤其是，TFA與大多數(shù)的MS離子化方法(包括電噴射)兼容的。
用于突變分析的本發(fā)明組合物。用于突變分析的組合物包含一對下式的化合物Tms-L-MOI其中Tms是可由質譜法檢測的有機基團，該基團包含碳、至少一個氫和氟原子以及可有可無的選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。在上式中，L是使得包含Tms的部分可以白化合物的剩余部分切割下來的有機基團，其中包含Tms的部分包含官能團，該官能團支持單一的離子化電荷狀態(tài)(當對化合物進行質譜分析時)并且選自叔胺、季銨以及有機酸。在上式中，MOI是核酸片段，其中L在除MOI的3’末端之外的其它部位綴合到MOI上。組合物包含數(shù)對化合物，其中每對的成員具有不相同的Tms基團，并且除了在一個堿基位置的堿基不相同外，具有相同的序列。在本發(fā)明組合物的另一個實施方案中，數(shù)對化合物的成員具有不相同的Tms基團，并且除了在一個堿基位置的堿基不相同外，具有相同的序列。然后將這些組合物加入至載體結合的核酸序列(其與每對的成員之一的序列是同一的)上。因此，本發(fā)明提供了組合物，該組合物包含如上所描述的許多化合物對，以及還包含同樣數(shù)量的核酸(其固定在固相支持體上)，其中這些數(shù)量的核酸的每一個都具有確切地互補于每對的一個成員的堿基序列。
本發(fā)明也提供了用于突變分析的試劑盒，該試劑盒包含多個容器。每一容器包含一對下式的化合物Tms-L-MOI其中Tms是可由質譜法檢測的有機基團，該基團包含碳、至少一個氫和氟原子以及可有可無的選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。在上式中，L是使得包含Tms的部分可以自化合物的剩余部分切割下來的有機基團，其中包含Tms的部分包含官能團，該官能團支持單一的離子化電荷狀態(tài)(當對化合物進行質譜分析時)并且選自叔胺、季銨以及有機酸。在上式中，MOI是核酸片段，其中L在除MOI的3’末端之外的其它部位綴合到MOI上。在試劑盒中，每對化合物具有不相同的Tms基團，并且除在一個或兩個堿基位置的堿基不相同外，具有相同的序列。在優(yōu)選的試劑盒中，該數(shù)量至少是3，更優(yōu)選的是至少5。B．分析如上所述，本發(fā)明能夠利用各種測定法(其中本文提供了標記和檢測方法)大大地提高分析的靈敏度與處理量。一方面，這樣的方法能夠用于檢測配體對的第一成員與第二成員之間的結合，包含步驟(a)在足以使第一成員結合到第二成員上的條件和時間下，把一系列第一標記的成員與生物樣品(其可能包含一個或多個第二成員)組合在一起，其中所說的標記是與特定的第一成員相關的和且可由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測的，(b)將未結合的成員與結合的第一和第二成員分離，(c)從所標記的第一成員切割標記，以及(d)由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測標記，并由此檢測第一個成員和第二成員的結合。
各種第一和第二成員對都可以用于本發(fā)明的方法中，包括例如核酸分子(例如DNA、RNA、如PNA的核酸類似物或者這些物質的任一混合物)、蛋白質或者多肽(例如抗體或者抗體片段(例如單克隆抗體、多克隆抗體或者如CDR的結合配偶體))、低聚糖、激素、有機分子和其它底物(例如諸如葡糖醛酸酶-藥物分子之類的生物異源物質)或者任一其它配體。在本發(fā)明的各種實施方案中，第一和第二成員可以是同類型或者不同類型的分子。例如，代表性第一成員第二成員配體對包括核酸分子/核酸分子、抗體/核酸分子、抗體/激素、抗體/生物異源物質以及抗體/蛋白質。
為了進一步地理解本文所描述的能夠完成的測定法，下面提供某些特別優(yōu)選的測定法的簡要討論。
1．核酸分析a．概論如上所述，本發(fā)明也提供了各種方法，其中上述的可切割的標記和/或接頭可以用于代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標記(例如放射性的、熒光的或者酶促的)，從而提高了一種給定的方法中可以同時被分析的樣品的特異性、靈敏度或者數(shù)量。這樣的方法的代表性例子(可以被提高的)包括例如標準核酸雜交反應(參見Sambrook等，supra)、如循環(huán)探針技術(CPT)(參見美國專利4,876,187和5,011,769)的診斷反應或者寡核苷酸連接分析(OLA)(Burket等，科學，196:180,1987)。下面將更詳細地討論這些技術和其它技術。
b．雜交技術通過使檢測在不相關的DNA或者RNA分子的大庫中的基因或者它的mRNA成為可能，使得基因的成功的克隆和測序使它的結構和表達的研究可以進行。在組織中編碼具體的蛋白質的mRNA的量是基因活性的一個重要參數(shù)，并且可以與功能系統(tǒng)的活性十分相關。mRNA的調節(jié)依賴于基因中的序列(順式作用元件)與序列特異性DNA結合蛋白質(反式作用因子)之間的相互作用，該元件和因子由組織特異性或者由激素和第二個信使系統(tǒng)活化。幾種技術可以用于分析特定基因、它的調節(jié)序列、它的特定mRNA和它的表達的調節(jié)；這些技術包括Southern或者Northern印跡分析、核糖核酸酶(RNase)保護分析和原位雜交。
在一個特定基因的核苷酸組合物中的變異可以具有極大的病理生理學關聯(lián)性。當定位在非編碼區(qū)(5’,3’-側翼區(qū)和內含子)時，它們能夠影響基因表達的調節(jié)，從而造成反常的活化或者抑制作用。當定位在基因的編碼區(qū)(外顯子)時，它們可以導致蛋白質功能或者機能不良的蛋白質的改變。
因此，基因中的一種特定序列能夠與具體的疾病相關，同時能夠用作為疾病的標記。因此，在醫(yī)學領域中，研究的一個基本目是檢測那些作為診斷工具的遺傳變異，并獲得關于病理生理學現(xiàn)象的理解的重要信息。
關于一個特定基因中的變異的群體分析的基本方法是利用Southern印跡技術的DNA分析。簡言之，制備的基因組DNA用限制酶消化(RE)，結果產(chǎn)生大量不同長度的DNA片段(通過基因組上的RE的特異性識別部位的存在來測定)。具有該限制位點內部的突變的一個特定基因的等位基因將切割成不同數(shù)量和長度的片段。該等位基因稱為限制片長多態(tài)性(RFLP)，并且能夠是許多應用的一個重要診斷標記。
將要分析的片段必須從DNA片段的庫中分離，并且必須利用特異性探針來與其它DNA產(chǎn)物相區(qū)別。因此，利用瓊脂糖凝膠使DNA進行電泳分級分離，其后轉移和固定該DNA于尼龍或者硝酸纖維素膜上。使該固定的單鏈DNA與標記的DNA(互補于將要檢測的DNA)雜交。在除去非特異的雜交之后，興趣DNA片段能夠由MALDI-MS(下面將更詳細地描述)目測檢驗。特定基因轉錄物和其由生理參數(shù)調節(jié)的存在和存在量能夠依靠Northern印跡分析和核糖核酸酶保護測定來分析。
這些方法的原理基礎是整個細胞RNA的庫與特異性探針的雜交。在Northern印跡技術中，利用瓊脂糖凝膠電泳分餾組織的整個RNA，并將其轉移和固定于標記的反義RNA(cRNA)(互補于將要檢測的RNA)上。然后標記該cRNA探針(如這里所描述)。通過運用嚴格的洗滌條件，除去非特異結合的分子。其后能夠由MALDI-MS檢測特異結合的分子。此外，通過比較所檢測的mRNA的大小與興趣mRNA的所預知的長度，能夠控制特異性。
更快速但并不特異的是斑點印跡法，除RNA直接點于膜上而沒有預先的分級分離外，該方法的操作如同Northern印跡技術。RNA非特異地固定于斑點印跡中。
mRNA產(chǎn)物的檢測的最特異的方法是核糖核酸酶保護分析(RNase保護分析)。簡言之，使組織或者細胞培養(yǎng)物的整個RNA與標記的特異性cRNA(完全同源性的)雜交。特異性由爾后的RNase消化實現(xiàn)。未雜交的單鏈RNA以及非特異地與甚至小的錯配序列雜交的片段都將被識別和切割下來，而完全同源性的雙鏈RNA不受酶的影響并將得到保護。在由蛋白酶K消化和苯酚提取除去RNase之后，通常在變性的聚丙烯酰胺凝膠上，能夠從降解產(chǎn)物中分離出特異的保護片段，并且所預知的大小能夠由HPLC檢測。以上所描述的所有分析都能夠由非熒光光譜測定法或者電位滴定法定量。
給定的mRNA在特定群體的組織細胞中的精確定位能夠由原位雜交測定。這一方法類似于免疫細胞化學技術，并且事實上能夠與免疫細胞化學同時用于相同的區(qū)段以發(fā)現(xiàn)蛋白質是否確實局部地合成或實際上取自其它來源。除鑒定表達特異性mRNA的細胞類型的可能性之外，原位雜交甚至能夠比利用上述技術的整個組織RNA制備物的分析更靈敏。這是一種情況，其時在組織的極不連續(xù)區(qū)域或者細胞類型中以高濃度表達mRNA并由整個組織的勻漿稀釋mRNA。因此基因表達的原位雜交分析對于如人腦的異質組織具有特別的重要性。對于原位雜交，必須按照組織化學方案凍結或者灌流固定和切片組織。用于組織切片和標記的探針的雜交方案類似于以上所描述的其它雜交方法。半定量分析是可能的。
c.作為mRNA的代表性群體和用作為探針的cDNA大多數(shù)mRNA從單一復制序列轉錄。cDNA的另一個性質是它們表示基因組的更長區(qū)域，因為內含子存在于大多數(shù)基因的染色體形式中。表現(xiàn)度從一個基因變化到另一個基因，但是可以是非常明顯的，因為許多基因在基因組(以單一cDNA表示)中覆蓋100kb以上。分子雜交的一種可能用途是利用一種物種的探針來檢測從另一種物種制得的克隆。在小鼠和人的mRNA之間的序列趨異使得可以進行長序列的交叉重締合(但是不包括最高度保守的區(qū)域)，并且避免了PCR引物的交叉雜交。
由于基于PCR和基于cRNA的擴增技術的發(fā)展，現(xiàn)在在復合生物樣品中進行示差篩選(如利用由單細胞制備的cDNA探針來發(fā)展神經(jīng)系統(tǒng))是可能的。以前幾個組報道過從少量的聚腺苷酸化RNA(1ng或者更少)(由10-50個細胞制備)產(chǎn)生cDNA文庫的方法(Belyav等，核酸研究，17:2919,1989)。雖然文庫充分代表了mRNA復雜度，但是這些文庫的平均cDNA插入大小是十分小的(＜2kb)。
最近綜合了某些方法從而從單細胞產(chǎn)生了基于PCR(Lambolez等，神經(jīng)元，9:247,1992)和基于cRNA(Van Gelder等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國，87:1663,1990)的兩種探針。在電記錄之后，單細胞的胞質內含物用原位cDNA合成和擴增的膜片鉗微電極抽吸。PCR用來擴增選自單Purkinje細胞的谷氨酸受體mRNA的cDNA和選自在器官型小腦培養(yǎng)物中的單膠質的GFAP mRNA的cDNA(Lambolez等，神經(jīng)元，9:247,1992)。在cRNA擴增的情況下，轉錄啟動子序列設計成cDNA合成引物，并且復合反義cRNA由噬菌體RNA聚合酶通過體外轉錄產(chǎn)生。
因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，標記的cRNA能夠用作為標記的探針來隨機地篩選cDNA文庫或者用于“表達輪廓”實驗中來篩選包含興趣cDNA片段(受體、生長因子、離子通道等等)的Southern印跡?；赑CR的方法常常遇到的線性擴增的缺乏似乎最大限度地為基于cRNA的方法所減少。
d．寡核苷酸連接分析寡核苷酸連接分析是基于PCR的篩選的延伸，該方法利用基于ELISA的分析(OLA,Nickerson等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美國，87:8923，1990)來檢測包含靶序列的PCR產(chǎn)物。因此，凝膠電泳和集落雜交都不需要。簡言之，OLA使用兩個鄰近的寡核苷酸“報道基因”探針(標記在5’末端)和5’-磷酸化/3’-生物素?；摹板^”探針。使互補于內化到PCR引物的序列的這兩個寡核苷酸退火到靶DNA上；同時，如果具有完全的互補性，那么這兩個探針為T4DNA連接酶所連接。在固定的鏈霉抗生物素蛋白上的生物素?；腻^探針的俘獲和對以共價鍵結合的報道基因探針的分析，二者檢測在PCR產(chǎn)物中靶序列是否存在或者缺乏。
e．雜交技術的運用?。ㄡt(yī)學在DNA序列變異水平上的個體鑒定提供許多優(yōu)越于常規(guī)標準(如指紋、血型或者身體特征)的實用的優(yōu)點。與大多數(shù)表型標記相比，DNA分析使之易于進行個體之間的相關關系的推論(這在親權認定中是必需的)。已經(jīng)證明基因分析在骨髓移植中是十分有用的，其中區(qū)別緊密相關的供體和受體細胞是必要的?，F(xiàn)在有兩種類型的探針用于DNA印跡的DNA指紋分析。多形的最小衛(wèi)星DNA探針鑒定多個DNA序列，每個序列在不同的個體中以可變的形式存在，這樣個體之間就產(chǎn)生了復雜的和可變性大的種種模式。VNTR探針鑒定基因組中的單序列，但是這些序列在人群中可以以多達30種的不同形式(以所鑒定的片段的大小來區(qū)別)存在。對于多個VNTR或者最小衛(wèi)星探針，不相關個體具有同一的雜交模式的概率是非常低的。比DNA印跡所需的組織少得多的組織，甚至一根頭發(fā)就可為遺傳標記的基于PCR的分析提供足夠的DNA。此外，部分降解的組織可以用于分析，因為僅僅需要小段的DNA片段。法醫(yī)學DNA分析最終將用多形的DNA序列進行，這些序列可以由簡單的可自動化的分析(如OLA)進行研究。例如，22種單獨的基因序列(其中每個基因序列以兩種不同的形式存在于人群中)的分析可以產(chǎn)生1010個不同的結果，該結果使個人得到唯一的鑒定。
ⅱ．腫瘤診斷學病毒癌基因或者細胞癌基因的檢測是核酸診斷學的另一個重要的應用范圍。當其細胞配對物(c-癌基因)已經(jīng)存在于正常細胞中時，病毒癌基因由逆轉錄病毒傳遞。然而，細胞癌基因可以為如s點突變(如在膀胱癌和結腸癌中的c-K-ras癌基因中)、啟動子誘導、基因擴增(如在成神經(jīng)細胞瘤的情況下在N-myc癌基因中)或者染色體重排(如在慢性骨髓白血病的情況下在c-abl癌基因從染色體9至染色體22的轉運中)的特異性修飾所活化。每種活化處理(結合附加的變性處理)都導致加速的和不可控制的細胞生長。必須滅活而使其不能形成腫瘤(如在成視網(wǎng)膜細胞瘤Rb基因和骨肉瘤中)的所謂的“隱性癌基因”也能夠借助于DNA探針檢測。利用抗免疫球蛋白基因和抗T-細胞受體基因，B-細胞淋巴瘤和成淋巴細胞的白血病的檢測是可能的。
ⅲ．移植分析所移植的組織的排斥反應是由特定種類的組織相容性抗原(HLA)決定性地控制的。它們表達在存在于血液細胞(例如巨噬細胞)中的抗原表面上。HLA和外源抗原之間的復合體通過在細胞表面上的相應的T-細胞受體由T-輔助細胞識別。HLA、抗原和T-細胞受體之間的相互作用觸發(fā)一個復雜的防衛(wèi)反應，該反應在身體上導致一個級聯(lián)狀的免疫應答。
不同的外源抗原的識別以T-細胞受體的可變的抗原特異性區(qū)域為介導-類似于抗體反應。因此在移植排斥中，表達特異性T-細胞受體(適合于外源抗原)的T-細胞能夠從T-細胞庫中除去。通過抗原特異性可變DNA序列(其由PCR擴增并因而選擇性地增加)的鑒定，進行這樣的分析是可能的。特異性擴增反應使得可以進行特異性T-細胞受體的單細胞特異性鑒定。
目前可以用類似分析進行如少年糖尿病、動脈硬化、綜合硬化癥、風濕性關節(jié)炎或者腦脊髓炎的自身免疫病的鑒定。
ⅳ．基因組診斷學所有嬰兒的百分之四是伴隨遺傳缺損出生的；在已描述的3,500種遺傳病中，只要僅僅一個單基因的修飾就可造成其中的一種，原發(fā)性分子缺陷僅僅已知它們中的大約400種。
長久以來，遺傳病都是由表型分析(既往病史，例如血液的缺損地中海貧血)、染色體分析(核型，例如蒙古癥三體性21)或者基因產(chǎn)物分析(修飾的蛋白質，例如苯丙酮尿癥導致苯基丙酮酸的水平的提高的苯丙氨酸羥化酶的缺損)診斷的。核酸檢測方法的附加利用極大地增加了基因組診斷學的范圍。
在特定的遺傳病的情況下，僅僅兩等位基因之一的修飾就足以引發(fā)疾病(顯性傳遞的單基因缺陷)；在許多情況之下，必須修飾兩等位基因才可引發(fā)疾病(隱性傳遞的單基因缺陷)。在第三類型遺傳缺損中，疾病的爆發(fā)不僅由基因修飾決定而且由如飲食習慣(在糖尿病或者動脈硬化的情況下)或者生活方式(在癌的情況下)的因素決定。這些疾病十分經(jīng)常地發(fā)生于進步的時代之中。如精神分裂癥、躁狂抑郁癥或者癲癇癥的疾病也應該在本文中論及；正在研究是否在這些情況下的疾病爆發(fā)依賴于環(huán)境因素以及在不同的染色體位置中的幾個基因的修飾。
利用直接和間接DNA分析，一系列遺傳病的診斷將變得可能鐮狀紅細胞貧血、地中海貧血、α1-抗胰蛋白酶缺損、自毀容貌綜合征、囊性纖維化/粘稠性物阻塞癥、Duchenne/Becker型肌營養(yǎng)不良、老年性癡呆、X-染色體-依賴的智力缺陷、慢性舞蹈病。
ⅴ．傳染病重組DNA方法在傳染病的診斷方面的運用已經(jīng)是病毒感染(其中當前方法受阻并且結果被遲延)最廣泛探討的方面。組織或者培養(yǎng)細胞的原位雜交曾使急性和慢性皰疹感染的診斷成為可能。已經(jīng)報道了新鮮和fomalin固定的組織適合于在入侵的頸部癌中的乳頭瘤病毒的檢測和HIV的檢測，而培養(yǎng)細胞已用于巨細胞病毒和Epstein-Barr病毒的檢測。如果能夠滿足成本效果、速度以及精密度方面的要求，那么重組DNA方法在微生物疾病的診斷方面的運用就有取代當前的微生物生長方法的可能性。其中重組DNA方法已開始應用的臨床情形包括青霉素抗性的Neisseria Sonorrhoeae(通過轉座子、一絲不茍地日益增長的衣原體、微生物在食品中的存在)的鑒定以及對群體的感染傳播的簡單意義的跟蹤。重組體方法正在迎接包括如利什曼原蟲屬和瘧原蟲的寄生物的疾病的世界性流行病的挑戰(zhàn)。
2．基于蛋白質的分析a．概論如上所述，同樣地可以由這里所描述的標記增加各種基于蛋白質的分析(參見例如抗體實驗室手冊，Harlow和Lane(合編)，冷泉港實驗室出版社，1988)。代表性例子包括抗原-抗體分析(例如對流免疫電泳(CIEP)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、抑制或者競爭分析以及夾心分析)、同時免疫和免疫過濾分析。然而可以同樣地增加各種其它分析，包括例如配體-受體分析等等。
b．免疫分析由于用于胰島素和甲狀腺素的放射性免疫分析(RIA)的發(fā)展，包括以放射性同位素標記抗原的方法已廣泛地運用于半抗原分子(如激素和藥物)的測量。該方法基于標記的抗原和未標記的抗原之間對有限量的抗體的競爭。這些方法也可以描述為“有限試劑”方法，因為用于分析的有限量抗體。
雖然自1941年以來標記的抗體已用于免疫熒光方法，但是它們并沒有更廣泛地運用于定量方法中直到放射性同位素標記的抗體引入IRMA(免疫放射分析)中。IRMA和其它基于固體的雙抗體或者“夾心”分析(ELISA、IFMA、免疫熒光染色分析)都是以過量的抗體(相比于抗原)為特征；因此它們可以稱為“過量試劑”方法。理論上，利用過量試劑縮短了培養(yǎng)時間，并且潛在地增加了靈敏度。固相有利于分離，并且信號直接與抗原的量成正比，這與在競爭性分析中的反比關系相反。
在生物化學、分子生物學和醫(yī)學的許多領域中，親和素-生物素技術(包括通過利用非放射性免疫分析的蛋白質檢測、細胞化學染色、細胞分離和核酸分離以及通過雜交的特異性DNA/ARNA序列的檢測)的利用已經(jīng)變得日益重要。該技術通過親和素-生物素相互作用(締合常數(shù)1015M-1)的極高親和性和生物素?；鞣N靶生物分子(如抗體、核酸以及脂類)的能力使它得到應用。靶分子分離的第一步是它的生物素?；蛘咦罱K結合到靶分子(如抗體或者形成靶復合體的雜交探針)上的生物分子的生物素酰化。然后通過利用基于親和素-生物素相互作用的親和性中間體，在異質的混合物中將生物素?；姆肿踊蛘甙袕秃象w與其它分子分離。
因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，都可以利用標記的試劑(而不是典型的以同位素標記的試劑)完成任一標準免疫分析。這樣的方法產(chǎn)生了極大地增加的靈敏度以及同時分析許多樣品的能力。
3．基因表達分析在這里說明的本發(fā)明之一是一種高處理量的方法，該方法用于在單一測量中測量許多基因(1-2000)的表達。該方法也具有每次處理一百多個樣品的平行處理能力。該方法可運用于藥物篩選、發(fā)育生物學、分子醫(yī)學研究等等。因此，在本發(fā)明的一個方面中，提供該方法來用于分析選擇的生物樣品的基因表達模式，該方法包括步驟(a)從生物樣品中暴露核酸，(b)在足以使所說的探針雜交到上述核酸上的條件和時間下，把所說的暴露的核酸與一個或多個選擇的標記的核酸(其中所說的標記與特定的核酸探針相關且可由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測)的探針組合在一起，(c)把雜交的探針與未雜交的探針分離，(d)從加標記的片段上切割標記，以及(e)由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測標記并由此測定生物樣品的基因表達模式。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了如下描述的分析或方法將靶來源的RNA通過特異性雜交步驟(即由限制的寡脫氧胸苷酸俘獲探針進行的聚腺苷酸mRNA的俘獲)結合到固相支持體上。然后洗滌固相支持體，同時利用標準方法(即逆轉錄酶)在固相支持體上合成cDNA。然后經(jīng)由水解除去RNA帶。結果產(chǎn)生DNA群體，該群體以共價鍵固定化在固相支持體上，該載體反映了RNA(cDNA由其合成)的多樣性、豐度以及復雜度。然后用一至數(shù)千個探針(其互補于興趣基因序列)探測(雜交)載體。用可切割的質譜標記或者其它類型的可切割的標記標記每個探針類型。在探測步驟之后，洗去過量的或者未雜交的探針，固相支持體放置(例如)在微量滴定板的孔中，同時將質譜標記從載體上切割下來。從樣品容器的孔中除去固相支持體，同時用質譜儀測量孔的內含物。特定質譜標記的出現(xiàn)表明在樣品中存在RNA，并且證明在所給定的生物樣品中特定基因得到表達。該方法也可以是定量的。
基因表達的快速測量(利用可切割的標記)的組合物和方法能夠詳盡地描述如下。簡言之，組織(肝、肌肉等等)、原始的或者轉化的細胞系、分離的或者純化的細胞類型或者生物材料的任一其它來源(可在生物材料中用于決定基因表達)都可以用作為RNA的來源。在優(yōu)選的方法中，在離液劑存在時將生物來源材料溶解以抑制核酸酶和蛋白酶并支持靶酸核與載體的嚴格雜交。組織、細胞以及生物來源能夠有效地溶解于1至6摩爾離液鹽(鹽酸胍、硫氰酸胍、高氯酸鈉等等)中。在生物樣品來源溶解之后，將溶液與固相支持體混合以便實現(xiàn)存在于裂解物中的靶核酸的俘獲。在該方法的一個變化中，利用限制的寡脫氧胸苷酸俘獲探針俘獲RNA。固相支持體能夠包括尼龍小珠、聚苯乙烯微型珠、玻璃珠和玻璃表面或者任一其它類型的固相支持體(寡核苷酸能夠以共價鍵連接到其上)。固相支持體優(yōu)先地外覆一層胺聚合物(如聚乙烯(亞胺)、丙烯酰胺、胺-dendrimers等等)。在聚合物上的胺用于以共價鍵固定化寡核苷酸。用5’-胺優(yōu)先地合成寡核苷酸(一般地其是包括六個碳間隔臂和一個遠側胺的己胺)。寡核苷酸可以是15至50個核苷酸長度。寡核苷酸由如氰尿酰氯的同基雙功能或者異基雙功能交聯(lián)試劑活化。通過排阻色譜法從過量的交聯(lián)試劑(即氰尿酰氯)中純化活化的寡核苷酸。然后將活化的寡核苷酸與固相支持體混合以便實現(xiàn)共價連接。在寡核苷酸的共價連接之后，將固相支持體的未反應胺類加帽(即用琥珀酸酐)以除去固相支持體的正電荷。
能夠平行地利用固相支持體，并且最好以96-孔或者384-孔格式設置。在96-孔或者384-孔設置中固相支持體能夠連接到釘、莖干或者棒上，固相支持體是可脫附的或者是特定設置的整體。固相支持體的特定設置并不對分析的功能起關鍵作用，而是影響適應于自動化分析的能力。
將固相支持體與裂解物混合15分鐘至數(shù)個小時以便在固相支持體上實現(xiàn)靶核酸的俘獲。一般來說，靶核酸的“俘獲”是通過靶RNA的互補堿基配對和固定在固相支持體上的俘獲探針來實現(xiàn)的。一種變換利用在大多數(shù)真核生物信使RNA上發(fā)現(xiàn)的3’聚腺苷酸序列來在固相支持體上雜交限制的寡脫氧胸苷酸。另一種變換將利用一種特異性寡核苷酸或者長探針(大于50個堿基)來俘獲包含確定序列的RNA。另一個可能性將使用簡并引物(寡核苷酸)，該簡并引物將影響靶RNA群體中的許多相關序列的俘獲。由RNA群體的序列復雜度指導雜交時間和所使用的俘獲探針的類型。由所使用的離液劑的類型和離液劑的終濃度來確定雜交溫度(參見Van Ness和Chen，核酸研究，用于一般性指導)。優(yōu)先地用固相支持體連續(xù)不斷地振蕩裂解物以便實現(xiàn)靶RNA的擴散。一旦俘獲靶核酸的步驟完成，就從固相支持體中洗滌出裂解物，同時除去所有離液劑或者雜交溶液。優(yōu)先地用包含離子或者非離子去污劑的溶液、緩沖液和鹽洗滌固相支持體。下一步是DNA(互補于俘獲的RNA)的合成。在這一步驟中，限制的俘獲寡核苷酸用作為逆轉錄酶的延伸引物。反應一般在25至37℃下進行，優(yōu)選地在聚合反應期間進行振蕩。在cDNA合成之后，cDNA以共價鍵連接到固相支持體上，因為俘獲寡核苷酸用作為延伸引物。然后自cDNA/RNA雙螺旋水解RNA。通過利用使雙螺旋變性的熱或者利用以化學方法水解RNA的堿基(即0.1N NaOH)可以完成該步驟。這一步驟的關鍵結果在于使cDNA可用于爾后的與確定探針的雜交。然后進一步洗滌固相支持體或者固相支持體系列以便除去RNA或者RNA片段。此時固相支持體包含cDNA分子的一個近似的代表性群體，該cDNA分子群體按照序列豐度、復雜度以及多樣性表示RNA群體。
下一步將使選擇的探針與固相支持體雜交以鑒定特定cDNA序列的存在或者缺乏和相對豐度。探針優(yōu)先是15至50個核苷酸長度的寡核苷酸。由分析的終端用戶規(guī)定探針的序列。例如，如果終端用戶是用來研究在組織中的炎癥反應的基因表達，那么將選擇互補于許多細胞因子mRNA、RNA(編碼調節(jié)脂類的酶)、RNA(編碼調節(jié)細胞(涉及炎癥反應)的因子)等等的探針。一旦確定了用于研究的一系列確定序列，則每一種序列變成一個寡核苷酸探針，同時每一探針分配一個具體的可切割標記。然后將標記連接到各自的寡核苷酸上。然后在適當?shù)碾s交條件下在固相支持體上將寡核苷酸雜交到cDNA上。在雜交步驟完成之后，洗滌固相支持體以便除去任一未雜交的探針。然后將固相支持體或者固相支持體組放置在影響質譜標記的切割的溶液中。然后用質譜儀對質譜標記進行測量，則每個標記存在的量得到鑒定，同時所表達的mRNA的存在(和豐度)或者缺乏也得到測定。
4．微生物、特定基因表達或者核酸中的特定序列的檢測具有可切割標記的DNA探針的用途能夠用于任一類型樣品或者試樣中檢測微生物的存在或者缺乏。典型地，利用離子去污劑或者choatropes對樣品進行溶胞步驟，然后將核酸特異地或者非特異地固定化在固相支持體上，同時用標記的DNA探針探測該核酸。除去未雜交的探針是一個洗滌步驟，從它們各自的探針上切割標記，并測量所得標記。
可檢測的核酸可以包括mRNA、基因組DNA、質粒DNA或RNA、rRNA病毒的DNA或者RNA。為了實現(xiàn)靶核酸的檢測，靶需要某些類型的固定化，因為這里所描述的分析都不是均相的。兩種類型(非特異的或者特異的)的固定化是可能的。在以前的情況中，核酸是固定化在固相支持體或者底物(具有一些核酸親和性)上的?？梢韵扔诜翘禺惞潭ú襟E純化或者不純化核酸。固相支持體可以包括尼龍膜、由硝酸纖維素組成的膜等等。然后用預定序列的標記寡核苷酸探測固相支持體以便鑒定興趣靶核酸。除去未雜交的探針是一個洗滌步驟，將標記從他們各自的探針上切割下來，同時測量該標記。
另一個方法利用了Southern印跡技術，該方法產(chǎn)生了更高的群體分析(關于一定的基因或者DNA序列的存在)特異性。以限制酶(RE)消化制得的DNA，結果產(chǎn)生了大量不同長度的DNA片段(通過在基因組上的限制酶的特異性識別部位的存在測定)。具有在這一限制位點內部的突變的特定基因的等位基因將被切割成不同的數(shù)量和長度的片段。如果能夠具體地鑒定這些片段，那么所產(chǎn)生的限制片長多態(tài)性(RFLP)就能夠成為微生物的重要診斷。
所要分析的片段應該從DNA片段的庫中分離出來，并且利用特異性探針區(qū)別于其它DNA產(chǎn)物。因此，利用某些類型的凝膠或者色譜對DNA進行電泳分級分離，其后將DNA轉移和固定于尼龍或者硝酸纖維素膜上。使固定的單鏈DNA與標記的寡核苷酸(互補于所要檢測的DNA)雜交。在除去非特異性雜交之后，通過從雜交的探針上切割標記來鑒定興趣DNA片段。用這里所描述的技術，能夠同時使用超過一百個的探針。
能夠借助于Northern印跡分析和RNase保護分析分析特異性基因轉錄物的存在和存在量。這些方法的原理基礎是整個細胞RNA的庫與一個特異性標記的探針或者特異性標記的探針系列的雜交。在Northem印跡技術中，利用瓊脂糖凝膠(轉移至和固定于固相支持體(尼龍、硝酸纖維素等等)上)電泳分離組織的總RNA。使RNA與標記的寡核苷酸(互補于所要檢測的RNA)雜交。在除去非特異性雜交之后，通過從雜交的探針上切割標記來鑒定興趣RNA片段。通過運用嚴格洗滌條件，除去非特異地結合的分子，這是由于他們的弱雜交(與特異地結合分子比較)所致。快速的但更少特異的方法是斑點印跡方法，除RNA直接點于膜上而沒有預先的分級分離而外，該方法的操作如同Northern印跡技術。
用于mRNA產(chǎn)物的檢測的具體方法是RNase保護分析。使組織或者細胞培養(yǎng)物的總RNA與核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸標記的探針雜交。特異性通過爾后的RNase消化實現(xiàn)。將未雜交的單鏈RNA以及非特異地與甚至小的錯配序列雜交的片段都將被識別和切割下來，而完全同源性的雙鏈RNA或者DNA/RNA雙螺旋不受酶的影響并將得到保護。能夠從降解產(chǎn)物中分離出特定的保護片段，探針從各自的標記上切割下來，而后得到測量。
給定的mRNA(或者任一核酸序列)在特定群體的組織細胞中的精確定位能夠由原位雜交測定。原位雜交甚至能夠比利用上述技術的總組織RNA制備物的分析更靈敏。這是一種情況，此時在組織的極不連續(xù)區(qū)域或者細胞類型中以高濃度表達mRNA并由整個組織的勻漿稀釋mRNA。對于原位雜交，必須按照組織化學方案凍結或者灌流固定和切片組織。用于組織切片和標記的探針的雜交方案類似于以上所描述的其它雜交方法。定量分析是可能的。
5．突變檢測技術疾病的檢測在預防和治療中顯得日益重要。正當人們難于設計用于多因子疾病的遺傳檢驗時，超過200種的已知人類疾病由單基因缺陷造成，這種單基因缺陷常常是單個氨基酸殘基的改變(Olsen，生物技術時代的工業(yè)到來，國家科學院出版社，1986)。許多這樣的突變產(chǎn)生了導致疾病的已改變的氨基酸。
敏感的突變檢測技術為突變篩選提供了極大的可能性。例如，分析甚至可以在受精卵植入之前完成(Holding和Monk,Lancet,3:532,1989)。在細胞中，日益增長的有效的遺傳檢驗也能夠在自呼吸道或者膀胱剝落(與健康檢查相關的)的細胞中篩選致癌突變(Sidransky等，科學，252:706,1991)。此外，當一個未知的基因導致遺傳病時，檢測DNA序列變異的方法可用于通過遺傳連鎖分析研究疾病的遺傳。然而，檢測并診斷個體基因中的突變提出了技術和經(jīng)濟方面的挑戰(zhàn)。人們已經(jīng)應用了數(shù)個不同的方法，但是沒有一個是既有效又廉價到足以得到真正的廣泛應用。
可用物理的、化學的或者酶促的方法在樣品中鑒定涉及單核苷酸的突變。一般地，用于突變檢測的方法可以劃分成掃描技術(適合于鑒定以前未知的突變)以及被設計來檢測、區(qū)別或者定量已知序列變體的技術。
用于突變檢測的數(shù)個掃描技術已經(jīng)在錯配的互補DNA鏈(得自野生類型和突變體序列)的異源雙鏈中得到發(fā)展，該錯配的互補DNA鏈顯示一種反常的行為，尤其是當變性時。這一現(xiàn)象被用于變性和溫度梯度凝膠電泳(分別是DGGE和TGGE)方法中。甚至在單一核苷酸位置中的錯配的雙螺旋也能夠部分地變性，結果是當在日益增長地變性梯度的凝膠中電泳時產(chǎn)生了延緩的遷移(Myers等，自然，313:495,1985；Abrams等，基因組，7:463,1990；Henco等，核酸研究，18:6733,1990)。雖然可以檢測突變，但是沒有獲得關于突變的精確位置的任一信息。必須進一步分離突變體形式并對其進行DNA序列分析。
另外，RNA探針的異源雙鏈和靶鏈可以由RnaseA在其中兩個鏈沒有適當?shù)嘏鋵Φ奈恢蒙锨懈睢Ｈ缓笥勺冃缘奶结樀碾娪灸軌驕y定切割的位點。然而，一些突變可以逃脫檢測，因為并非所有的錯配序列都由RnaseA有效地切割下來。
在雙螺旋中錯配的堿基也對化學修飾靈敏。這樣的修飾能夠使鏈對在錯配序列的位點的切割敏感或者使聚合酶在爾后延伸反應中停止?；瘜W切割技術使之可以鑒定在多達2kb的靶序列上的突變，同時它提供了關于錯配的核苷酸的近似位置的信息(Cotton等，PNAS USA 85:4397,1988；Ganguly等，核酸研究，18:3933,1991)。然而，這一技術的工作量大，并且不能鑒定突變的精確位置。
用于檢測DNA鏈中的突變的一種可替的方法是通過用一個修飾的核苷酸取代(在合成期間)一個正常的核苷酸，改變產(chǎn)物的分子量或者其它物理參數(shù)。具有增加的或者減少的質量的這種修飾的核苷酸(與野生型序列相關)的一個鏈顯示出改變的電泳遷移率(Naylor等，Lancet,337:635,1991)。這一技術檢測突變的存在但不提供位置。
兩種其它方法通過改變的凝膠遷移來目測檢驗DNA節(jié)段中的突變。在單鏈構象多態(tài)性技術(SSCP)中，突變產(chǎn)生變性的鏈來采用不同的二級結構，由此在非變性凝膠電泳期間影響遷移率。異源雙鏈DNA分子(包含內部的錯配序列)也能夠由電泳從正確地配對的分子中分離出來(Orita,基因組，5:874,1989；Keen,Trends Genet.7:5,1991)。當用以上所討論的技術時，可以測定突變的存在但不能測定其位置。此外，許多這樣的技術不區(qū)別單一和多個突變。
所有上述的技術都表明在DNA的有限節(jié)段中存在突變，并且其中的一些方法可以在節(jié)段中近似地定位突變。然而，仍然要求序列分析來闡明突變對節(jié)段的可能性編碼的影響。序列分析是十分強有力的，其使之可以例如在一個受影響的家族的其它個體中篩選相同的突變，在噁性疾病的情況下監(jiān)測疾病發(fā)展或者在自體移植之前在骨髓中檢測剩余噁性細胞。盡管有這些優(yōu)點，但由于其中牽涉昂貴的費用，因此上述方法不可能應用作為日常診斷方法。
已經(jīng)發(fā)展了大量其它技術以分析已知的序列變異。對于可以應用的這些類型分析，對于篩選個體和一般群體，自動化和經(jīng)濟是十分重要的考慮事項。下面所討論的技術沒有一個是把經(jīng)濟、自動化與所需要的特異性結合起來的。
可以經(jīng)由突變的去穩(wěn)定作用(作用于短寡核苷酸探針與靶序列的雜交)鑒定突變(參見Wetmur,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.,26:227,1991)。一般地，這一技術(即等位基因-特異性寡核苷酸雜交)包括靶序列的擴增和爾后的與短寡核苷酸探針的雜交。因此，通過測定所擴增的產(chǎn)物與固定的寡核苷酸探針系列的雜交模式，能夠掃描它的許多可能的序列變異。
然而，所有區(qū)別許多其它方法(這些方法都用于辨別核苷酸序列)的條件的建立都取決于鑒定序列差別的酶(Salki,PNAS USA 86:6230,1989；Zhang，核酸研究，19:3929,1991)。
例如，限制酶識別大約4-8個核苷酸的序列?；谄骄鵊+C含量，能夠用100種限制酶的系列監(jiān)測DNA節(jié)段中的核苷酸位置的大約一半。作為可替方法，可以通過利用部分錯配的PCR引物在可變位置周圍建立人工限制酶識別序列。用這一技術，可以單獨地識別和在擴增之后由限制酶切割或者突變體或者野生型序列(Chen等，分析生物化學，195:51,1991；Levi等，癌研究，51:3497,1991)。
另一種方法利用在3’前末端基位置錯配到靶序列上的寡核苷酸引物的性質，該寡核苷酸引物顯示出用作為PCR引物的還原容量。然而，一些3’錯配序列(特別是G-T)比其它限制它的有效性的錯配序列具有更少的抑制性。由于試圖改進這一技術，因此在自3’末端起數(shù)的第三位置將附加的錯配序列摻入引物。這在引物(與一個等位基因的變體雜交)的上述三個3’核苷酸中導致兩個錯配的位置；并且當引物與其它等位基因的變體雜交時一個錯配序列位于自3’末端起數(shù)的第三位置(Newton等，核酸研究，17:2503,1989)。定義極大地便于1bp錯配序列擴增的擴增條件是必要的。
通過測定加入至寡核苷酸引物(就在靶鏈中的可變位置的上游)的核苷酸，人們也已用DNA聚合酶來區(qū)別等位基因序列變體。
連接分析已經(jīng)得到發(fā)展。在這一方法中，由DNA連接酶結合兩個寡核苷酸探針(以立即并置方式雜交在一個靶鏈上)。如果在兩個寡核苷酸探針的連接處有一個錯配序列，那么連接受到抑制。
a．用于突變檢測的分析突變是基因組DNA的單堿基對的變化。在本發(fā)明的上下文中，通過與寡核苷酸(互補于所討論的序列)的雜交，大多數(shù)的這樣變化易于得到檢測。在這里所描述的系統(tǒng)中，使用兩個寡核苷酸檢測突變。一個寡核苷酸具有野生型序列而另一個寡核苷酸具有突變序列。當兩個寡核苷酸在野生型靶基因組序列上用作為探針時，野生型寡核苷酸將形成一個完全地堿基配對的結構，同時突變體寡核苷酸序列將形成具有單堿基對錯配序列的雙螺旋。
如以上所討論，一個6至7℃的差異(在野生型與錯配的雙螺旋的Tm方面)使得易于鑒定或者判別兩種類型的雙螺旋。為了實現(xiàn)這一判別，在錯配的雙螺旋的Tm下在各自的hybotropic溶液中進行雜交。然后測量與寡核苷酸探針系列雜交的程度。當測量野生型探針與錯配的探針的雜交程度的比例時，獲得一個10/1至大于20/1的值。這類結果使得用于突變檢測的魯棒分析(robust assay)得到發(fā)展。
作為范例目的，一種用于突變檢測的分析形式利用靶核酸(例如基因組的DNA)和跨越興趣區(qū)域的寡核苷酸探針。寡核苷酸探針大于或者等于24nt長(最大為大約36nt)，并且在寡核苷酸探針的3’或者5’末端以熒光染料標記。經(jīng)由組織培養(yǎng)細胞、組織、有機體等等在各自的雜交溶液中的溶解獲得靶核酸。然后加熱溶解的溶液至使靶核酸變性的溫度(靶核酸雙螺旋的Tm為15-25℃)。在變性溫度下加入寡核苷酸探針，同時在錯配的雙螺旋的Tm下雜交0.5至24小時。然后收集基因組DNA，并通過GF/C(GF/B等等)玻璃纖維濾器。然后用各自的雜交溶液洗滌濾器以便除去任一未雜交的寡核苷酸探針(RNA、短寡核苷酸和核酸在這些條件下沒有與玻璃纖維過濾器結合)。然后能夠自靶DNA熱洗脫出雜交的寡核苷酸探針，同時測量(例如由熒光)雜交的寡核苷酸探針。因為分析要求很高水平的靈敏度，所以要收集和測量探針。
可以利用其它的高度靈敏的雜交方案。本發(fā)明的方法使人們能夠容易分析包含懷疑存在于細胞、樣品等等中的突變的核酸(即靶核酸)?！鞍泻怂帷卑撗鹾颂呛怂?DNA)或者核糖核酸(RNA)(它的存在是令人興趣，并且它的存在或者缺乏將在雜交分析中得到檢測)的核苷酸序列。本發(fā)明的雜交方法也可以運用于核酸(RNA和/或DNA)的復合生物混合物。這樣的復合生物混合物包括各種真核生物與原核生物的細胞(包括原生質體)和/或其它生物材料(攜帶多核苷酸核酸)。因此，該方法適用于組織培養(yǎng)細胞、動物細胞、動物組織、血液細胞(例如網(wǎng)織紅細胞、淋巴細胞)、植物細胞、細菌、酵母、病毒、類菌質體、原生動物門、真菌等等。通過檢測已知來源的核酸探針之間的特異性雜交，能夠證實靶核酸的特異性存在。
用于在核酸的復合群體中檢測靶核酸的典型雜交分析方案如下所描述在凝膠基質(電泳)上按大小分離靶核酸，克隆和隔離靶核酸并將其亞劃分成庫，或者留下其作為復合群體。轉移、點滴靶核酸，或者將靶核酸固定化在固相支持體(如尼龍膜或者硝酸纖維素膜)上。(該“固定”也稱作“布置”)。然后對固定化的核酸進行加熱步驟或者UV輻射(其不可逆地固定核酸)。然后將膜浸沒在“封閉劑”中，該封閉劑包括Dendhart試劑(Dendhart,Biochem.Biophys.Res.Comm.23:641,1966)、肝素(Singh和Jones，核酸研究，12:5627,1984)以及去脂奶粉(Jones等，基因分析技術，1:3,1984)。當利用硝酸纖維素時，封閉劑一般包括在預雜交步驟和雜交步驟中。然后在上述條件下在基于hybotrope的溶液中用標記的寡核苷酸探針探測靶核酸。然后洗去未結合的酶，同時將膜浸沒在底物溶液中。然后由MALDI-MS(本質上如下所描述)檢測信號。
b．雜交測序可通過使引物與靶DNA雜交以及利用聚合酶完成鏈延伸，照慣例地完成DNA序列分析。由雙脫氧核苷酸的包含控制特異性終止。通過包含hybotrope在退火緩沖液和/或在引物中慘入無堿基殘基以及在判別溫度下退火，能夠在這類分析中增加引導的特異性。
其它序列分析方法包括靶與各種隨機的短寡核苷酸的雜交。序列由重疊雜交分析構建。在這一技術中，精確的雜交是十分重要的。對這一技術來說，hybotropes或者無堿基殘基的利用以及在判別溫度下的退火都有利于減少或者除去錯配的雜交。其目的在于發(fā)展自動雜交方法以便探測大系列的寡核苷酸探針或者大系列的核酸樣品。這樣的技術的應用包括基因作圖、克隆鑒定、醫(yī)學的遺傳學和基因新發(fā)現(xiàn)、利用雜交的DNA序列分析以及最后的測序檢定。
必須控制許多參數(shù)以便自動化或者多重測定寡核苷酸探針。各自的探針的穩(wěn)定性必須是類似的，當探針短時(即6至50個核苷酸)，與靶核酸錯配序列的程度、溫度、離子強度、探針(或者靶)的A+T含量以及其它參數(shù)應該是類似的。通常，調整實驗條件和探針的序列直到完全地堿基配對的探針形成，該完全地堿基配對的探針為包含一個錯配序列的任一雙螺旋熱力學上支持。探針的十分廣泛的應用(如雜交測序(SBH)或者檢定高度多形的基因座(如囊性纖維化跨膜蛋白基因座))要求更嚴格水平的多探針的控制。
6．系列核酸與系列DNA樣品的雜交長期用于基本的生物研究中的各種應用方面，并且當前正開始用于醫(yī)學診斷學、法醫(yī)學和農(nóng)業(yè)方面。如下面所更詳細地描述的，核酸分子或者蛋白質可以連接到固相支持體上從而形成一個系列，并且可以用本發(fā)明的加標記的分子檢驗該核酸分子或者蛋白質。
例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，系列DNA樣品能夠用于個體克隆的鑒定。簡言之，標記已知的DNA分子以產(chǎn)生標記的探針，并且通過與一組未知克隆的雜交檢驗該DNA分子。然后可以分離顯示特異性雜交(與探針)的克隆。利用無序排列的克隆可以完成這樣的分析(Sambrook等，“分子克隆實驗手冊”冷泉港，紐約，1989)。另外，有規(guī)律地攜帶已知個體特性(雖然典型地為未知的序列)的克隆的間隔的系列的膜也可以購得(例如Research Genetics,BAC克隆系列，Huntsville,AL.)。
在另一個實施方案中，系列可以用來同時測量大量基因的轉錄水平(一般參見Gess等，哺乳動物基因組，3:609-619,1992)。簡言之，cDNA的庫可以標記為探針，該探針在大量的cDNA克隆上用作為探針以便鑒定在特定組織中得到大量表達的基因。個體cDNA克隆的小系列也可以用于兩種不同的RNA樣品中來定量測量系列中的每個基因的相對表達(Schena等，科學，270:467-470,1995)。更具體地說，機器人可以用來從個體克隆中產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的小系列系列中的每個元件相應于一個單cDNA克隆。通過首先用探針標記每種組織樣品的cDNA鏈，制備用于分析的系列。為了比較在兩種組織樣品中的基因表達，用不同的標記標記每種組織樣品的cDNA。收集兩種樣品，并使其與系列一起雜交。在探針與系列雜交之后，如同本應用(其中標記與系列的每個樣品雜交)所描述的方法一樣，可以切割和分析標記。對于一個給定的基因，與每種標記的復合cDNA樣品的雜交的比率是在兩種組織樣品中的相對基因表達的測量結果。內部對照和兩種(可能高達4種)不同標記的利用對于這一應用是至關重要的。
下面所描述的許多其它應用是基于這一基本實驗的變更方法，這些應用利用不同來源的系列DNA和不同來源的探針DNA，但是由于利用了常規(guī)檢測方法，因此每一應用在雜交混合中限制于4-6個以下的可區(qū)別的探針。
另一個與DNA系列雜交的應用是雜交測序(SBH)，該應用已經(jīng)在理論上得到證明并且具有十分廣闊的應用前景。雜交測序(SBH)的概念利用一組所有可能的N核苷酸寡聚體(N鏈節(jié))以鑒定存在于未知的DNA序列中的N鏈節(jié)。然后能夠利用計算方法來裝配全序列(一般參見Drmanac等，科學，260:1649-1652,1993)。SBH的應用包括重疊DNA克隆的物理作圖(排序)、序列檢測、正?；蚝椭虏』虻腄NA指紋分析比較以及在互補DNA和基因組的文庫中具有特異的序列基元的DNA片段的鑒定。
DNA系列在遺傳變異和多態(tài)性的檢測方面也有廣泛的應用。通過固定已知的序列變體和用標記的PCR產(chǎn)物(得自病人或者病原體)探測，單堿基對改變、缺失和插入、突變和多態(tài)性都能夠得到檢測(參見例如Guo等，核酸研究，22:5456-5465,1994)。同樣地，寡核苷酸的系列可以用來測量遺傳變異，包括抗藥性和HIV的藥物敏感變體(參見例如Lipshutz等，生物技術，19:442-447,1995)。
利用至少兩種不同的技術能夠產(chǎn)生DNA系列單獨產(chǎn)生(點滴)的樣品的原位合成和沉積作用。用于DNA樣品的原位產(chǎn)生的最重要技術之一是如在Pease等，P.N.A.S.USA 91:5022-6,1994中所描述的寡核苷酸的光指導合成。簡言之，通過利用光不穩(wěn)定的阻斷基團(其在系列中利用現(xiàn)代的光能無機營養(yǎng)方法指導寡核苷酸合成)產(chǎn)生確定的DNA序列的系列。制備掩蔽，這樣將每一個系列元件(其在下一個合成步驟中需要特異性堿基)暴露于光中。將一種單核苷酸殘基加入至每一條鏈(為掩蔽所暴露)中，合成循環(huán)完成時，利用另一個掩蔽和另一個寡核苷酸殘基開始下一個循環(huán)。這一方案的連續(xù)應用能夠用來快速構建極大量的寡核苷酸。關于用于轉錄分析的系列的利用，在Schena等(1995)中描述了一種形式的自動沉積作用。
在本發(fā)明的一個實施方案中，第二成員布置在固相支持體(如硅石、石英和玻璃)上面。然后可以處理系列以便封阻非特異的雜交，其后在固相支持體上培養(yǎng)第一成員標記的探針。在某些優(yōu)選的實施方案中，然后用溶液(在確定的嚴格性下)沖洗該系列以便除去非特異地雜交的核酸，用包括基質材料(其適合于光譜測定法或者電位滴定法，例如適合于基質輔助的激光解吸和離子化質譜法)的溶液清洗該系列，干燥該系列以便形成一個適當?shù)幕|，然后將所形成的基質暴露于光中以便從核酸探針上切割標記。然后可以用光譜測定或者電位滴定技術分析切割的標記(例如MALDI-MS)。
在特定的實施方案中，切割和激光解吸發(fā)生在單一步驟中。在其它變更方法中，激光解吸和離子化是在沒有基質的情況下完成的。在一些實驗中，將參考標記的寡核苷酸或者其它標記的化合物加入至基質溶液中以便控制在光切割效率、激光解吸以及MS檢測效率方面的變化。通過測量測試標記和一系列參考標記的豐度之間的比率，可從MALDI-MS數(shù)據(jù)中提取定量信息。
在其它實施方案中，系列由長度小于50bp的寡核苷酸組成。對于遺傳作圖，這一方法能夠用于檢測多態(tài)性(例如單堿基對改變)；或者對于分析或者分類克隆、親權認定、法醫(yī)學、遺傳作圖，這一方法能夠用于檢測一種特定DNA在樣品中的存在或缺乏。系列同樣可以由蛋白質組成。C．核酸片段的分離需要分析的樣品在復合基質中常常是許多組分的混合物。對于包含未知的化合物的樣品，必須相互分離組分以便每一個體組分能夠用其它分析方法鑒定。在一定的條件下混合物中的組分的分離性質是不變的，因此一旦確定了分離性質，它們就能夠用來鑒定和定量每一組分。在色譜和電泳分析分離中，這樣的方法是典型的。
1．高效液相色譜(HPLC)高效液相色譜(HPLC)是分離溶解在溶液中的化合物的色譜分離技術。HPLC儀器由流動相的貯液槽、泵、注射器、分離柱以及檢測器組成。通過把一小份的樣品混合物注射在柱上來分離化合物。由于他們在流動相和固定相之間的分配行為的區(qū)別，混合物中的不同的組分以不同的速率通過。
前不久，在無孔PS/DVB顆粒(具有以化學方法結合的烷基鏈)上的IP-RO-HPLC顯示出在可提供相似程度的分辨率的單和雙鏈核酸分析中可快速代替毛細管電泳(Huber等，1993，分析生物化學，212,p351；Huber等，1993，核酸研究，21,p1061；Huber等，1993，生物技術，16，p898)。與離子交換色譜相比，離子交換色譜并非總是保持雙鏈作為單鏈的函數(shù)(因為AT堿基對與帶正電的固定相之間發(fā)生比GC堿基對強烈的相互作用)，而IP-RP-HPLC則使一個嚴格地依賴于大小的分離能夠進行。
一種利用100mM三乙基銨乙酸鹽作為離子配對試劑的方法已經(jīng)得到了發(fā)展，在烷基化的無孔的2.3μM聚(苯乙烯-二乙烯基苯)顆粒上依靠高效液相色譜該方法能夠成功地分離磷酸二酯寡核苷酸(Oefher等，1994，分析生物化學，223,p39)。所描述的技術使PCR產(chǎn)物的分離僅僅能夠區(qū)別4至8個長度為50至200個核苷酸范圍的堿基對。
2．電泳電泳是一種基于離子(或者如同在這里所描述的情況一樣的DNA)在電場中的遷移率的分離技術。帶負電的DNA向陽極遷移，而帶正電的離子向陰極遷移。為安全起見，一個電極通常接地，而另一個電極偏陽性或者陰性。帶電物質具有不同的遷移速率，這取決于他們的總電荷量、大小以及形狀，因此能夠分離帶電物質。電極裝置由高壓電源、電極、緩沖液以及緩沖液的載體(如聚丙烯酰胺凝膠)或者毛細管組成。開口的毛細管用于許多種類型的樣品中，而其它的凝膠載體通常用于生物樣品(如蛋白質混合物或者DNA片段)中。
3．毛細管電泳(CE)在其各種表現(xiàn)形式(自由溶液、等速電泳、等電點聚焦、聚丙烯酰胺凝膠、膠束動電“色譜”)中的毛細管電泳(CE)正發(fā)展成為一種很小體積的復合混合物樣品的快速的高分辨分離的方法。與MS的固有靈敏度和選擇性結合起來，CE-MS是一種潛在的強有力的生物分析技術。在這里所說明的新應用中，這兩種方法的耦合將產(chǎn)生極好的DNA測序方法，該測序方法使當前的測序的速率方法暗然失色(相差數(shù)個數(shù)量級)。
CE和電噴射離子化(ESI)流速之間的相符以及二者都有利于(主要用于)溶液中的離子產(chǎn)物的事實都為極端吸引力的組合提供了基礎。毛細管區(qū)帶電泳(CZE)和毛細管等速電泳與基于ESI的四極(quadrapole)質譜儀的綜合已得到描述(Olivares等，分析化學，59:1230,1987；Smith等，分析化學，60:436,1988；Loo等，分析化學，179:404,1989；Edmonds等，J.chroma. 474:21,1989；Loo等，J.Microcolumn Sep.1:223,1989；Lee等，色譜分析雜志，458:313,1988；Smith等，色譜分析雜志，480:211,1989；Grese等，J.Am.Chem.Sco.111:2835,1989)。小肽容易適合于高(飛姆托摩爾)靈敏度的CZE分析。
DNA片段的最強有力的分離方法是聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(一般采用平板凝膠格式)。然而，當前技術的主要局限性是要求用比較長的時間來完成測序反應中所產(chǎn)生的DNA片段的凝膠電泳。通過利用毛細管電泳(其利用超薄凝膠)能夠實現(xiàn)增加量度(10倍)。在達到一級近似的自由溶液中，由于堿基的加入導致質量和電荷的補償，因此所有DNA以相同的遷移率遷移。在聚丙烯酰胺凝膠中，DNA片段篩和作為長度的函數(shù)的遷移現(xiàn)在已運用于CE中。現(xiàn)在用交聯(lián)的聚丙烯酰胺已經(jīng)達到值得注意的塔板數(shù)(每米10+7個平板，Cohen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美國，85:9660,1988)。這樣的如上所描述的CE柱能夠用于DNA測序。在標準測序儀中，CE的方法在理論上比平板凝膠電泳快25倍。例如，每小時能夠閱讀大約300個堿基。在平板凝膠電泳中分離速度受到電場大小(其能夠運用于凝膠而不產(chǎn)生過熱)的限制。因此，通過使用更高的電場強度可達到更大的CE速度(CE中的300V/cm相對于平板凝膠電泳中的10V/cm)。毛細管格式減少了電流強度和這樣的功率以及所導致的產(chǎn)熱。
Smith和其它人員(Smith等，核酸研究，18:4417,1990)曾建議平行地使用多個毛細管以增加處理量。同樣地，Mathies和Huang(Mathies和Huang，自然，359:167,1992)曾介紹毛細管電泳(其中在平行排列的毛細管上進行分離)并且顯示了高處理量的測序(Huang等，分析化學，64:967,1992；Huang等，分析化學，64:2149,1992)。毛細管電泳的主要缺點是只有有限量樣品能夠填裝在毛細管上。通過在毛細管開始時在分離之前收集大量的樣品，可增加載荷能力，同時檢測水平能夠降低幾個數(shù)量級。在CE中，預收集的最普及方法是樣品堆積。前不久，樣品堆積已得到評論(Chien和Burgi，分析化學，64:489A,1992)。樣品堆積依賴于樣品緩沖液和毛細管緩沖液之間的基質區(qū)別(pH，離子強度)，所以穿過樣品區(qū)帶的電場不只是毛細管區(qū)域中的電場。在樣品堆積中，低濃度緩沖液中的大量樣品被引入以便在毛細管柱的前端預收集。毛細管充滿相同組合物的緩沖液，但是濃度更高。當樣品離子到達毛細管緩沖液和低電場時，它們就堆積成一個濃縮的區(qū)帶。樣品堆積增加了1-3個數(shù)量級的檢測限。
另一個預收集的方法是在分析物的自由區(qū)帶CE分離之前運用等速電泳(ITP)。相比于典型地與CE相聯(lián)系的低nL注射體積，ITP是一種使得微升體積可以填裝在毛細管上的電泳技術。該技術取決于在分別為較高和較低遷移率(相比于分析物)的兩種緩沖液(先行和尾隨電解質)之間的樣品插入。該技術固有地是濃縮技術，其中分析物收集到以相同速度遷移的純化區(qū)帶中。當前該技術沒有如上所描述的堆積方法普及，這是由于需要先行和尾隨電解質的數(shù)個選擇以及在分離過程期間僅僅分離陽離子或者陰離子產(chǎn)物的能力。
DNA測序過程的核心是顯著選擇性的DNA或者寡核苷酸片段的電泳分離。這是值得注意的，因為它僅僅根據(jù)核苷酸分辨和區(qū)別每一片段。人們已經(jīng)獲得多達1000個片段的分離(1000bp)。具有可切割標記的測序的其它優(yōu)點如下。當DNA片段由聚丙烯酰胺凝膠電泳分離時，當使用可切割的標記時，沒有必要使用平板凝膠形式。由于混合了大量樣品(4至2000個)，因而沒有必要如同當前的染色引物或者染色終止子方法(即ABI373測序儀)的情況一樣以平行方式處理樣品。由于沒有理由運行平行泳道，因而沒有理由使用平板凝膠。因此，人們能夠使用電泳分離方法的管式凝膠格式。Grossman(Grossman等，遺傳分析技術應用，9:9,1992)指出當管式凝膠格式用來代替平板凝膠格式時，可獲得大量的優(yōu)點。這是因為管格式具有更大的散射焦耳熱的能力(與平板凝膠相比)，這種能力使管格式產(chǎn)生了更快的運行時間(50％)以及更高的高分子量DNA片段的分辨率(大于1000nt)。在基因組的測序中，長時間閱讀是決定性的。因此，可切割的標記在測序中的利用具有附加的優(yōu)點，該優(yōu)點使用戶可以使用最有效的和最靈敏的DNA分離方法(也具有最高分辨率)。
4．微型制造的裝置毛細管電泳(CE)是一種用于DNA測序、法醫(yī)檢定、PCR產(chǎn)物分析和限制片段大小排列的強有力的方法。由于用毛細管凝膠能夠應用很高的電勢場，因此CE遠快于傳統(tǒng)的平板PAGE。然而，CE具有僅僅允許每種凝膠只處理一種樣品的弊端。該方法將更快速的CE分離時間與平行分析多個樣品的能力結合起來。在微型制造的裝置的利用之后的基本原理是在電泳中通過使泳道尺寸小型化到大約100微米來增加信息密度的能力。電子工業(yè)日常利用微型制造來制造具有大小不到一微米的特性的電路。當前的毛細管系列密度受到毛細管外徑的限制。通道的微型制造產(chǎn)生更高密度的系列。微型制造也使之不可能用玻璃纖維進行物理裝配，并且微型制造把通道直接與芯片上的其它裝置相連接。極少有裝置構建在用于分離技術的微型芯片上。氣相色譜儀(Terry等，IEEE Trans.ElectronDevice,26:1880,1979)和液相色譜儀(Manz等，Sens.Actuators B1:249,1990)已經(jīng)制造在硅芯片上，但是這些裝置還沒有得到廣泛的利用。幾個組曾報道在微型制造的裝置上分離熒光染料和氨基酸(Manz等，色譜分析雜志，593:253,1992；Effenhauser等，分析化學，65:2637,1993)。前不久Woolley和Mathies(Woolley和Mathies,Proc.Natl.Acad.Sci.91:11348,1994)曾指出影印石版術和化學浸蝕能夠用來在玻璃底物上制造大量的分離通道。通道充滿羥乙基纖維素(HEC)分離基質。這表明DNA限制片段可以在少至兩分鐘之內得到分離。
d．標記的切割如上所描述，不同的接頭設計將在不同的具體的物理或者化學條件下賦予可切割性(“不穩(wěn)定性”)。用作切割各種設計的接頭的條件的例子包括酸、堿、氧化、還原、氟原子、巰基交換、光解以及酶促條件。
可切割的接頭的例子(滿足以上列出的接頭的一般標準)將是那些本領域技術人員所熟知的例子，并且包括那些在由Pierce(Rockford,IL)提供的目錄中發(fā)現(xiàn)的例子。這些例子包括●亞乙基二醇雙(琥珀酰亞胺基丁二酸鹽)(EGS)，一種為羥胺(1M,37℃，歷時3-6小時)所切割的胺活性的交聯(lián)試劑；●二琥珀酰亞胺基酒石酸鹽(DST)和硫代-DST，其是可由0.015M高碘酸鈉切割的胺活性的交聯(lián)試劑；●雙[2-(氧化琥珀酰亞胺基羰氧基)乙基]砜(BSOCOES)和硫代-BSOCOES，該胺活性的交聯(lián)試劑可由堿(pH11.6)切割；●1.4-二-[3’-(2’-砒啶基二硫代(丙酰胺基))丁烷(DPDPB)，一種可由巰基交換或者還原所切割的砒啶基二硫代交聯(lián)劑；●N-[4-(對疊氮水揚酰氨基)-丁基]-3’-(2’-砒啶基二硫代)丙酰胺(APDP)，一種可由巰基交換或者還原所切割的二硫代交聯(lián)劑；●雙-[β-4-(對疊氮水楊酰氨基)乙基]-二硫化物，一種可由巰基交換或者還原所切割的光敏交聯(lián)劑；●N-琥珀酰亞胺基-(4-疊氮苯基)-1,3’二硫代丙酸酯(SADP)，一種可由巰基交換或者還原所切割的光敏交聯(lián)劑；●硫代琥珀酰亞胺基-2-(7-疊氮-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3’-二硫代丙酸酯(SAED)，一種可由巰基交換或者還原所切割的光敏交聯(lián)劑；●硫代琥珀酰亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲酰氨基)-乙基-1,3’二硫代丙酸酯(SAND)，一種可由巰基交換或者還原所切割的光敏交聯(lián)劑。
其它可切割的接頭和能夠用來釋放標記的切割條件的例子如下。甲硅烷基連接基團能夠由氟原子或者在酸性條件下切割。3-,4-,5-或者6-取代-2-硝基芐氧基或者2-,3-,5-或者6-取代-4-硝基芐氧基連接基團能夠由光子源(光解)切割。3-,4-,5-或者6-取代-2-烷氧基苯氧基或者2-,3-,5-或者6-取代-4-烷氧基苯氧基連接基團能夠由Ce(NH4)2(NO3)6(氧化)切割。NCO2(尿烷)接頭能夠由氫氧化物(堿)、酸或者LiA1H(還原)切割。3-戊烯基、2-丁烯基或者1-丁烯基連接基團能夠由O3、OsO4/IO4-或者KMnO4(氧化)切割。2-[3-,4-或者5-取代-呋喃基]氧化連接基團能夠由O2、Br2、MeOH或者酸切割。
其它不穩(wěn)定的連接基團的切割條件包括能夠由酸切割的叔烷氧基，能夠由H3O-切割的甲基(二烴基)甲氧基或者4-取代-2-烷基-1,3-二氧戊環(huán)-2-基連接基團，能夠由氟原子或者酸切割的2-甲硅烷基乙氧基連接基團，能夠在堿性條件下切割的2-(X)-乙氧基(X=酮基、酯酰胺、氰基、NO2、硫化物、亞砜、砜)連接基團，能夠由酸或者在還原條件下切割的2-,3-,4-,5-或者6-取代-芐氧基連接基團，能夠由(Ph3P)3RhCl(H)切割的2-丁烯氧基連接基團，能夠由鋰、鎂或者BuLi切割的3-,4-,5-或者6-取代-2-溴代苯氧基連接基團，能夠由Hg2+切割的甲基硫代甲氧基連接基團，能夠由鋅或者鎂切割的2-(X)-乙氧基(其中X=鹵素)連接基團，能夠由氧化切割(例如用Pb(OAc)4)的2-羥基乙氧基連接基團。
優(yōu)選的接頭是那些由酸或者光解切割的接頭。幾個已開發(fā)為固相肽合成的酸不穩(wěn)定接頭可用于把標記與MOI相連接。某些上述接頭在一份由Lloyd-Williams等撰寫的最新的綜述(四面體，49:11065-11133,1993)中有描述。一種有用類型的接頭基于對烷氧基芐醇，其中的兩個-4-氫化甲基苯氧基乙酸和4-(4-氫化甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸是由AdvancedChemTech(Louisville,KY)市售的。這兩種接頭能夠經(jīng)由與芐醇結合的酯鍵連接到標記上，以及經(jīng)由與羧酸結合的酰胺鍵連接到包含胺的MOI上。用不同濃度的三氟乙酸從MOI中釋放出由這些分子連接的標記。這些接頭的切割導致了在標記上的羧酸的釋放。通過相關接頭(如2,4-二甲氧基-4’-(羧甲氧基)-二苯甲基胺(由Advanced ChemTech以保護的FMOC形式提供))連接的標記的酸切割導致了在釋放的標記上的羧化酰胺的釋放。
可用于本申請的光不穩(wěn)定接頭也已用于大多數(shù)已開發(fā)為固相肽合成的接頭(參見Lloyd-Williams綜述)。這些接頭通?；?-二硝基芐酯或者2-硝基苯甲酰胺。最近在文獻中報道的兩個光不穩(wěn)定接頭的例子是4-(4-(1-Fmoc-氨基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸(Holmes和Jones，有機化學雜志，60:2318-2319,1995)和3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯)丙酸(Brown等，分子多樣性，1:4-12,1995)。這兩種接頭能夠經(jīng)由羧酸連接到MOI的胺上。標記向接頭的連接通過在標記上的羧酸和接頭上的胺之間形成酰胺來實現(xiàn)。光不穩(wěn)定接頭的切割通常用350nm波長的UV光線以本領域所知的強度和時間來完成。接頭的切割導致在標記上的一級酰胺的釋放。可光切割的接頭的例子包括硝基苯甘氨酸酯、外和內2-苯并降冰片(benzonorborneyl)氯化物和甲烷磺酸酯以及3-氨基-3(2-硝基苯)丙酸。酶促切割的例子包括切割酯鍵的酯酶、切割磷酸二酯鍵的核酸酶、切割肽鍵的蛋白酶等等。E．標記的檢測檢測方法典型地取決于在某些類型的光譜領域中的吸收與發(fā)射。當原子或者分子吸收光線時，進入的能量激發(fā)量子化的結構至更高的能級。激發(fā)的類型取決于光的波長。紫外或者可見光使電子躍遷至更高的軌道上，紅外光激發(fā)分子振動，以及微波激發(fā)旋轉。吸收光譜是作為波長的函數(shù)的光吸收。原子或者分子的光譜取決于它的能級結構。吸收光譜可用于化合物的鑒定。具體的吸收光譜方法包括原子吸收光譜(AA)、紅外光譜(IR)和紫外可見光譜(uv-vis)。
激發(fā)到高能級的原子或者分子能夠通過放射輻射衰變至較低能級。如果在相同旋轉狀態(tài)之間躍遷，那么這種光發(fā)射稱為熒光，如果躍遷發(fā)生在不同旋轉狀態(tài)之間則稱為磷光。分析物的發(fā)射強度與濃度(在低濃度)成線性的正比，并且可用于量化發(fā)射類型。具體的發(fā)射光譜方法包括原子發(fā)射光譜(AES)、原子熒光光譜(AFS)、分子激光誘導熒光(LIF)以及X射線熒光(XRF)。
當電磁輻射穿過物質時，大多數(shù)輻射繼續(xù)以它原來的方向傳輸，但是有一小部分沿其它方向散射。以與入射光波長相同的波長散射的光線稱為瑞利散射。在透明固體中由于振動而散射的光線稱為布里淵散射。布里淵散射典型地由入射光的0.1至1個波數(shù)變換。由于分子中的或者不透明固體中的光學聲子中的振動而散射的光線稱為拉曼散射。拉曼散射光由多達4000個的入射光波數(shù)變換。具體的散射光譜方法包括拉曼光譜。
紅外光譜是樣品的中紅外光的吸收波長與強度的測量。中紅外光(2.5-50μm,4000-200cm-1)能量高得足以激發(fā)分子振動到更高的能級。紅外吸收帶的波長具有特定類型的化學鍵的特征，并且對有機和有機金屬分子的鑒定來說紅外光譜通常最有用。
近紅外吸收光譜法(NIR)是樣品的近紅外光的吸收波長與強度的測量。近紅外光橫跨800nm-2.5μm(12,500-4000cm-1)范圍，并且能量高得足以激發(fā)分子振動的泛頻峰(overtones)和綜合峰到更高的能級。近紅外吸收光譜法典型地用于有機官能團尤其是O-H、N-H和C=的定量測量。NIR儀器的組件和設計類似于uv-vis吸收光譜儀。光源通常是鎢燈，檢測器通常是一臺PbS固態(tài)檢測器。樣品容器可以是玻璃或者石英，典型的溶劑是CCl4以及CS2。NIR光譜的方便儀器使之適合于在線監(jiān)測和過程控制。
紫外-可見吸收光譜(uv-vis)光譜法是樣品的近紫外和可見光的吸收波長和吸收強度的測量。在真空UV中的吸收發(fā)生在100-200nm(105-50,000cm-1)；在石英UV中的吸收發(fā)生在200-350nm(50,000-28570cm-1)；在可見光中的吸收發(fā)生在350-800nm(28,570-12,500cm-1)，并且所有這些均由Beer-Lambert-Bouguet定律描述。紫外和可見光能量高得足以使外部電子躍遷至更高能級。UV-vis光譜法通常能夠應用于溶液中的分子和無機離子或者復合體。UV-vis光譜受限于光譜的寬譜(broad)特性。對uv測量來說光源通常是氫或者氘燈，對可見光測量來說光源通常是鎢燈。這些連續(xù)光源的波長用波長分離器(如棱柱或者光柵單色器)選擇。通過掃描波長分離器獲得光譜，同時由光譜或者在單一波長進行定量測量。
質譜儀利用在離子化的原子或者分子的質荷比(m/z)方面的差異來相互分離它們。因此，質譜法可用于原子或者分子的定量，也可用于測定分子的化學和結構信息。分子具有明顯的斷裂模式，該斷裂模式提供了鑒定化合物的結構信息。質譜儀的一般操作如下。生成氣相離子，在基于其質荷比的空間或者時間中分離上述離子，同時測量每種質荷比的離子的數(shù)量。質譜儀的離子分離能力由分辨率描述，該分辨率定義為R=m/δm，其中m是離子質量，δm是在質譜中的兩個可分辨峰之間的質量差。例如，1000分辨率的質譜儀能夠分辨100.0m/z的離子至100.1m/z的離子。
一般來說，質譜儀(MS)由離子源、質量選擇分析器以及離子檢測器組成。磁性扇區(qū)(magnetic-sector)、四極以及飛行時間設計也要求抽提和加速離子光學系統(tǒng)以便把離子從源區(qū)域轉移到質量分析器。幾個質量分析器設計(磁扇形掃描MS、四極MS或者飛行時間MS的)的細節(jié)討論如下。磁扇形掃描MS的單聚焦分析器利用180、90或者60度的顆粒束通道。影響顆粒的各種聚焦以不同的質荷比分離離子。對于雙聚焦分析器，在這種類型儀器上增加了一個靜電分析器以便根據(jù)動能的差異來分離顆粒。
四極MS的四極濾質器由平行排列的四根金屬棒組成。所施加的電壓影響沿位于四根棒之中的飛行通道飛行的離子的軌道。對于給定的直流和交流電壓，只有具有一定質荷比的離子才能穿過四極過濾器，而所有其它離子都偏離他們原來的軌道。當棒體上的電壓變化時，通過監(jiān)測穿過四極過濾器的離子獲得質譜。
飛行時間質譜儀利用通過“漂移區(qū)域”的飛行時間的差異來分離不同質量的離子。它以脈沖方式操作，所以離子必須以脈沖形式產(chǎn)生和/或以脈沖形式提取。脈沖電場用qV的動能加速所有離子進入無場漂移區(qū)域，其中q是離子電荷，V是施加的電壓。由于離子動能是0.5mV2，因此輕離子比重離子具有更高的速度，并且輕離子很快就到達漂移區(qū)域末端的檢測器。離子檢測器的輸出作為產(chǎn)生質譜的時間的函數(shù)顯示在示波器上。
離子形成過程是質譜分析的起點?；瘜W離子化是一種使用試劑離子的方法，該試劑離子與分析物分子(標記)進行反應從而由或者質子或者氫離子轉移形成離子。通過把過量甲烷(與標記相關)引入電子碰撞(EI)離子源產(chǎn)生試劑離子。電子碰撞產(chǎn)生CH4+和CH3+(它們進一步與甲烷進行反應以形成CH5+和C2H5+)。另一種離子化標記的方法是通過等離子體和輝光放電。等離子體是熱的、部分離子化的氣體，該氣體有效地激發(fā)和離子化原子。輝光放電是保持在兩電極之間的低壓等離子體。電子碰撞離子化使用電子束(通常由鎢絲產(chǎn)生)來離子化氣相原子或者分子。該電子束的電子撞擊出分析物原子或者分子中的電子以產(chǎn)生離子。電噴射離子化(ESI)利用十分精細的針和一系列撇乳器，將樣品溶液噴射至源腔室之中以形成小滴。當離開毛細管時小滴攜帶電荷，當溶劑汽化時小滴消失而留下高度帶電的分析物分子。ESI尤其可用于難于汽化或者離子化的大生物分子。快原子轟擊(FAB)利用中性原子的高能束(典型地是Xe或者Ar)，該高能束撞擊固相樣品而造成解吸和離子化。它可用于難于進入氣相的大生物分子。FAB造成小斷裂，并且常常給出大分子離子峰，該離子峰使它可用于分子量測定。盡管電荷交換細胞存在，但是仍可通過加速離子源的離子產(chǎn)生原子束。離子在與中性原子的碰撞中獲得電子從而形成一束高能原子。激光離子化(LIMS)是一種方法，其中激光脈沖從樣品表面融化材料，并產(chǎn)生離子化一些樣品組分的微等離子體?；|輔助激光解吸離子化(MALDI)是汽化和離子化大生物分子(如蛋白質或者DNA片段)的LIMS方法。該生物分子分散在固相基質(如煙酸)上。UV激光脈沖融化基質，該基質攜帶一些大分子至離子化形式的氣相之中，這樣就能夠將它們提取至質譜儀中。等離子體解吸離子化(PD)利用252Cf的衰變，該衰變產(chǎn)生兩個以相反方向遷移的裂解片段。一個片段撞擊樣品而擊出1-10個分析物離子。另一個片段撞擊檢測器并且觸發(fā)數(shù)據(jù)獲取開始。這一離子化法尤其可用于大生物分子。共振離子化(RIMS)是一種方法，其中一個或多個激光束調諧在氣相原子或者分子躍遷的共振頻率(其使之以逐步方式躍遷至它的離子化勢之上)上從而產(chǎn)生離子。次級離子化(SIMS)利用離子束(如3He+、16O+或者40Ar+)，該離子束聚焦在樣品表面并且濺射材料到氣相中。火花源是一種在固相樣品中利用脈沖輸送電流通過兩個電極來離子化分析物的方法。
標記可以在從分子(標記連接到其上)上切割之前、在切割期間或者在切割之后帶電?；陔x子“解吸”、離子自固相或者液態(tài)表面的直接形成或者發(fā)射的離子化方法已經(jīng)使之可以運用于非揮發(fā)性的和熱不穩(wěn)定的化合物中。這些方法使之不需要在離子化之前使中性分子揮發(fā)，并常常使分子產(chǎn)物的熱降解最大限度地減少。這些方法包括場解吸(Becky，場離子化和場解吸質譜法的原理，Pergamon,Oxford,1977)、等離子體解吸(Sundqvist和Macfarlane，質譜法研究，4:421,1985)、激光解吸(Karas和Hillenkamp，分析化學，60:2295,1988；Karas等，Angew.Chem.101:805,1989)、快顆粒轟擊(例如快原子轟擊(FAB)以及次級離子質譜法(SIMS),Barber等，分析化學，54:645A,1982)以及熱噴射(TS)離子化(Vestal，質譜法研究，2:447,1983)。熱噴射廣泛應用于與液相色譜的在線結合。連續(xù)流FAB方法(Caprioli等，分析化學，58:2949,1986)也顯示出巨大的應用潛力。更完全的離子化/質量光譜結合的列表是離子阱質譜法、電噴射離子化質譜法、離子噴射質譜法、液態(tài)離子化質譜法、氣壓離子化質譜法、電子撞擊離子化質譜法、亞穩(wěn)原子轟擊離子化質譜法、快原子質譜轟擊離子化質譜法、MALDI質譜法、光離子化飛行時間質譜法、激光小滴質譜法、MALDI-TOF質譜法、APCI質譜法、毫微噴射質譜法、霧化噴射離子化質譜法、化學離子化質譜法、共振離子化質譜法、次級離子化質譜法、熱噴射質譜法。
適合于非易揮發(fā)的生物化合物的離子化方法有重復的應用范圍。離子化效率高度依賴于基質組合物和化合物類型。當前可得的結果表明TS的上限分子量是大約8000道爾頓(Jones和Krolik,Rapid Comm.MassSpectrom.1:67,1987)。由于TS主要用四極質譜儀實施，因此在較高質荷比(m/z)時靈敏度典型地不成比例地受損。飛行時間(TOF)質譜儀是市售的，并且具有m/z范圍僅僅受到檢測器效率的限制的優(yōu)點。最近介紹了兩個附加的離子化方法?，F(xiàn)在這兩種方法稱作為基質輔助激光解吸(MALDI,Karas和Hillenkamp，分析化學，60:2299,1988；Karas等，Angew. Chem.101:805,1989)和電噴射離子化(ESI)。這兩種方法具有非常高的離子化效率(即非常高的[產(chǎn)生的分子離子]/[消耗的分子])。確定技術最終應用前景的靈敏度依賴于試樣量、離子的數(shù)量、流速、檢測效率和實際離子化效率。
電噴射質譜法基于在二十世紀六十年代首先提出的思想(Dole等，化學生理學雜志，49:2240,1968)。電噴射離子化(ESI)是一種為質譜法分析產(chǎn)生帶電分子的方法。簡言之，電噴射離子化通過在強靜電場中霧化液體來產(chǎn)生高度帶電的小滴。高度帶電的小滴(一般在大氣壓下在干浴氣體中形成)因中性溶劑的汽化而收縮，直到電荷排斥克服內聚力(導致“庫侖爆炸(Coulombic explosion)”)。離子化的確切機理是有爭議的，幾個組曾提出假設(Blades等，分析化學，63:2109-14,1991；Kebarle等，分析化學，65:A972-86；Fenn，美國質譜學會雜志4:524-35,1993)。不論離子形成的最終過程是怎樣的，ESI都在輕度條件下自溶液中產(chǎn)生帶電分子。
在少量的有機分子上獲得有用的質譜數(shù)據(jù)的能力取決于離子的有效產(chǎn)生。ESI的離子化效率是與正電荷(與分子相聯(lián)系)的大小有關。在實驗上改進離子化通常包括利用酸性條件。其它改進離子化的方法利用過季胺類(當可能時)(參見Aebersold等，蛋白質科學，1:494-503,1992；Smith等，分析化學，60:436-41,1988)。
下面將更詳細地描述電噴射離子化。電噴射離子的產(chǎn)生需要兩步在鄰近大氣壓下高度帶電小滴的分散，其后在一定條件下誘導汽化。將一根針(保持高電勢)穿過分析物分子的溶液。在針的末端，溶液分散成薄霧狀的高度帶電小滴(包含分析物分子)。小滴快速汽化，同時由場解吸或者剩余汽化的方法，將質子化的蛋白質分子釋放成氣相。一般通過應用高電場到毛細管的低流速液體(一般1-10μL/min)中來產(chǎn)生電噴射。典型地，在毛細管和對電極之間(相距0.2-2cm)應用3-6kV的電勢差(其中取決于去溶劑化程度的離子、帶電群以及甚至帶電小滴，都可以通過小管口由MS抽取樣品)。電場在毛細管末端在液態(tài)表面產(chǎn)生電荷積累；因此，液體流速、粘滯力以及表面張力在小滴產(chǎn)生中是重要因素。強電場導致液態(tài)表面的破裂和高度帶電液態(tài)小滴的形成。能否產(chǎn)生能夠帶正電或者帶負電的小滴取決于毛細管偏倚。陰離子方式要求存在電子清除劑(如抑制放電的氧)。
能夠以靜電方式(或者借助于霧化劑)噴射各種液體至真空之中。僅僅應用電場于霧化中導致一些在液體電導率和介電常數(shù)范圍的實踐限制。對于在有用的液體流速(與＜10-4M的含水電解質溶液相應)下的穩(wěn)定電噴射，在室溫下要求少于10-5ohms的溶液電阻率。在發(fā)現(xiàn)最有用于ESI-MS的方式中，適當?shù)囊后w流速導致液體分散成為薄霧狀。毛細管的短距離小滴直徑常常是統(tǒng)一的，大約為1μm。特別重要的是對于更高的液體流速整個電噴射離子流僅僅些微地增加。有證據(jù)表明加熱可用于操作電噴射。例如，輕微加熱使得含水溶液易于電噴射，這大概是因為粘度與表面張力的減少。熱輔助和氣體霧化輔助電噴射使得可以利用更高的液體流速，但是減少了小滴的帶電量。分子離子的形成需要影響初始的小滴群體的汽化的條件。通過在轉運通過界面期間加熱以及(尤其是在離子捕獲方法的情況下)通過在較低壓力下的能量碰撞，由中等溫度(＜60℃)的干氣的流動能夠在高壓下達到這一條件。
雖然作為ESI的基礎的詳盡過程仍然不確定，但是由ESI產(chǎn)生的十分小的小滴似乎使得幾乎任一在溶液中攜帶凈電荷的產(chǎn)物可以在剩余溶劑汽化之后轉移到氣相。此時，質譜檢測要求離子在去溶劑化之后具有易于控制的m/z范圍(＜4000道爾頓，對于四極儀器)，以及可以足夠效率產(chǎn)生和傳遞離子。已發(fā)現(xiàn)適合于ESI-MS的許多溶質以及離子化效率對分子量的實質依賴性的缺乏，這二者提出了一個高度非區(qū)別和廣泛可適用的離子化方法。
電噴射離子“來源”在接近大氣壓下起作用。典型地，電噴射“來源”是與電偏向液體溶液(與對電極有關)的方法結合的金屬或者玻璃毛細管。溶液(典型地是包含分析物并常常包含其它添加劑(如乙酸)的水-甲醇混合物)流動至毛細管末端。ESI來源已經(jīng)得到描述(Smith等，分析化學，62:885,1990)，其本質上能夠適應任一溶劑系統(tǒng)。典型地，ESI的流速是1-10μl/min。對ESI-MS界面的主要要求在于盡可能有效地從高壓區(qū)域抽取樣品和轉運離子進入MS。
ESI(可用于這里所描述的本發(fā)明)的效率可以是十分高的從而為極靈敏的測量方法提供了基礎。當前的儀器效能能夠為大約2×10-12或者大約107計數(shù)/s(單一帶電產(chǎn)物)的檢測器提供總離子流。在該儀器效能的基礎上，如果分析物完全離子化，那么低至10-10M或者大約10-18mol/s的單一帶電產(chǎn)物濃度將給出可檢測的離子流(大約10counts/s)。例如，對于季銨離子，已經(jīng)利用與毛細管區(qū)帶電泳的ESI界面獲得低的渺摩爾檢測限(Smith等，分析化學，59:1230,1988)。對于1000分子量的化合物，電荷的平均數(shù)量是1，電荷狀態(tài)的近似數(shù)是1，峰寬(m/z)是1，最大強度(離子/s)是1×1012。
在獲得ESI質譜的過程中實際上只消耗非常少量的樣品(Smith等，分析化學，60:1948,1988)。通過利用具有扇形裝置的系列檢測器(允許同時檢測光譜的組分)也能夠獲得許多增益。由于當前只有由ESI形成的所有離子的大約10-5得到檢測，因此注意限制儀器效能的因素可以為改進的靈敏度提供基礎。本發(fā)明涉及和包括在離子化和檢測方法方面的改進，這對于那些本領域技術人員這將是明顯的。
界面優(yōu)選地放置在分離儀器(例如凝膠)和檢測器(例如質譜儀)之間。界面優(yōu)選地具有下列性質(1)在考慮周到的時間間隔內收集DNA片段的能力，(2)收集DNA片段，(3)從電泳緩沖液與環(huán)境中除去DNA片段，(4)從DNA片段上切割標記，(5)分離標記與DNA片段，(6)排列DNA片段，(7)放置標記在易揮發(fā)的溶液中，(8)揮發(fā)和離子化標記，以及(9)放置或者轉運標記至電噴射裝置(引入標記于質譜儀中)。
當DNA片段從凝膠底部洗脫時，界面也具有“收集”DNA片段的能力。凝膠可以由平板凝膠、管凝膠、毛細管等等組成。DNA片段能夠用數(shù)種方法收集。第一種方法是利用電場的收集方法，其中DNA片段聚集在電極上或者靠近電極。第二種方法是其中通過使液體流流過凝膠底部來收集DNA片段。上述兩種方法的某些方面能夠綜合在一起，其中DNA收集到流動流(稍后能夠通過利用電場收集該流動流)中。最終結果是DNA片段從環(huán)境(在該環(huán)境下能夠實現(xiàn)分離方法)中除去。也就是說，通過利用電場能夠將DNA片段從一種溶液類型“拖曳”至另一種溶液類型。
一旦DNA片段處于適當?shù)娜芤?可與電噴射和質譜法兼容)中，標記就能夠從DNA片段上切割下來。然后通過施加電場能夠從標記中分離DNA片段或者其剩余部分(優(yōu)選地，標記所帶電荷與DNA標記的相反)。然后通過利用電場或者流動液體將標記引入電噴射裝置。
由熒光標記吸收的和熒光發(fā)射的波長和強度，能夠最直接地鑒定和量化熒光標記。
當常規(guī)分光熒光計極端靈活時，它提供連續(xù)范圍的激發(fā)和發(fā)射波長(lEX、ls1、ls2)，更專門的儀器(如流式細胞儀和激光掃描顯微鏡)要求探針在單一固定的波長都是可激發(fā)的。在現(xiàn)代儀器中，這通常是氬激光器的488nm線。
每個探針分子的熒光強度與e和QY的乘積成正比。在具有當前實際重要性的熒光團中的這些參數(shù)的范圍分別是大約10,000至100,000cm-1M-1(對于ε)和0.1至1.0(對于QY)。當吸收為高強度照明所驅動而趨向于飽和時，激發(fā)熒光團(光漂白的)的不可逆破裂成為限制熒光檢測限的因子。光漂白的實際效果取決于所討論的熒光檢測技術。
可以將裝置(界面)插入分離和檢測步驟之間以便使得大小分離和標記檢測(實時)的連續(xù)操作得以進行，對于本領域技術人員這將是明顯的。這綜合了分離方法和儀器用法與檢測方法和形成單一裝置的儀器用法。例如，將界面插入分離技術和檢測(用質譜法或者恒電位電流分析法)之間。
界面的功能主要是使(如質譜法)標記從分析物釋放。有幾個代表性的界面執(zhí)行過程。界面的設計依賴于可切割的接頭的選擇。在可光切割的或者可光照切割的接頭的情況下，要求能量或者光子源。在酸不穩(wěn)定接頭、堿不穩(wěn)定接頭或者二硫化物接頭的情況下，在界面中要求試劑加入。在熱不穩(wěn)定接頭的情況下，要求熱源能量。對于酶敏感的接頭(如特異性蛋白酶和肽接頭、核酸酶和DNA或RNA接頭、糖基酶、HRP或者磷酸酶以及在切割之后不穩(wěn)定的接頭(例如，類似于化學螢光底物))，要求酶加入。界面的其它特征包括最小限度的譜帶增寬、DNA在注入質譜儀之前從標記中的分離。分離技術包括那些基于電泳方法和技術的技術、親和性技術、大小保留(透析)、過濾等等。
也可以收集標記(或者核酸-接頭-標記構建體)，以電泳方式俘獲標記，然后釋放標記成為交替試劑流(其可與選擇的具體類型的離子化方法兼容)。界面也能夠在微型玻璃珠上俘獲標記(或者核酸-接頭-標記構建體)、將小珠射入腔室然后進行激光解吸/汽化。也可能在流動中提取成為交替緩沖液(例如由毛細管電泳緩沖液穿過透性膜成為疏水緩沖液)。也可能需要在一些利用中間歇地傳送標記進入質譜儀(其將包含界面的其他功能)。界面的另一個功能在于借助于每個柱旋轉的時間空檔從多個柱傳送標記進入質譜儀。此外，也可能從單柱傳送標記進入多個MS檢測器(由時間分離)，用幾毫秒時間收集每一系列標記，然后傳送到質譜儀。
下列是可用于本發(fā)明的分離和檢測技術的代表性賣主的列表。Hoefer科學儀器公司(舊金山，CA)制連測序應用方面的電泳設備(TwoStepTM,Poker FaceTMⅡ)。Pharmacia生物技術公司(Piscataway,NJ)制造DNA分離和測序的電泳設備(用于PCR-SSCP分析的PhastSystem,用于DNA測序的MacroPhor System)。Perkin Elmer/應用生物系統(tǒng)部(ABI,Foster City,CA)制造基于熒光染料的半自動序列分析儀(ABI373和ABI377)。分析光譜裝置公司(Boulder,CO)制造UV分光儀。Hitachi儀器公司(東京，日本)制造原子吸收分光計、熒光分光儀、LC和GC質譜儀、核磁共振分光儀以及UV-vis分光儀。PerSeptive生物系統(tǒng)公司(Framingham,MA)生產(chǎn)質譜儀(VoyagerTMElite)。Bruker儀器公司(Manning Park,MA)制造傅里葉變換紅外分光儀(載體22)、傅里葉變換拉曼分光儀、飛行時間質譜儀(ReflexⅡTM)、離子阱質譜儀(EsquireTM)和Maldi質譜儀。分析技術公司(ATI，波士頓，MA)制造毛細管凝膠電泳裝置、UV檢測器以及二極管系列檢測器。Teledyne電子技術公司(Mountain View,CA)制造離子阱質譜儀(3DQ Discovery和3DQApogeeTM)。Perlkin Elmer/應用生物系統(tǒng)部(Foster City,CA)制造可與電噴射兼容的Sciex質譜儀(三聯(lián)四極LC/MS/MS,API 100/300)。Hewlett-Packard(Santa Clara,CA)生產(chǎn)質量選擇檢測器(HP 5972A)、MALDI-TOF質譜儀(HP G2025A)、二極管系列檢測器、CE裝置、HPLC裝置(HP1090)以及UV分光儀。Finnigan公司(San Jose,CA)制造質譜儀(磁性扇區(qū)(MAT 95 STM)、四極分光儀(MAT 95 SQTM)和其它四個相關的質譜儀)。Rainin(Emeryville,CA)制造HPLC儀器。
這里所描述的方法和組合物使之可以利用所切割的標記(用作為圖譜)于特定的樣品類型和核苷酸特性。在每一種測序方法開始時，一個特定的(選擇的)引物分配一個特定的唯一標記。標記作圖于樣品類型、雙脫氧終止子類型(在Sanger測序反應的情況下)之任一或者(優(yōu)選地)二者。具體地說，標記作圖于引物類型，該引物類型反過來作圖于載體類型，該載體類型反過來作圖于樣品性質。參照標記的引物放置于其中的雙脫氧核苷酸反應，標記也可以作圖于雙脫氧終止子(ddTTP、ddCTP、ddGTP、ddATP)。然后進行測序反應，并及時地按大小依次分離產(chǎn)生的片段。
在序框中將標記從片段上切割下來，并在時序框中測量和記錄所切割的標記。通過比較標記圖譜和時序框構建序列。也就是說，在依大小排列步驟之后所有標記性質都及時地得到記錄，同時相關的標記性質變得與時序框中的性質相互相關。依大小排列步驟按照一個核苷酸增量分離核酸片段，因而相關的標記性質按照一個核苷酸增量分離。由預知的雙脫氧終止子或者核苷酸圖譜和樣品類型，容易以線型方式推定序列。
提供下列實施例作為例證而不是作為限制。
除非有其它說明，用于實施例的化學藥品可以得自Aldrich化學公司，Milwaukee,WI。在這里使用了具有所說明的意義的下列縮寫ANP=3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯)丙酸NBA=4-(Fmoc-氨甲基)-3-硝基苯甲酸HATU=O-7-氮雜苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟-磷酸酯DIEA=二異丙基乙胺MCT=一氯三嗪NMM=4-甲基嗎啉NMP=N-甲基吡咯烷酮ACT357=現(xiàn)代化學技術公司，Louisville,KY的ACT357肽合成儀ACT=現(xiàn)代化學技術公司，Louisville,KYNovaBiochem=CalBiochem-NovaBiochem International,San Diego,CATFA=三氟乙酸Tfa=三氟乙酰iNIP=N-甲基六氫異煙酸Tfp=四氟苯基DIAEA=2-(二異丙氨基)乙胺MCT=一氯三氮烯5’-AH-ODN=5’-氨基己基-尾隨的寡脫氧核苷酸實施例實施例1用于可切割標記測序的酸不穩(wěn)定接頭的制備A．可化學切割(釋放具有羧基酰胺末端的標記)的質譜標記的五氟苯酯的合成圖1顯示反應圖解。
步驟A．用DMF將TentaGel SAC樹脂(化合物Ⅱ；由ACT提供；1當量)懸浮在ACT357肽合成儀(ACT)的收集器中。加入在DMF中的化合物Ⅰ(3當量)、HATU(3當量)和DIEA(7.5當量)，同時搖動收集器1小時。除去溶劑，并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂。重復化合物Ⅰ與樹脂的偶聯(lián)和洗滌步驟，以給出化合物Ⅲ。
步驟B．使樹脂(化合物Ⅲ)與在DMF中的25％哌啶混合，并搖動5分鐘。過濾樹脂，然后與在DMF中的25％哌啶混合，并且搖動10分鐘。除去溶劑，并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂，并且直接在步驟C中利用所得的樹脂。
步驟C．使得自步驟B的脫保護樹脂懸浮在DMF中，同時在其中加入在DMF中的FMOC保護的氨基酸(在其側鏈包含胺官能團(化合物Ⅳ，如α-N-FOMC-3-(3-吡啶基)-丙氨酸，由Synthetech提供，Albany,OR；3當量))、HATU(3當量)以及DIEA(7.5當量)。搖動容器1小時。除去溶劑，并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂。重復化合物Ⅳ與樹脂的偶聯(lián)和洗滌步驟，以給出化合物Ⅴ。
步驟D．用如步驟B所描述的哌啶處理樹脂(化合物Ⅴ)以除去FMOC基團。然后由ACT357將脫保護的樹脂從收集器等分到16個反應容器中。
步驟E．使得自步驟D的脫保護樹脂的16個等分試樣懸浮在DMF中。在每一個反應容器中加入適當?shù)脑贒MF中的羧酸Ⅵ1-16(R1-16CO2H;3當量)、HATU(3當量)和DIEA(7.5當量)。搖動容器1小時。除去溶劑，并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂的等分試樣。重復化合物Ⅵ1-16與樹脂的等分試樣的偶聯(lián)和洗滌步驟，以給出化合物Ⅶ1-16。
步驟F．用CH2Cl2(3X)洗滌樹脂(化合物Ⅶ1-16)的等分試樣。在每一個反應容器中加入在CH2Cl2中的1％TFA，同時搖動容器30分鐘。從反應容器過濾溶劑到單獨的管中。用CH2Cl2(2X)和MeOH(2X)洗滌樹脂的等分試樣，濾液混合入單獨的管中。在真空中蒸發(fā)單獨的管，從而提供化合物Ⅷ1-16。
步驟G．在DMF中溶解每個游離的羧酸Ⅷ1-16。在每種溶液中加入吡啶(1.05當量)，其后加入五氟苯基三氟乙酸酯(1.1當量)。在室溫下振蕩上述混合物45分鐘。所得溶液用EtOAc稀釋，用1M檸檬酸(3X)和5％含水NaHCO3(3X)洗滌，在Na2SO4上干燥，過濾，并在真空中蒸發(fā)，從而提供化合物Ⅸ1-16。B．可化學切割(釋放具有羧酸末端的標記)的質譜法標記的五氟苯酯的合成圖2顯示反應圖解。
步驟A．使4-(羥甲基)苯氧基丁酸(化合物Ⅰ；1當量)與在CHCl3中的DIEA(2.1當量)和烯丙基溴化物(2.1當量)混合，并加熱以回流2小時。上述混合物用EtOAc稀釋，用1N HCl(2X)、pH9.5碳酸鹽緩沖液(2X)和鹽水(1X)洗滌，在Na2SO4上干燥，并在真空中蒸發(fā)以給出烯丙基酯化合物Ⅰ。
步驟B．在CH2Cl2中使得自步驟A的化合物Ⅰ的烯丙基酯(1.75當量)與FMOC保護的氨基酸(在其側鏈包含胺官能團(化合物Ⅱ，如α-N-FOMC-3-(3-吡啶基)-丙氨酸，由Synthetech提供，Albany,OR；3當量))、N-甲基嗎啉(2.5當量)以及HATU(1.1當量)混合，并在室溫下振蕩4小時。上述混合物用CH2Cl2稀釋，用1M含水檸檬酸(2X)、水(1X)以及5％含水NaHCO3(2X)洗滌，在Na2SO4上干燥，并在真空中蒸發(fā)。用閃爍色譜法分離化合物Ⅲ(CH2Cl2--＞EtOAc)。
步驟C．將化合物Ⅲ溶解在CH2Cl2中，加入Pd(PPh3)4(0.07當量)以及N-甲基苯胺(2當量)，同時在室溫下將上述混合物振蕩4小時。上述混合物用CH2Cl2稀釋，用1M含水檸檬酸(2X)和水(1X)洗滌，在Na2SO4上干燥，并在真空中蒸發(fā)。用閃爍色譜法分離化合物Ⅳ(CH2Cl2-＞EtOAc+HOAc)。
步驟D．用DMF將TentaGel S AC樹脂(化合物Ⅴ；1當量)懸浮在ACT357肽合成儀(Advanced ChemTech Inc.(ACT),Louisville,KY)的收集器中。加入在DMF中的化合物Ⅳ(3當量)、HATU(3當量)和DIEA(7.5當量)，同時搖動收集器1小時。除去溶劑，并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂。重復化合物Ⅳ與樹脂的偶聯(lián)和洗滌步驟，以給出化合物Ⅵ。
步驟E．使樹脂(化合物Ⅵ)與在DMF中的25％哌啶混合，并且搖動5分鐘。過濾上述樹脂，然后與在DMF中的25％哌啶混合，并搖動10分鐘。除去溶劑，同時用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂。然后由ACT357將脫保護的樹脂從收集器等分到16個反應容器中。
步驟F．使得自步驟E的脫保護樹脂的16個等分試樣懸浮在DMF中。在每一個反應容器中加入適當?shù)脑贒MF中的羧酸Ⅶ1-16(R1-16CO2H；3當量)、HATU(3當量)和DIEA(7.5當量)。搖動容器1小時。除去溶劑，并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂的等分試樣。重復化合物Ⅶ1-16與樹脂的等分試樣的偶聯(lián)和洗滌步驟，以給出化合物Ⅷ1-16。
步驟G．用CH2Cl2(3X)洗滌樹脂(化合物Ⅷ1-16)的等分試樣。在每一個反應容器中加入在CH2Cl2中的1％TFA，同時搖動容器30分鐘。從反應容器過濾溶劑到單獨的管中。用CH2Cl2(2X)和MeOH(2X)洗滌樹脂的等分試樣，濾液混合入單獨的管中。在真空中蒸發(fā)單獨的管，從而提供化合物Ⅸ1-16。
步驟H．在DMF中溶解每個游離的羧酸Ⅸ1-16。在每種溶液中加入吡啶(1.05當量)，其后加入五氟苯基三氟乙酸酯(1.1當量)。在室溫下振蕩上述混合物45分鐘。所得溶液用EtOAc稀釋，用1M檸檬酸(3X)和5％含水NaHCO3(3X)洗滌，在Na2SO4上干燥，過濾，并在真空中蒸發(fā)，從而提供化合物X1-16。
實施例2T-L-X的光解切割的示范在室溫下用近紫外光照射在實施例11中制備的T-L-X化合物7分鐘。在350nm具有發(fā)射峰的Rayonett熒光UV燈(Southern EnglandUltraviolet Co.,Middletown,CT)用作為UV光源。該燈放置在距離裝有樣品的陪替氏培養(yǎng)皿15cm的地方。SDS凝膠電泳顯示在這些條件下＞85％的綴合物得到切割。
實施例3熒光標記的引物的制備以及熒光團的切割的示范寡核苷酸的合成和純化利用標準的亞磷酰胺化學(由賣主供給)或者H-膦酸酯化學(GlennResearch Sterling),VA)在自動DNA合成儀上制備寡核苷酸(ODN)。適當?shù)胤庾璧膁A、dG、dC和T亞磷酰胺以這些形式市售，同時合成核苷可以容易轉化成為適當?shù)男问?。利用由賣主供給的標準的亞磷酰胺或者H-膦酸酯化學法制備寡核苷酸。由標準方法的修改的方法純化寡核苷酸。利用15％至55％MeCN(在Et3NH+OAc-中，pH7.0)的梯度由12微米、300#Rainin(Emeryville,CA)Dynamax C-8 4.2x250 mM反相柱在HPLC上進行具有5’-三苯甲基的寡核苷酸的層析，該過程歷時20分鐘。當完成脫三苯甲基時，由凝膠排阻色譜進一步純化寡核苷酸。用PRP柱(Alltech,Deerfield,IL)在堿性pH下和由PAGE實施寡核苷酸的質量分析校核。
2,4,6-三氯三嗪衍生的寡核苷酸的制備使10至1000μg 5’-末端胺連接的寡核苷酸與過量的再結晶的氰尿酰氯(在10％正甲基-吡咯烷酮中)在堿性(優(yōu)選為pH8.3至8.5)緩沖液中在19℃至25℃下反應30至12分鐘。最后的反應條件由0.15M硼酸鈉(pH8.3)、2mg/ml再結晶氰尾酰氯和500μg/ml的各寡核苷酸組成。由大小排阻色譜法在G-50葡聚糖凝膠(Pharmacia,Piscataway,NJ)柱上除去未反應的氰尿酰氯。
然后使活化的純化寡核苷酸與100倍摩爾過量的胱胺在0.15M硼酸鈉(pH8.3)中在室溫下反應1小時。由大小排阻色譜法在G-50葡聚糖凝膠柱上除去未反應的胱胺。然后使衍生的ODN制劑與胺活性的熒光染料反應。將衍生的ODN制劑分成3部分，并使每一部分與任一(a)20倍摩爾過量的得克薩斯紅磺酰氯(分子探針，Eugene,OR)、與(b)20倍摩爾過量的麗絲胺磺酰氯(分子探針，Eugene,OR)、(c)20倍摩爾過量的熒光素異硫氰酸鹽反應。最后的反應條件由0.15M硼酸鈉(pH8.3)、1小時、室溫組成。由大小排阻色譜法在G-50葡聚糖凝膠柱上除去未反應的熒光染料。
為了從寡核苷酸上切割熒光染料，將ODN調整至1×10-5摩爾，然后在TE(TE是0.01MTris、pH7.0、5mM EDTA)中制備(12,3倍稀釋)稀釋液。在100μl體積的ODN中加入25μl0.01M二硫蘇糖醇(DTT)。在控制的同一系列中沒有DDT加入。在室溫下培養(yǎng)上述混合物15分鐘。在一個黑色的微量滴定板中測量熒光。從培養(yǎng)管(150微升)中除去溶液，并將該溶液放置在一個黑色的微量滴定板(Dynatek實驗室，Chantilly,VA)中。然后利用495nm的激發(fā)波長并在520nm監(jiān)測熒光素的發(fā)射，利用591nm的激發(fā)波長并在612nm監(jiān)測得克薩斯紅的發(fā)射，以及利用570nm的激發(fā)波長并在590nm監(jiān)測麗絲胺的發(fā)射，利用FluoroskanⅡ熒光計(Flow實驗室，McLean,VA)直接閱讀平板。熒光染料的摩非切割的RFU切割的RFU游離的RFU爾數(shù)1.0×105M6.4 1200 13453.3×106M2.4 451 4561.1×106M0.9 135 1303.7×107M0.3 44481.2×107M0.12 15.3 16.04.1×107M0.14 4.9 5.11.4×108M0.132.52.84.5×109M0.120.80.9上述數(shù)據(jù)表明當熒光染料從ODN切割下來時，在相關的熒光方面有大約200倍增加。
實施例4標記的M13序列引物的制備以及標記的切割的示范2,4,6-三氯三嗪衍生的寡核苷酸的制備使1000μg 5’-末端胺連接的寡核苷酸(5’-己胺-3-TGTAAAAGGACGGCCAGT-3’)(Seq.ID No.1)與過量的再結晶氰尿酰氯在10％正甲基-吡咯烷酮堿性(優(yōu)選為pH8.3至8.5)緩沖液中在19至25℃下反應30至120分鐘。最后的反應條件由0.15M硼酸鈉(pH8.3)、2mg/ml再結晶氰尿酰氯和500μg/ml的各寡核苷酸組成。在G-50 Sephadex柱上由大小排阻色譜法除去未反應的氰尿酰氯。
然后使活化的純化寡核苷酸與100倍摩爾過量的胱胺在0.15M硼酸鈉(pH8.3)中在室溫下反應1小時。在G-50 Sephadex柱上由大小排阻色譜法除去未反應的胱胺。然后使衍生的ODN與各種酰胺進行反應。然后將衍生的ODN分成12份，并使每一份與下列之任一的五氟苯基酯進行反應(25摩爾過量的)(1)4-甲氧基苯甲酸、(2)4-氟苯甲酸、(3)甲苯甲酸、(4)苯甲酸、(5)吲哚-3-乙酸、(6)2,6-二氟苯甲酸、(7)煙酸N-氧化物、(8)2-硝基苯甲酸、(9)5-乙酰水楊酸、(10)4-乙氧基苯甲酸、(11)肉桂酸、(12)3-氨基煙酸。反應在0.2M硼酸鈉(pH 8.3)中在37℃下進行2小時。在G-50 Sephadex上由凝膠排阻色譜純化衍生的ODN。
為了從寡核苷酸上切割標記，將ODN調整至1×10-5摩爾，然后在TE(TE是0.01M Tris、pH7.0、5mM EDTA)中用50％EtOH(V/V)制備(12,3倍稀釋)稀釋液。在100μl體積的ODN中加入25μl0.01M二硫蘇糖醇(DTT)。在對照的同一系列中沒有DDT加入。在室溫下培養(yǎng)上述混合物30分鐘。然后加入NaCl至0.1M，同時加入2體積EtOH以沉淀出ODN。通過4℃、14,000xG、15分鐘的離心從溶液中除去ODN。保存并完全干燥上清液。然后在25μlMeOH中溶解粒狀沉淀。然后由質譜法檢定該粒狀沉淀是否存在標記。
用于這一工序的質譜儀是一種外部離子源的傅里葉變換質譜儀(FTMS)。為MALDI分析制備的樣品沉淀在直接探針的尖端上，將該樣品插入離子源中。當用激光脈沖照射樣品時，從源中提取離子，并使離子進入長四極離子導向裝置，該導向裝置聚焦和運輸離子到FTMS分析池(內部定位于超導磁體的內部)中。
光譜產(chǎn)生下列信息。在強度方面變化于25至100相對強度單位的峰值具有下列的分子量(1)212.1amu(表明4-甲氧基苯甲酸的衍生物)、(2)200.1amu(表明4-氟苯甲酸的衍生物)、(3)196.1amu(表明甲苯甲酸的衍生物)、(4)182.1amu(表明苯甲酸的衍生物)、(5)235.2amu(表明吲哚-3-乙酸的衍生物)、(6)218.1amu(表明2,6-二氟苯甲酸的衍生物)、(7)199.1amu(表明煙酸N-氧化物的衍生物)、(8)227.1amu(表明2-硝基苯甲酰胺)、(9)179.18amu(表明5-乙酰水楊酸的衍生物)、(10)226.1amu(表明4-乙氧基苯甲酸的衍生物)、(11)209.1amu(表明肉桂酸的衍生物)、(12)198.1amu(表明3-氨基煙酸的衍生物)。
上述結果表明可從引物上切割標記并可由質譜法檢測該標記。
實施例5一系列具有式R1-36-Lys(ε-INIP)-ANP-TFP的化合物的制備圖3說明一系列36種T-L-X(X=Lh)化合物的平行合成，其中Lh是活化的酯(具體地說，是四氟苯酯)，L2是具有L3的鄰硝基芐胺基，L3是連接Lh和L2的亞甲基，T具有模塊結構(其中賴氨酸的羧酸基團已結合至L2芐胺基的氮原子上而形成一個酰胺鍵)，同時可變重量組分R1-36(其中這些R基團相當于這里所定義的T2，并且可以經(jīng)由這里所列的任一特定羧酸引入)通過賴氨酸的α-氨基結合，而質譜靈敏度增強基團(經(jīng)由N-甲基六氫異煙酸引入)則通過賴氨酸的ε-氨基結合。
參考圖3步驟A.用DMF將NovaSyn HMP樹脂(由NovaBiochem提供；1當量)懸浮在ACT357的收集器中。在DMF中加入化合物Ⅰ(得自ACT的ANP；3當量)、HATU(3當量)和NMM(7.5當量)，并搖動收集器1小時。除去溶劑，同時用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂。重復化合物Ⅰ與樹脂的偶聯(lián)和洗滌步驟，以給出化合物Ⅱ。
步驟B．使樹脂(化合物Ⅱ)與在DMF中的25％哌啶混合，并搖動5分鐘。所得樹脂過濾，然后與在DMF中的25％哌啶混合，并搖動10分鐘。除去溶劑，用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂，所得樹脂直接用于步驟C。
步驟C．將得自步驟B的脫保護樹脂懸浮在DMF中，并在其中加入在DMF中的FMOC保護的氨基酸(在它的側鏈上包含保護的胺官能團(FMOC-賴氨酸(Aloc)-OH，由PerSeptive Biosystems提供；3當量)、HATU(3當量)和NMM(7.5當量)。搖動容器1小時。除去溶劑，同時用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂。重復Fmoc-賴氨酸(Aloc)-OH與樹脂的偶聯(lián)和洗滌步驟，以給出化合物Ⅳ。
步驟D．用CH2Cl2(2X)洗滌樹脂(化合物Ⅳ)，然后將其懸浮在在CH2Cl2中的(PPh3)4Pd(0)(0.3當量)和PhSiH3(10當量)的溶液中。搖動混合物1小時。除去溶劑，并用CH2Cl2(2X)洗滌樹脂。重復鈀步驟。除去溶劑，并用CH2Cl2(2X)、在DMF(2X)中的N,N-二異丙基乙基銨二乙基二硫代氨基甲酸酯、DMF(2X)洗滌樹脂以給出化合物Ⅴ。
步驟E．使得自步驟D的脫保護樹脂與如步驟C所描述的N-甲基六氫異煙酸偶聯(lián)以給出化合物Ⅵ。
步驟F．由ACT357將Fmoc保護的樹脂Ⅵ從收集器等分成36個反應容器以給出化合物Ⅵ1-36。
步驟G．用如步驟B所描述的哌啶處理樹脂(化合物Ⅵ1-36)以除去Fmoc基團。
步驟H．使得自步驟G的脫保護樹脂的36個等分試樣懸浮在DMF中。在每一個反應容器中加入適當?shù)聂人?R1-36CO2H；3當量)、HATU(3當量)和在DMF中的NMM(7.5當量)。搖動容器1小時。除去溶劑，同時用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂的等分試樣。重復R1-36CO2H與樹脂的等分試樣的偶聯(lián)和洗滌步驟，以給化合物Ⅷ1-36。
步驟Ⅰ．用CH2Cl2(3X)洗滌樹脂的等分試樣(化合物Ⅷ1-36)。在每一個反應容器中加入90∶5∶5的TFA∶H2O∶CH2Cl2，并搖動容器120分鐘。溶劑從反應容器中過濾到單獨的管中。用CH2Cl2(2X)和MeOH(2X)洗滌樹脂的等分試樣，濾液混入單獨的管中。在真空中蒸發(fā)單獨的管，從而提供化合物Ⅸ1-36。
步驟J．將每個游離的羧酸Ⅸ1-36溶解在DMF中。在每一種溶液中加入吡啶(1.05當量)，其后加入四氟苯酯三氟乙酸酯(1.1當量)。在室溫下振蕩混合物45分鐘。所得溶液用EtOAc稀釋，用5％NaHCO3水溶液(3X)洗滌，在Na2SO4上干燥，過濾，并在真空中蒸發(fā)，從而提供化合物Ⅹ1-36。
實施例6一系列式R1-36-LYS(ε-INIP)-NBA-TFP的化合物的制備圖4說明一系列36種T-L-X化合物(X=Lh)的平行合成，其中Lh是活化的酯(具體地說，是四氟苯酯)，L2是具有L3的鄰硝基芐胺基，L3是Lh和L2之間的直接鍵，其中Lh直接結合至L2基團的芳環(huán)上，T具有模塊結構(其中賴氨酸的羧酸基團已結合至L2芐胺基的氮原子上而形成酰胺鍵)，同時可變重量組分R1-36(其中這些R基團相當于這里所定義的T2，并可以經(jīng)由這里所列的任一特異性羧酸引入)通過賴氨酸的α-氨基結合，而質譜增強基團(經(jīng)由N-甲基六氫異煙酸引入)則通過賴氨酸的ε-氨基結合。
參考圖4步驟A．按照實施例5的步驟A所描述的方法使NovaSyn HMP樹脂與化合物Ⅰ偶聯(lián)(按照Brown等，分子多樣性，1,4(1995)的方法所制備的NBA)以給出化合物Ⅱ。
步驟B-J．如同實施例5中的步驟B-J所描述的一樣處理樹脂(化合物Ⅱ)以給出化合物X1-36。
實施例7一系列式INIP-Lys(ε-R1-36)-ANP-TFP的化合物的制備圖5說明一系列36種T-L-X化合物(X=Lh)的平行合成，其中Lh是活化的酯(具體地說，是四氟苯酯)，L2是具有L3的鄰硝基芐胺基，L3是Lh和L2的亞甲基團連接，T具有模塊結構(其中賴氨酸的羧酸基團已結合至L2芐胺基的氮原子上而形成酰胺鍵，同時可變重量組分R1-36(其中這些R基團相當于這里所定義的T2，并可以經(jīng)由這里所列的任一特定羧酸引入)通過賴氨酸的ε-氨基結合，而質譜靈敏度增強基團(經(jīng)由N-甲基六氫異煙酸引入)則通過賴氨酸α-氨基結合。
參考圖5步驟A-C．與實施例5相同。
步驟D．如同實施例5中的步驟B所描述的一樣用哌啶處理樹脂(化合物Ⅳ)以除去Fmoc基團。
步驟E．如同實施例5中的步驟C所描述的一樣使在步驟D中在樹脂上脫保護的α-胺與N-甲基六氫異煙酸偶聯(lián)以給出化合物Ⅴ。
步驟F．與實施例5相同。
步驟G．如同實施例5中的步驟D所描述的一樣用鈀處理樹脂(化合物Ⅵ1-36)以除去Aloc基團。
步驟H-J．按照與實施例5相同的方法制備化合物X1-36。
實施例8一系列式R1-36-谷氨酸(γ-DIAEA)-ANP-TFP的化合物的制備圖6說明一系列36種T-L-X化合物(X=Lh)的平行合成，其中在Lh是活化的酯(具體地說，是四氟苯酯)，L2是具有L3的鄰硝基芐胺基，L3是連接Lh和L2的亞甲基團，T具有模塊結構(其中谷氨酸的α-羧酸基團結合至L2芐胺基的氮原子上而形成酰胺鍵)，同時可變重量組分R1-36(其中這些R基團相當于這里所定義的T2，并且可以經(jīng)由這里所列的任一特定羧酸引入)通過谷氨酸的α-氨基結合，而質譜靈敏度增強基團(經(jīng)由2-(二異丙氨基)乙胺引入)則通過谷氨酸的γ-羧酸結合。
參考圖6步驟A-B．與實施例5相同。
步驟C．利用實施例5的步驟C所描述的偶聯(lián)方法使脫保護的樹脂(化合物Ⅲ)與Fmoc-谷氨酸-(OAl)-OH偶聯(lián)以給出化合物Ⅳ。
步驟D．用CH2Cl2(2X)洗滌在樹脂(化合物Ⅳ)上的烯丙基酯，并使其與在CH2Cl2中的(PPh3)4Pd(0)(0.3當量)和N-甲基苯胺(3當量)的溶液混合。搖動混合物1小時。除去溶劑，并用CH2Cl2(2X)洗滌樹脂。重復鈀步驟。除去溶劑，并用CH2Cl2(2X)、在DMF(2X)中的N,N-二異丙基乙基銨二乙基二硫代氨基甲酸酯、DMF(2X)洗滌樹脂以給出化合物Ⅴ。
步驟E．使得自步驟D的脫保護的樹脂懸浮在DMF中，并通過混合HATU(3當量)和NMM(7.5當量)激活該樹脂。搖動容器15分鐘。除去溶劑，并用NMP(1X)洗滌樹脂。將樹脂與2-(二異丙氨基)乙胺(3當量)和NMM(7.5當量)混合。搖動容器1小時。重復2-(二異丙氨基)乙胺與樹脂的偶聯(lián)和洗滌步驟以給出化合物Ⅵ。
步驟F-J．與實施例5相同。
實施例9一系列式R1-36-Lys(ε-INIP)-ANP-Lys(ε-NH2)-NH2的化合物的制備圖7說明一系列36種T-L-X化合物(X=Lh)的平行合，其中Lh是胺(具體地說，是賴氨酸衍生的部分的ε-氨基)，L2是具有L3的鄰硝基芐胺基，L3是連接Lh和L2的羧基酰氨基取代的亞烷基氨酰基亞烷基基團，T具有模塊結構(其中賴氨酸的羧酸基團已結合至芐胺基的氮原子上而形成酰胺鍵)，以及可變重量組分R1-36(其中這些R基團相當于這里所定義的T2，并且可以經(jīng)由這里所列的任一特定羧酸引入)通過賴氨酸的α-氨基結合，而質譜靈敏度增強基團(經(jīng)由N-甲基六氫異煙酸引入)則通過賴氨酸的ε-氨基結合。
參考圖7步驟A．-將Fmoc-Lys(Boc)-SRAM樹脂(由ACT提供；化合物Ⅰ)與在DMF中的25％哌啶混合并搖動5分鐘。過濾樹脂，然后將其與在DMF中的25％哌啶混合并搖動10分鐘。除去溶劑，用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂，并在步驟B中直接利用該樹脂。
步驟B．加入樹脂(化合物Ⅱ)、ANP(由ACT提供；3當量)、HATU(3當量)和在DMF中的NMM(7.5當量)，并搖動收集器1小時。除去溶劑，并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗滌樹脂。重復化合物Ⅰ與樹脂的偶聯(lián)和洗滌步驟，以給出化合物Ⅲ。
步驟C-J.如同實施例5中的步驟B-I一樣處理樹脂(化合物Ⅲ)以給出化合物X1-36。
實施例10一系列式R1-36-Lys(ε-TFA)-Lys(ε-INIP)-ANP-TFP的化合物的制備圖8說明一系列36種T-L-X化合物(X=Lh)的平行合成，其中Lh是活化的酯(具體地說，是四氟苯酯)，L2是具有L3的鄰硝基芐胺基，L3是連接Lh和L2的亞甲基團，T具有模塊結構(其中第一個賴氨酸的羧酸基團結合至L2芐胺基的氮原子上而形成酰胺鍵)，質譜靈敏度增強基團(經(jīng)由N-甲基六氫異煙酸引入)通過第一個賴氨酸的ε-氨基結合，第二個賴氨酸分子(molecle)已通過第一個賴氨酸的α-氨基結合至第一個賴氨酸上，分子量調節(jié)基團(具有使三氟乙酰結構)通過第二個賴氨酸的ε-氨基結合，以及可變重量組分R1-36(其中這些R基團相當于這里所定義的T2，并且可以經(jīng)由這里所列的任一特定羧酸引入)通過第二個賴氨酸的α-氨基結合。參考圖8步驟A-E．這些步驟與實施例5中的步驟A-E相同。
步驟F．如同實施例5中的步驟B所描述的一樣用哌啶處理樹脂(化合物Ⅵ)以除去FMOC基團。
步驟G．利用實施例5的步驟C所描述的偶聯(lián)方法使脫保護的樹脂(化合物Ⅶ)與Fmoc-Lys(Tfa)-OH偶聯(lián)以給出化合物Ⅷ。
步驟H-K．如同實施例5中的步驟F-J一樣處理樹脂(化合物Ⅷ)以給化合物Ⅺ1-36。
實施例11一系列式R1-36-Lys(ε-INIP)-ANp-5’-AH-ODN的化合物的制備圖9說明一系列36種T-L-X化合物(X=MOI，其中MOI是核酸片段，ODN)的平行合成，該化合物得自實施例5的酯(相同過程可以與其它T-L-X(其中X是活化的酯)化合物一起使用)。經(jīng)由磷酸二酯-亞烷基胺基團，使MOI通過MOI的5’末端結合到T-L上。
參考圖9步驟A．按照在Van Ness等，核酸研究，19,3345(1991)中的改進的生物素?；椒ㄖ苽浠衔铫?-36。在5’-氨基己基寡核苷酸(化合物Ⅺ1-36,1mg)之一的溶液中在200mM硼酸鈉中加入四氟苯酯(得自實施例5的化合物Ⅹ1-36，其在250mL的NMP中為100倍摩爾過量)之一。在環(huán)境溫度下溫育反應一整夜。由Sephadex G-50色譜從化合物Ⅻ1-36中除去未反應的和水解的四氟苯酯。
實施例12一系列式R1-36-Lys(ε-INIP)-ANP-Lys(ε-(MCT-5’-AH-ODN))-NH2的化合物的制備圖10說明一系列36種T-L-X化合物(X=MOI，其中MOI是核酸片段，ODN)的平行合成，該化合物得自實施例9的胺類(相同過程可以與其它T-L-X(其中X是胺)化合物一起使用)。經(jīng)由磷酸二酯-亞烷基胺基團通過MOI的5’末端使MOI與T-L結合。
參考圖10步驟A.如同在Van Ness等，核酸研究，19,3345(1991)中所描述的一樣制備5’-[6-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-氨基)己基]寡核苷酸Ⅻ1-36。
步驟B.在100mM硼酸鈉(pH8.3)中在濃度為1mg/ml的5’-[6-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-氨基)己基]寡核苷酸(化合物Ⅻ1-36)之一的溶液中加入100倍摩爾過量的一級胺(選自R1-36-Lys(e-iNIP)-ANP-Lys(e-NH2)-NH2(實施例11的化合物Ⅹ1-36)。在環(huán)境溫度下混合溶液一整夜。通過3000MW截斷膜(Amicon,Beverly,MA)利用H2O(3X)作為洗滌液由超濾除去未反應的胺。通過還原分離化合物ⅫⅠ1-36至100ml。
施例13由質譜法同時檢測多個標記的示范這一實施例提供了由質譜法同時檢測多個化合物(標記)的能力的描述。在這一具體的例子中，將31種化合物與基質混合，并沉淀和干燥其到固相支持體上，然后用激光使之釋放。然后將所產(chǎn)生的離子引入質譜儀。
以等摩爾基底共同混合下列化合物(購自Aldrich,Milwaukee,WI)從而形成0.002M(對于每種化合物)終濃度的基底苯甲酰胺(121.14)、煙酰胺(122.13)、吡嗪酰胺(123.12)、3-氨基-4-吡唑羧酸(127.10)、2-噻吩羧基酰胺(127.17)、4-氨基苯甲酰胺(135.15)、甲苯甲酰胺(tolumide)(135.17)、6-甲基煙酰胺(136.15)、3-氨基煙酰胺(137.14)、煙酰胺N-氧化物(138.12)、3-氫化吡啶酰胺(138.13)、4-氟苯甲酰胺(139.13)、肉桂酰胺(147.18)、4-甲氧基苯甲酰胺(151.17)、2,6-二氯苯甲酰胺(157.12)、4-氨基-5-咪唑-羧基酰胺(162.58)、3,4-吡啶-二羧基酰胺(165.16)、4-乙氧基苯甲酰胺(165.19)、2,3-吡嗪二羧基酰胺(166.14)、2-硝基苯甲酰胺(166.14)、3-氯-4-甲氧基苯甲酸(170.4)、吲哚-3-乙酰胺(174.2)、5-乙酰水楊酰胺(179.18)、3,5-二甲氧基苯甲酰胺(181.19)、1-萘乙酰胺(185.23)、8-氯-3,5-二氨基-2-吡嗪羧基酰胺(187.59)、4-三氟甲基-苯甲酰胺(189.00)、5-氨基-5-苯基-4-吡唑-羧基酰胺(202.22)、1-甲基-2-芐基-丙酰胺酸酯(207.33)、4-氨基-2,3,5,6-四氟苯甲酰胺(208.11)、2,3-萘二羧酸(212.22)?；衔镆陨鲜鰸舛确胖迷贒MSO中。然后將1μl材料與α-氰-4-羥基肉桂酸基質(在1∶10,000稀釋之后)混合，并存放在固相不銹鋼載體上。
然后利用蛋白質TOF質譜儀(Bruker,Manning Park,MA)由激光釋放所說的物質，并以線型和反射兩種操作方式測量所產(chǎn)生的離子。觀察到下列m/z值(圖11)121.1----＞苯甲酰胺(121.14)122.1----＞煙酰胺(122.13)123.1----＞吡嗪酰胺(123.12)124.1125.2127.3----＞3-氨基-4-吡唑羧酸(127.10)127.2----＞2-噻吩羧基酰胺(127.17)135.1----＞4-氨基苯甲酰胺(135.15)135.1----＞甲苯甲酰胺(135.17)136.2----＞6-甲基煙酰胺(136.15)137.1----＞3-氨基煙酰胺(137.14)138.2----＞煙酰胺N-氧化物(138.12)138.2----＞3-氫化吡啶酰胺(138.13)139.2----＞4-氟苯甲酰胺(139.13)140.2147.3----＞肉桂酰胺(147.18)148.2149.24-甲氧基苯甲酰胺(151.17)152.22,6-二氯苯甲酰胺(157.12)158.3163.3165.2----＞3,4-吡啶-二羧基酰胺(165.16)165.2----＞4-乙氧基苯甲酰胺(165.19)166.2----＞2,3-吡嗪二羧基酰胺(166.14)166.2----＞2-硝基苯甲酰胺(166.14)3-氟-4-甲氧基苯甲酸(170.4)171.1172.2173.4吲哚-3-乙酰胺(174.2)178.3179.3----＞5-乙酰水揚酰胺(179.18)181.2----＞3,5-二甲氧基苯甲酰胺(181.19)182.2----＞1-萘乙酰胺(185.23)186.28-氯-3,5-二氨基-2-吡嗪羧基酰胺188.2189.2----＞4-三氟甲基-苯甲酰胺(189.00)190.2191.2192.35-氨基-5-苯基-4-吡唑-羧基酰胺(202.22)203.2203.41-甲基-2-芐基-丙酰胺酸酯(207.33)4-氨基-2,3,5,6-四氟苯甲酰胺(208.11)212.2----＞2,3-萘二羧酸(212.22)219.3221.2228.2234.2237.4241.4數(shù)據(jù)表明31種化合物的22種出現(xiàn)在具有預計的質量的光譜中，31種化合物的9種出現(xiàn)在具有在預計的質量范圍之內的n+H質量(一個原子質量單位，amu)的光譜中。后一種現(xiàn)象可能是由于化合物中的胺的質子化作用所致。因此31種化合物的31種都可由MALDI質譜法檢測。更重要的是，例子顯示用光譜方法能夠同時檢測多個標記。
α-氰基基質單獨地(圖11)在146.2、164.1、172.1、173.1、189.1、190.1、191.1、192.1、212.1、224.1、228.0、234.3給出峰值。其它所鑒定的質量是由于在所購買的化合物中的污染(因為沒有努力以進一步純化化合物)所致。
實施例14利用多個探針的基因表述的分析由硼酸和氫氧化鈉新制備硼酸鈉緩沖液(SBB)。APB緩沖液是0.18M NaCl、0.05M Tris(pH7.6)、5mM EDTA以及0.5％Tween 20R。TMNZ緩沖液是0.05M Tris(pH9.5)、1mM MgCl2、0.5mM ZnCl2。FW(洗濾)是0.09M NaCl、50mM Tris(pH7.6)、25mM EDTA。SDS/FW是具有0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的FW。溶解和雜交溶液是3M硫氰酸胍、2％N-十二烷酰肌氨酸(sarcosyl)、50mM Tris(pH7.6)和25mM EDTA。CAP緩沖液是0.1M檸檬酸鈉和0.2M磷酸鈉(pH6.5)。HRP(辣根過氧化物酶)底物溶液是0.1M檸檬酸鈉(pH6.5)、0.2M磷酸鈉、2.87mM 4-甲氧基-1-萘酚、0.093mM 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽和4mM過氧化氫。AP(堿性磷酸酶)底物溶液是1mM 5-溴代-4-氯吲哚基(chlorindoyl)-3-磷酸酯、1mM氮藍四唑和在TMNZ中的0.01％Tween20。堿性磷酸酶的熒光底物是0.5mM 4-甲基-傘形酮磷酸酯、0.05M Tris(pH9.5)、1mM MgCl2、0.5mM ZnCl2。聚(乙烯亞胺)購自Polysciences(Warington,PA)。拋光的或者未拋光的尼龍小珠購自The Hoover Group(Sault St.Marie,MI)。三乙基水合氫根四氟硼酸鹽、琥珀酸酐和1-甲基-2-吡咯烷酮購自Aldrich Chemical(Milwaukee,WI)。Tween 20R和NHS-LC-生物素購自Pierce(Rockford,IL)。硫氰酸胍(GuSCN)購自Kodak(Rochester，紐約)。氰尿酰氯得自Aldrich化學公司(Milwaukee,WI)，并且從甲苯中再結晶。A．ODN合成利用標準的氰乙基-N,N-二異丙氨基-亞磷酰胺(CED-亞磷酰胺)化學法，在或者ABI 380B或者MilliGen 7500自動DNA合成儀上合成互補(5’-CCTTAGGACAGTCTTCTTCACGC)于保守的或者高變的區(qū)域(牙齦卟啉單胞菌(Pg)的16S核糖體RNA(rRNA)的區(qū)域)的ODN。利用市售的N-單甲氧基三苯甲氨基己基-6-氧-CED-亞磷酰胺將胺尾摻入至5’-末端上。利用Hamilton PRP-1(7.0×305mm)反相柱，使用5％至45％CH3CN的梯度，在0.1M Et3NH+OAc-、pH7.5下，由HPLC色譜分析具有5’-單甲氧基三苯甲基的ODN，該過程歷時20多分鐘。在用80％乙酸脫三苯甲基之后，通過加入3M乙酸鈉和1-丁醇沉淀ODN。通過利用Toso-Haas DEAE-NPR柱的離子交換HPLC和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)完成ODN質量分析校核。B．涂布聚合物的尼龍小珠的制備在環(huán)境溫度下，振蕩在無水1-甲基-2-吡咯烷酮(1800mL)中的未拋光的尼龍小珠(25,000,3/32英寸直徑)5分鐘。加入三乙基水合氫根四氟硼酸鹽(200mL,1M，在二氨甲烷中)，然后在環(huán)境溫度下振蕩30分鐘。傾析液體，同時用1-甲基-2-吡咯烷酮(4×500mL)快速洗滌小珠。然后在3％(w/v)70,000MW聚(乙烯亞胺)溶液(1L)(在1-甲基-2-吡咯烷酮(由30％聚(乙烯亞胺)的水溶液制備)中)中振蕩小珠12-24小時。在傾析聚(乙烯亞胺)溶液之后，用1-甲基-2-吡咯烷酮(2×1L)、SDS/FW(2×1L)、H2O(10×2L)以及最后用95％乙醇(1×500mL)洗滌小珠。在高真空下干燥小珠4至5小時。通過與苦基磺酸反應測定小珠的胺含量。C．5’-[6-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基-己基]-ODN的制備在5’-氨基己基ODN溶液(1mL,10mg/mL)(在新制備的0.1M SBB(pH8.3,3.2mL)和H2O(1.8mL)中)中加入再結晶的氰尿酰氯的乙腈溶液(1mL,50mg/mL)。在環(huán)境溫度下混合該溶液30-120分鐘。利用新制備的0.1M SBB n(pH9.3,4×10mL)作為洗滌液，通過3000MW截斷膜(Amicon,Beverly,MA)，由超濾除去未反應的氰尿酰氯。在最后的洗滌之后，上述溶液體積減少至1mL。在4℃下使5’-[6-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-氨基)己基]-ODN在0.1M SBB(pH 8.3)中穩(wěn)定(沒有可檢測的分解)1周。D．尼龍小珠向ODNS的連接將涂布PEI的尼龍小珠(500粒小珠)(如以上描述)放置在等體積的新制備的0.1M SBB(pH9.3)中，并將其劇烈振蕩30分鐘以再水化小珠。傾析硼酸鹽溶液，同時用0.1M SBB(pH8.3)洗滌小珠一次，然后用等量的新鮮的0.1M SBB vocered小珠。然后將5’-[6-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-氨基)己基]-ODN的硼酸鹽溶液(1mL,500mg/mL)加入至小珠。在環(huán)境溫度下劇烈振蕩混合物60分鐘。傾析溶液，然后用0.1M SBB(pH8.3，2×500mL)洗滌小珠。用1-甲基-2-吡咯烷酮1.0M SBB(pH 8.3)為9∶1的琥珀酸酐(10mg/mL)在三倍該體積的小珠中處理上述洗滌過的小珠。在環(huán)境溫度下振蕩反應混合物1小時。然后用1-甲基-2-吡咯烷酮(3×250mL)、dH2O(2×1L)、SDS/FW(5×250mL)洗滌小珠，以及然后用dH2O(4×1L)洗滌小珠。小珠存儲在25mM EDTA中。E．設計和標記探針就實施例5來說，設計探針，其使得可以在受激的Jurkat人T-細胞淋巴瘤(JRT3.5)(相對于未受激的Jurkat人T-細胞淋巴瘤)中進行不同的mRNA表達。
在25℃下，使100μg的每種以上所描述的5’-末端胺-連接的寡核苷酸與過量的再結晶氰尿酰氯在10％正甲基-吡咯烷酮堿性(pH8.3至8.5優(yōu)選地)緩沖液中反應30至120分鐘。最后的反應條件由0.15M硼酸鈉(pH8.3)、2mg/ml再結晶氰尿酰氯和500μg/ml的各自的寡核苷酸組成。在G-50 Sephadex柱上由大小排阻色譜法除去未反應的氰尿酰氯。然后使活化的純化的寡核苷酸在0.15M硼酸鈉(pH8.3)中與100摩爾過量的胱胺在室溫下反應1小時。在G-50 Sephadex柱上由大小排阻色譜法除去未反應的胱胺。然后使衍生的ODN與胺活性的熒光染料進行反應。將衍生的ODN制劑分成3部分，并使每一部分與(a)20倍摩爾過量的得克薩斯紅磺酰氯(分子探針，Eugene,OR)、與(b)20倍摩爾過量的麗絲胺磺酰氯(分子探針，Eugene,OR)、(c)20倍摩爾過量的熒光素異硫氰酸鹽之任一進行反應。最后的反應條件由0.15M硼酸鈉(pH8.3)、1小時、室溫組成。由大小排阻色譜法在G-50葡聚糖凝膠柱上除去未反應的熒光染料。用得克薩斯紅標記IL-2、IFN-G、GM-CSF。用麗絲胺標記c-fos、IL-4和PKC-g，并用熒光素標記CTLA4/CD28和GMP激酶。收集IL-2、c-fos和CTLA4探針。收集IFN-g、IL-4和GMP激酶探針，并收集GM-CSF和PKC-g探針。F．用于基因表達分析的固相載體cDNA合成寡DMO596 5′ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′間隔AscⅠ(聚dT)20G．刺激和RNA制備當存在10ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻-13乙酸鹽(Calbiochem,SanDiego,CA)和100ng/ml離子霉素時，在1×10-6細胞/ml的細胞密度下在無血清培養(yǎng)基(生命技術，Gaithersburg,MD)中刺激Jurkat系JRT3.56小時。
(Calbiochem)。將細胞離心沉淀，并用1×PBS(生命技術)洗滌所得的沉淀，再次離心沉淀，并將所得的沉淀以每10-6細胞溶解在0.5ml緩沖液(包含4M胍異硫氰酸鹽/1％N-月桂基肌氨酸/25mM檸檬酸鈉pH7.1(Fisher Scientific,Pittsburg,PA))中。加入十分之一體積的2M pH 4.2乙酸鈉(Fisher Scientific)，其后加入一體積水飽和的苯酚(Amresco.Solon,OH)。在混合之后，加入四分之一體積的三氯甲烷∶異戊醇(29∶1)(FisherScientific)同時劇烈混合溶液，然后在冰上培養(yǎng)10分鐘。然后離心裂解物，用等量的三氯甲烷∶異戊醇除去和提取水相。然后收集水相，并用2體積的EtOH(Quantum Chemical Corp.,Tuscola,IL)沉淀RNA。在離心之后，傾析EtOH，并簡短風干RNA，然后按照1和5mg/ml之間的濃度使RNA懸浮在無RNase的水中。H．捕捉和第一鏈合成一種攜帶以共價鍵連接的寡核苷酸，5’-ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′的尼龍小珠(GenSet,La Jolla,CA)加至10μg總細胞RNA中，并在無菌的1.5ml微型離心管(Fisher Scientific)中用足以覆蓋小珠的無RNase水稀釋。在65℃下培養(yǎng)RNA和小珠5分鐘。將等量的2X mRNA雜交緩沖液(由50mM Tris(pH7.5)、1M NaCl(Fisher Scientific)和20μg/ml乙?；腂SA(新英格蘭生物實驗室，Beverly,MA)組成)加入至每支管中，并在室溫下和緩地搖動管2小時。除去上清液，然后在1X mRNA雜交緩沖液中洗滌小珠三次。在最后的洗滌完成之后，將逆轉錄混合物(由1X MMLV-逆轉錄酶緩沖液、1mM dNTP混合物、2mM DTT(生命技術)、20單位Rnasin(Promega.Madison,WI)和10μg/ml乙?；腂S(新英格蘭生物實驗室)組成)加入至每支管中，其后加入600單位MMLV-逆轉錄酶(生命技術)。在42℃下和緩地搖動這一反應2小時。然后加入1單位Rnase H(Boehringer-Mannheim.Indianapolis,IN)，使反應再繼續(xù)0.5小時。再一次除去上清液，并在10mM Tris(pH8.0)、1mM EDTA(pH 8)(FisherScientific)中洗滌每一小珠三次。通過在具有0.01％SDS(Fisher Scientific)的TE中煮沸小珠除去余下的RNA模板。
然后使尼龍固相支持體與每毫升100納克的下列的標記的寡核苷酸探針雜交(5’-GAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTG-3’,IL-2,5’-CAGTGCAGAGGCTCGCGAGCTATA-3’,IFN-γ5’-CTTGACCATGATGGCCAGCCACTA-3’,GM-CSF5’-CATTCCCACGGTCACTGCCATCTC-3’,c-fos5’-GCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC-3’,IL-45’-GTGGTTCATCGACGATGCCACGAA-3’,PKC-γ5’-GAGCTCATGTACCCACCTCCGTAC-3’,CTLA4/CD285-ATCTTCGTGCAGCCGCCCTCACTG-3’,GMP激酶)(除基于牛的序列的GMP激酶外，所有寡核苷酸都是人的同系物)。雜交在3M GuSCN中在37℃下進行8小時。在雜交期間和緩地混合反應混合物以便促進探針向固相支持體的擴散。在8小時培養(yǎng)時間之后，固相支持體用3M GuSCN洗滌兩次，用0.1X SSC洗滌5次，然后放置在0.01M二硫蘇糖醇中以便從寡核苷酸上切割熒光染料。在室溫下培養(yǎng)混合物15分鐘。在黑色的微量滴定板(Dynatek實驗室，Chantilly,VA)上測量熒光。然后利用495nm的激發(fā)波長和監(jiān)測在熒光素的520nm的發(fā)射，利用591nm的激發(fā)波長和監(jiān)測在得克薩斯紅的612nm的發(fā)射，利用570nm的激發(fā)波長和監(jiān)測在麗絲胺的590nm的發(fā)射，用FluoroskanⅡ熒光計(Flow實驗室，McLean,VA)直接閱讀平板。探測的結果如下不受激的受激的IL-2 1.2rfu230rfuIFN 0.8rfu120rfuGM-CSF 21rfu 38rfuc-fos16rfu 76rfuIL-4 33rfu 12rfuPKC 10rfu 130rfuCTLA-4 NDNDGMP激酶 450rfu420rfu實施例15在固相上的單堿基對錯配序列的檢測這一實施例描述了在固定化的探針中的單堿基對錯配序列的檢測，該檢測利用互補的熒光標記的寡核苷酸。寡核苷酸系列由一種形成完全的堿基配對的探針和一種雜交時包含錯配序列的寡核苷酸組成。用不同的熒光染料標記這兩種寡核苷酸，在使雜交在錯配序列的Tm下發(fā)生之后，測定雜交的熒光染料的比率。
在一系列固相支持體上固定“靶”寡核苷酸(DMO501:5′-TTGATTCCCAATTATGCGAAGGAG-3′)。如同以前描述(Van Ness等，核酸研究，19:3345,1991)的一樣制備ODN小珠(3/32nd英寸直徑)。ODN小珠包含0.01至1.2mg/小珠的以共價鍵固定化的ODN。DMO578是DMO501(完全的補體)的補體。DMO1969是在位置11具有G---＞T變化的DMO501的補體。DMO1971是在位置12具有A---＞T變化的DMO501的補體。用BIODIPY、TAMRA或者得克薩斯紅標記每一探針寡核苷酸。雜交反應在3M GuSCN、0.01M Tris(pH7.6)、5mMEDTA中裝配，探針量為50ng/ml的各自的探針。在每支管存在3種固相支持體時，將等摩爾比率的每一探針類型用于每一雜交中。在42℃下以勻速攪拌進行30分鐘的雜交。小珠在42℃下用3M GuSCN洗滌兩次，然后用SDS/FW洗滌5次。
為使探針寡核苷酸變性，將固相支持體放置在20μl TE(TE是0.01MTris、pH7.0、5mM EDTA)中。在100℃下培養(yǎng)混合物10分鐘。在黑色的微量滴定板中測量熒光。從培養(yǎng)管(200微升)中除去溶液，并將該溶液放置在黑色的微量滴定板(Dynatek Laboratories,Chantilly,VA)中。然后利用495nm的激發(fā)波長和監(jiān)測在熒光素的520nm的發(fā)射，利用591nm的激發(fā)波長和監(jiān)測在得克薩斯紅的612nm的發(fā)射，利用570nm的激發(fā)波長和監(jiān)測在麗絲胺或者TAMRA的590nm的發(fā)射，用FluoroskanⅡ熒光計(Flow Laboratories,McLean,VA)直接閱讀平板。探測的結果如下表10
結果表明對雜交沒有任何熒光染料的效應，如第1行所表明的，得克薩斯紅(TR)578寡核苷酸和578-BD(BIODIPY)平等地競爭與固定化的靶的雜交，這是由于在雜交之后標記的比率并沒有變化。在允許進行堿基對錯配序列的某些檢測的GuSCN中，完全堿基配對的探針富集超過錯配探針平均20倍。
從前述中可明顯地看出雖然在這里為說明的目的描述了本發(fā)明的具體實施方案，但是可以進行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神與范圍。因此，除例如附加的權利要求書而外，本發(fā)明是不受限制的。
權利要求
1．一種用于檢測配體對的第一成員與第二成員的結合的方法，該方法包括(a)在足以使第一成員與第二成員結合的條件和時間下，把一系列第一標記的成員與可能包含一個或多個第二成員的生物樣品組合在一起，其中所說的標記與特定的第一成員相關且可由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測；(b)將未結合的成員與結合的第一和第二成員分離；(c)從所說的標記的第一成員切割標記；以及(d)由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測標記，并由此檢測第一成員和第二成員的結合。
2．按照權利要求1的方法，其中所說的第一成員是與固相支持體結合的。
3．按照權利要求2的方法，該方法還包括在分離結合的第一和第二成員的步驟之后從所說的固相支持體上洗滌未結合的成員。
4．按照權利要求1的方法，其中標記的檢測是由質譜法、紅外光譜法、紫外光譜法或者恒電位電流分析法進行的。
5．按照權利要求1的方法，其中組合4個以上的標記的第一成員，并且其中每一標記對于選擇的核酸片段是唯一的。
6．按照權利要求1的方法，其中所說的結合的第一和第二成員由一種選自由凝膠電泳、毛細管電泳、微通道電泳、HPLC、大小排阻色譜法以及過濾組成的組中的方法與未結合的成員分離。
7．按照權利要求1的方法，其中所說的標記的第一成員由一種選自由氧化、還原、酸不穩(wěn)定、堿不穩(wěn)定、酶促、電化、熱和光不穩(wěn)定方法組成的組中的方法切割。
8．按照權利要求4的方法，其中所說的標記由飛行時間質譜法、四極質譜法、磁扇形掃描質譜法以及電扇形掃描質譜法檢測。
9．按照權利要求4的方法，其中所說的標記利用選自由庫侖檢測器和電流檢測器組成的組中的檢測器經(jīng)恒電位電流分析法檢測。
10．按照權利要求1的方法，其中b、c和d步驟是以連續(xù)方式完成的。
11．按照權利要求1的方法，其中b、c和d步驟是在單一裝置上以連續(xù)方式完成的。
12．按照權利要求1的方法，其中b、c和d步驟是自動進行的。
13．按照權利要求1的方法，其中所說的第一成員是核酸分子。
14．按照權利要求1的方法，其中所說的第二成員是核酸分子。
15．按照權利要求13或者14的方法，其中所說的核酸分子由引物延伸產(chǎn)生。
16．按照權利要求13或者14的方法，其中所說的核酸分子由非-3’-標記的寡核苷酸引物產(chǎn)生。
17．按照權利要求13或者14的方法，其中所說的核酸分子從標記的雙脫氧核苷酸終止子產(chǎn)生。
18．按照權利要求13或者14的方法，其中所說的第一成員是蛋白質、激素或者有機分子。
19．按照權利要求18的方法，其中所說的蛋白質選自由抗體和受體組成的組。
20．一種用于分析選擇的生物樣品的基因表達模式的方法，該方法包括(a)從生物樣品中暴露核酸；(b)在足以使所說的探針雜交到上述核酸上的條件和時間下，把所說的暴露的核酸與一個或多個選擇的標記的核酸探針組合在一起，其中所說的標記與特定的核酸探針相關且可由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測；(c)把雜交的探針與未雜交的探針分離；(d)從所說的標記的片段切割標記；以及(e)由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測標記，并由此測定生物樣品的基因表達模式。
21．按照權利要求20的方法，其中所說的生物樣品選自由哺乳動物細胞、細菌和酵母組成的組。
22．按照權利要求21的方法，其中所說的哺乳動物細胞包括病毒。
23．按照權利要求20的方法，其中所說的暴露的核酸結合到固相支持體上。
24．按照權利要求23的方法，其中所說的固相支持體是聚合物。
25．按照權利要求23的方法，該方法還包括在分離步驟之后洗滌固相支持體。
26．按照權利要求20的方法，其中所說的雜交探針由一種選自由凝膠電泳、毛細管電泳、微通道電泳、HPLC、過濾和聚丙烯酰胺凝膠電泳組成的組中的方法與未雜交的探針分離。
27．按照權利要求20的方法，其中所說的標記的探針由一種選自由氧化、還原、酸不穩(wěn)定、堿不穩(wěn)定、酶促、電化、熱和光不穩(wěn)定方法組成的組中的方法切割。
28．按照權利要求20的方法，其中所說的標記由一種選自由飛行時間質譜、四極質譜法、磁扇形掃描質譜法和電扇形掃描質譜法組成的組中的方法檢測。
29．按照權利要求20的方法，其中所說的標記利用選自由庫侖檢測器和電流檢測器組成的組中的檢測器經(jīng)恒電位電流分析法檢測。
30．按照權利要求20的方法，其中步驟c、d和e是以連續(xù)方式完成的。
31．按照權利要求20的方法，其中步驟c、d和e是在單一裝置上以連續(xù)方式完成的。
32．按照權利要求31的方法，其中所說的裝置是自動的。
33．一種式Tms-L-X的化合物，其中，Tms是一個可由質譜法檢測的有機基團，該基團包含碳原子、至少一個氫和氟原子以及可有可無的選自氧、氮、硫、磷和碘的原子；L是一個有機基團，該基團使得包含Tms的部分可以與化合物的剩余部分切割開來，其中包含Tms的部分包含一個官能團，當對化合物進行質譜分析時該官能團支持單一的離子化電荷狀態(tài)，并且該官能團選自叔胺、季胺以及有機酸；X是不同于核酸片段的MOI片段，并且該化合物具有至少250道爾頓的質量。
34．按照權利要求33的化合物，其中Tms具有15至10,000道爾頓的質量，且其分子式為C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ，其中α、β和δ的總數(shù)足以滿足C、N和O原子所沒有滿足的價。
35．按照權利要求33的化合物，其中Tms和L通過選自酰胺、酯、醚、胺、硫化物、硫酯、二硫化物、硫醚、脲、硫脲、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸鹽、席夫堿、還原的席夫堿、亞胺、肟、腙、磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、磺酸酯、氨磺?；蛘咛?碳鍵的官能團結合在一起。
36．按照權利要求35的化合物，其中所說的官能團選自酰胺、酯、胺、脲以及氨基甲酸酯。
37．按照權利要求35的化合物，其中L選自LhU、Lacid、Lbase、L[O]、L[R]、Lenz、Lelc、LΔ和LSS，其中光化輻射、酸、堿、氧化、還原、酶、電化學、熱和巰基交換分別使包含Tms的部分與分子的剩余部分切割開來。
38．按照權利要求37的化合物，其中LhU具有式L1-L2-L3，其中L2是一個吸收光化輻射從而促進Tms從X上切割的分子碎片，L1和L3分別是一個直接鍵或者有機部分，其中L1把L2與Tms分離而L3把L2與X分離，并且當L2吸收光化輻射時既非L1也非L3遭受鍵裂。
39．按照權利要求38的化合物，其中-L2-L3具有式
在a、b、c、d或e位置有一個碳原子為-L3-X所取代，b、c、d或者e位的一個或多個基團可以也可以不為烷基、烷氧基、氟原子、氯原子、羥基、羧基或者酰胺基所取代；R1是氫或者烴基。
40．按照權利要求39的化合物，其中X是-CO-R2,R2是-OH或者一個保護或激活羧酸與另一部分偶聯(lián)的基團。
41．按照權利要求38的化合物，其中L3選自直接鍵、亞烴基、-O-亞烴基以及亞烴基-(O-亞烴基)n-H，并且n是1至10之間的整數(shù)。
42．按照權利要求33的化合物，其中-L-X具有式
其中b、c、d或e位的一個或多個為氫、烷基、烷氧基、氟原子、氯原子、羥基、羧基或者酰胺基所取代；R1是氫或者烴基。
43．按照權利要求33的化合物，其中Tms具有式T2-(J-T3-)n-T2是一個由碳和一個或多個氫、氟、碘、氧、氮、硫以及磷形成的有機部分，并具有15至500道爾頓的質量；T3是一個由碳和一個或多個氫、氟、碘、氧、氮、硫以及磷形成的有機部分，并具有50至1000道爾頓的質量；J是一個直接鍵或者一個選自酰胺、酯、胺、硫化物、醚、硫酯、二硫化物、硫醚、脲、硫脲、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸鹽、席夫堿、還原的席夫堿、亞胺、肟、腙、磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、磺酸酯、氨磺酰或者碳-碳鍵的官能團；同時n是1至50之間的整數(shù)，并且當n大于1時，T3和J各自是分別選擇的。
44．按照權利要求43的化合物，其中T選自烴基、烴基-O-亞烴基、烴基-S-亞烴基、烴基-NH-亞烴基、烴基-酰胺-亞烴基、N-(烴基)亞烴基、N,N-二(烴基)亞烴基、烴基酰基-亞烴基、雜環(huán)烴基(其中雜原子選自氧、氮、硫和磷)、取代的雜環(huán)烴基(其中雜原子選自氧、氮、硫和磷，取代基選自烴基、烴基-O-亞烴基、烴基-NH-亞烴基、烴基-S-亞烴基、N-(烴基)亞烴基、N,N-二(烴基)亞烴基和烴基酰基-亞烴基)以及前述之任一的衍生物(其中一個或多個氫為等量的氟原子所取代)。
45．按照權利要求43的化合物，其中T3具有式-G(R2)-，G是具有單一R2取代基的C1-6亞烷基，R2選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基稠合的環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、芳烷基、芳基取代的烯基或者炔基、環(huán)烷基取代的烷基、環(huán)烯基取代的環(huán)烷基、聯(lián)芳基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、芳基取代的烯氧基或者炔氧基、烷氨基、烯氨基或者炔氨基、芳基取代的烷氨基、芳基取代的烯氨基或者炔氨基、芳氧基、芳氨基、N-烷基脲取代的烷基、N-芳基脲取代的烷基、烷基碳酰氨基取代的烷基、氨基碳酰取代的烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基取代的烷基、雜環(huán)基取代的氨基、羧烷基取代的芳烷基、氧代碳環(huán)稠合的芳基和雜環(huán)烷基；環(huán)烯基、芳基取代的烷基和芳烷基、羥基取代的烷基、烷氧基取代的烷基、芳烷氧基取代的烷基、烷氧基取代的烷基、芳烷氧基取代的烷基、氨基取代的烷基、(芳基取代的烷氧碳酰氨基)取代的烷基、巰基取代的烷基、烷基磺酰取代的烷基、(羥基取代的烷基硫代)取代的烷基、硫代烷氧基取代的烷基、烴基酰氨基取代的烷基、雜環(huán)酰氨基取代的烷基、烴基取代的雜環(huán)酰氨基取代的烷基、烷基磺酰氨基取代的烷基、芳基磺酰氨基取代的烷基、嗎啉烷基、硫代嗎啉烷基、嗎啉羰基取代的烷基、硫代嗎啉羰基取代的烷基、[N-(烷基、烯基或者炔基)-或者N,N-[二烷基、二烯基、二炔基或者(烷基、烯基)-氨基]羰基取代的烷基、雜環(huán)氨基碳酰、雜環(huán)亞烷氨基碳酰、雜環(huán)氨基碳酰取代的烷基、雜環(huán)亞烷氨基碳酰取代的烷基、N,N-[二烷基]亞烷氨基碳酰、N,N-[二烷基]亞烷氨基碳酰取代的烷基、烷基取代的雜環(huán)羰基、烷基取代的雜環(huán)羰基-烷基、羧基取代的烷基、二烷氨基取代的酰氨基烷基和氨基酸側鏈(選自精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、S-甲基半胱氨酸、甲硫氨酸以及其相應的亞砜和砜衍生物、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、別異亮氨酸、叔亮氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、組氨酸、谷酰胺、纈氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天門冬氨酸、β氰丙氨酸和別蘇氨酸)；alynyl和雜環(huán)羰基、氨基碳酰、酰氨基、單或者二烷氨基碳酰、單或者二芳氨基碳酰、烷芳氨基碳酰、二芳氨基碳酰、單或者二酰氨基碳酰、芳香族或者脂肪族?；⒖梢砸部梢圆挥蛇x自氨基、羧基、羥基、巰基、單或者二烷氨基、單或者二芳氨基、烷芳氨基、二芳氨基、單或者二酰氨基、烷氧基、烯氧基、芳氧基、硫代烷氧基、硫代烯氧基、硫代炔氧基、硫代芳氧基和雜環(huán)的取代基取代的烷基。
46．按照權利要求33的化合物，該化合物具有式
其中，G是(CH2)1-6，其中在一個而且僅有的一個CH2基團上的氫為-(CH2)c-酰胺-T4所取代；T2和T4是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機部分，其中α和β的總數(shù)足以滿足C、N和O原子所沒有滿足的價；酰胺是-N(R1)-CO或-CO-N(R1)-；R1是氫或者C1-10烷基；c是0至4之間的整數(shù)；X是按照權利要求1定義的；以及n是1至50之間的整數(shù)，這樣當n大于1時，G、c、酰胺、R1和T4是分別選擇的。
47．按照權利要求33的化合物，該化合物具有式
其中T5是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機部分，其中α和β的總數(shù)足以滿足C、N以及O原子所沒有滿足的價；T5包括叔或者季銨或者有機酸；m是0-49之間的整數(shù)。
48．按照權利要求33的化合物，該化合物具有式
其中T5是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機部分，其中α和β的總數(shù)足以滿足C、N以及O原子所沒有滿足的價；T5包括叔或者季銨或者有機酸；m是0-49之間的整數(shù)。
49．按照權利要求47和48之任一的化合物，其中-酰胺-T5選自
(127下)
50．按照權利要求47和48之任一的化合物，其中-酰胺-T5選自
(128)
51．按照權利要求43的化合物，其中T2具有當下列有機酸之一與胺基團縮合時導致T2C(=(O)-NR)-形成的結構甲酸、乙酸、丙炔酸、丙酸、氟乙酸、2-丁炔酸、環(huán)丙烷羧酸、丁酸、甲氧基乙酸、二氟乙酸、4-戊炔酸、環(huán)丁烷羧酸、3,3-甲基丙烯酸、戊酸、N,N-二甲基甘氨酸、N-甲?；?甘氨酸-OH、乙氧基乙酸、(甲硫基)乙酸、吡咯-2-羧酸、3-呋喃甲酸、異噁唑-5-羧酸、反-3-己烯酸、三氟乙酸、己酸、Ac-甘氨酸-OH、2-羥基-2-甲基丁酸、苯甲酸、煙酸、2-吡嗪羧酸、1-甲基-2-吡咯羧酸、2-環(huán)戊烯-1-乙酸、環(huán)戊基乙酸、(S)-(-)-2-吡咯烷酮-5-羧酸、N-甲基-L-脯氨酸、庚酸、Ac-B-丙氨酸-OH、2-乙基-2-羥基丁酸、2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸、對甲苯甲酸、6-甲基煙酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、2,5-二甲基吡咯-3-羧酸、4-氟苯甲酸、3,5-二甲基異噁唑-4-羧酸、3-環(huán)戊基丙酸、辛酸、N,N-二甲基琥珀酰胺酸、苯丙炔酸、肉桂酸、4-乙基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸、1,2,5-三甲基吡咯-3-羧酸、3-氟-4-甲基苯甲酸、Ac-DL-炔丙基甘氨酸、3-(三氟甲基)丁酸、1-哌啶丙酸、N-乙酰脯氨酸、3,5-二氟苯甲酸、Ac-L-纈氨酸-OH、吲哚-2-羧酸、2-苯并呋喃羧酸、苯并三唑-5-羧酸、4-正丙基苯甲酸、3-二甲氨基苯甲酸、4-乙氧基苯甲酸、4-(甲硫基)苯甲酸、N-(2-糠酰)甘氨酸、2-(甲硫基)煙酸、3-氟-4-甲氧基苯甲酸、Tfa-甘氨酸-OH、2-萘甲酸(Naptboic acid)、喹哪啶酸、Ac-L-異亮氨酸-OH、3-甲基茚-2-羧酸、2-喹喔啉羧酸、1-甲基吲哚-2-羧酸、2,3,6-三氟苯甲酸、N-甲酰基-L-蛋氨酸-OH、2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸、4-正丁基苯甲酸、N-苯甲酰甘氨酸、5-氟代吲哚-2-羧酸、4-正丙氧基苯甲酸、4-乙?；?3,5-二甲基-2-吡咯羧酸、3,5-二甲氧基苯甲酸、2,6-二甲氧基煙酸、環(huán)己烷戊酸、2-萘乙酸、4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸、吲哚-3-丙酸、間三氟甲基苯甲酸、5-甲氧基吲哚-2-羧酸、4-戊基苯甲酸、Bz-b-丙氨酸-OH、4-二乙氨基苯甲酸、4-正丁氧基苯甲酸、3-甲基-5-CF3-異噁唑-4-羧酸、3,4-二甲氧苯基乙酸、4-聯(lián)苯羧酸、新戊酰-脯氨酸-OH、辛?；?甘氨酸-OH、(2-萘氧基)乙酸、吲哚-3-丁酸、4-(三氟甲基)苯乙酸、5-甲氧基吲哚-3-乙酸、4-(三氟甲氧基)苯甲酸。Ac-L-苯丙氨酸-OH、4-戊氧基苯甲酸、Z-甘氨酸-OH、4-羧基-N-(呋喃-2-甲基)吡咯烷-2-酮、3,4-二乙氧基苯甲酸、2,4-二甲基-5-CO2Et-吡咯-3-羧酸、N-(2-氟苯)琥珀酰胺酸、3,4,5-三甲氧基苯甲酸、N-苯氨茴酸、3-苯氧基苯甲酸、壬酰-甘氨酸-OH、2-苯氧基吡啶-3-羧酸、2,5-二甲基-1-苯基吡咯-3-羧酸、反-4-(三氟甲基)肉桂酸、(5-甲基-2-苯基噁唑-4-基)乙酸、4-(2-環(huán)己烯氧基)苯甲酸、5-甲氧基-2-甲基吲哚-3-乙酸、反-4-可替寧羧酸、Bz-5-氨基戊酸、4-己氧基苯甲酸、N-(3-甲氧苯基)琥珀酰胺酸、Z-Sar-OH、4-(3,4-二甲氧苯基)丁酸、Ac-o-氟代-DL-苯丙氨酸-OH、N-(4-氟苯)戊酰胺酸、4’-乙基-4-聯(lián)苯羧酸、1,2,3,4-四氫化吖啶羧酸、3-苯氧基苯乙酸、N-(2,4-二氟苯基)琥珀酰胺酸、N-癸?；?甘氨酸-OH、(+)-6-甲氧基-a-甲基-2-萘乙酸、3-(三氟甲氧基)肉桂酸、N-甲?；鵇L-Trp-OH、(R)-(+)-a-甲氧基-a-(三氟甲基)苯乙酸、Bz-DL-亮氨酸-OH、4-(三氟甲氧基)苯氧基乙酸、4-庚氧基苯甲酸、2,3,4-三甲氧基肉桂酸、2,6-二甲氧苯甲酰-甘氨酸-OH、3-(3,4,5-三甲氧苯基)丙酸、2,3,4,5,6-五氟苯氧基乙酸、N-(2,4-二氟苯基)戊酰胺酸、N-十一酰-甘氨酸-OH、2-(4-氟代苯甲?；?苯甲酸、5-三氟甲氧基吲哚-2-羧酸、N-(2,4-二氟苯基)二甘醇酰胺酸、Ac-L-Trp-OH、Tfa-L-苯基甘氨酸-OH、3-碘代苯甲酸、3-(4-正戊基苯甲酰)丙酸、2-苯基-4-喹啉羧酸、4-辛氧基苯甲酸、Bz-L-蛋氨酸-OH、3,4,5-三乙氧基苯甲酸、N-月桂酰-甘氨酸-OH、3,5-雙(三氟甲基)苯甲酸、Ac-5-甲基-DL-Trp-OH、2-碘代苯乙酸、3-碘代-4-甲基苯甲酸、3-(4-正己基苯甲酰)丙酸、N-己酰-L-苯丙氨酸-OH、4-壬氧基苯甲酸、4’-(三氟甲基)-2-聯(lián)苯羧酸、Bz-L-苯丙氨酸-OH、N-十三酰-甘氨酸-OH、3,5-雙(三氟甲基)苯乙酸、3-(4-正庚基苯甲酰)丙酸、N-庚酰(Hepytanoyl)-L-苯丙氨酸-OH、4-癸氧基苯甲酸、N-(α,α,α-三氟間甲苯基)鄰氨基苯甲酸、尼氟滅酸、4-(2-羥基六氟異丙基)苯甲酸、N-豆蔻酰-甘氨酸-OH、3-(4-正辛基苯甲酰)丙酸、N-辛酰-L-苯丙氨酸-OH、4-十一烷氧基苯甲酸、3-(3,4,5-三甲氧苯基)丙酰-甘氨酸-OH、8-碘代萘甲酸、N-十五酰-甘氨酸-OH、4-十二烷氧基苯甲酸、N-棕櫚酰-甘氨酸-OH以及N-硬脂酰-甘氨酸-OH。
52．按照權利要求33的化合物，其中MOI選自蛋白質、肽、寡糖、抗體、抗原、藥物和合成的有機分子。
53．一種組合物，該組合物包含一對下式的化合物Tms-L-MOI其中，Tms是一個可由質譜法檢測的有機基團，該基團包含碳原子、至少一個氫和氟原子以及可有可無的選自氧、氮、硫、磷和碘的原子；L是一個使得包含Tms的部分可以與化合物的剩余部分切割開來的有機基團，其中包含Tms的部分包含一個官能團，當對化合物進行質譜分析時該官能團支持單一的離子化電荷狀態(tài)，并且該官能團選自叔胺、季銨以及有機酸；MOI是一個核酸片段，其中L在除MOI的3’末端之外的其他位置與MOI綴合；以及該對化合物具有不相同的Tms基團，并且除在一個堿基位置的堿基不相同外，具有相同的序列。
54．一種組合物，該組合物包含一對下式的化合物Tms-L-MOI其中，Tms是一個可由質譜法檢測的有機基團，該基團包含碳原子、至少一個氫和氟原子以及可有可無的選自氧、氮、硫、磷和碘的原子；L是一個使得包含Tms的部分可以與化合物的剩余部分切割開來的有機基團，其中包含Tms的部分包含一個官能團，當對化合物進行質譜分析時該官能團支持單一的離子化電荷狀態(tài)，并且該官能團選自叔胺、季銨以及有機酸；MOI是一個核酸片段，其中L在除MOI的3’末端之外的其他位置與MOI綴合；以及該對化合物具有不相同的Tms基團，并且除在兩個堿基位置的堿基不相同外，具有相同的序列。
55．按照權利要求53或者54之任一的組合物，該組合物包含多對上述化合物。
56．按照權利要求53或者54之任一的組合物，該組合物包含多對上述化合物，以及相等的多個固定在固相支持體上的不相同的核酸，其中這些多個核酸的每一個成員都具有確切地互補于每對化合物的一個成員的堿基序列。
57．一種組合物，該組合物包含多個具有下式的化合物Tms-L-X其中，Tms是一個可由質譜法檢測的有機基團，該基團包含碳原子、至少一個氫和氟原子以及可有可無的選自氧、氮、硫、磷和碘的原子；L是一個使得包含Tms的部分可以與化合物的剩余部分切割開來的有機基團，其中包含Tms的部分包含一個官能團，當對化合物進行質譜分析時該官能團支持單一的離子化電荷狀態(tài)，并且該官能團選自叔胺、季銨以及有機酸；X是除核酸片段之外的MOI，并且這些化合物包含至少4種化合物，并且每一化合物都具有不相同的Tms基團。
58．按照權利要求57的組合物，其中化合物的數(shù)量至少是10個。
59．一個用于突變分析的試劑盒，該試劑盒包含多個容器，每一個容器包含一對下式的化合物Tms-L-MOI其中，Tms是一個可由質譜法檢測的有機基團，該基團包含碳原子、至少一個氫和氟原子以及可有可無的選自氧、氮、硫、磷和碘的原子；L是一個使得包含Tms的部分可以與化合物的剩余部分切割開來的有機基團，其中包含Tms的部分包含一個官能團，當對化合物進行質譜分析時該官能團支持單一的離子化電荷狀態(tài)，并且該官能團選自叔胺、季銨以及有機酸；MOI是一個核酸片段，其中L在除MOI的3’末端之外的其他位置與MOI綴合；這樣該對化合物具有不相同的Tms基團，并且除在一個或兩個堿基位置的堿基不相同外具有相同的序列。
60．按照權利要求59的試劑盒，其中所說的多個至少是3個。
61．按照權利要求59的試劑盒，其中所說的多個至少是5個。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測配體對的第一成員與第二成員的結合的方法,該方法包括以下步驟:(a)在足以使第一成員與第二成員結合的條件和時間下,把一系列第一標記的成員與可能包含一個或多個第二成員的生物樣品組合在一起,其中所說的標記與特定的第一成員相關且可由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測;(b)將未結合的成員與結合的第一和第二成員分離;(c)從所說的標記的第一成員切割標記;以及(d)由非熒光光譜測定法或者電位滴定法檢測標記,并由此檢測第一成員和第二成員的結合。
文檔編號G01N33/58GK1212019SQ9719255
公開日1999年3月24日 申請日期1997年1月23日 優(yōu)先權日1996年1月23日
發(fā)明者J·范尼斯, J·C·特邦, J·J·豪伯特, J·T·默利甘 申請人:拉普吉恩公司