專利名稱：：人FcγRⅡ線性配體結(jié)合表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)領(lǐng)域中的Fc受體，特別是涉及人FcyRII(FcGammaReceptorII)線性配體結(jié)合表位。二.
背景技術(shù)：
-Fc受體(FcR)為特異親和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的細(xì)胞表面分子，人FcyR有三種類型，分別為FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRI11(CD16)，其胞外區(qū)結(jié)構(gòu)相似，均含有兩個(FcYRII和FcyRIII)或三個(FcyRI)Ig樣結(jié)構(gòu)域，屬Ig超基因家族，而跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)則存在明顯差異，F(xiàn)c受體廣泛表達(dá)于免疫輔助細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，具有許多重要的生理功能，是體液免疫與細(xì)胞免疫的聯(lián)系紐帶，在機體免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用?？贵w介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可通過激活型和抑制型FcRift行調(diào)節(jié)，因此FcR是治療過敏和自身免疫性疾病理想的藥物靶標(biāo)。根據(jù)FcyR功能的不同，提高或降低FcyR-IgG結(jié)合的親和力可以達(dá)到相應(yīng)的FqR免疫治療目的。對于抑制型受體FcYRIIB，降低受體對IgG的親和力可導(dǎo)致其抑制活性的缺失，從而促進腫瘤細(xì)胞在抗原提呈細(xì)胞的高效遞呈；以特異性單克隆抗體抑制CD3和CD4在細(xì)胞表面的表達(dá)，同時又使其不與FqRII和FcYRIII結(jié)合，阻礙機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可用于防止器官移植引起的免疫排斥和抑制自身免疫反應(yīng)。相反，提高FcYRI的親和力則可以激活細(xì)胞免疫功能，增強腫瘤細(xì)胞的抗原提呈。可溶性FcYR重組蛋白在體外可阻斷免疫復(fù)合物與B細(xì)胞的結(jié)合，因此在體內(nèi)可與免疫細(xì)胞表面FcYR競爭結(jié)合IgG,抑制免疫復(fù)合物對細(xì)胞的激活；同理，高劑量的非特異IgG也可與體內(nèi)免疫復(fù)合物競爭結(jié)合表達(dá)FcYR的免疫細(xì)胞，靜脈內(nèi)免疫球蛋白治療方法(intravenousimmunoglobulintherapy,IVIG)已應(yīng)用于血小板減少(immunethrombocytopenicpurpuria，ITP)、全身性紅斑狼瘡(systemiclupuseiythematodes,SLE)和多組織硬化(multiplesclerosis,MS)等疾病的免疫治療。IgGFC-FcYRIII晶體結(jié)構(gòu)的解析以及對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的了解為發(fā)現(xiàn)新的特異、高效藥靶提供了更多的信息和途徑，人們利用肽庫篩選、組合化學(xué)(combinatorialchemistry)、生物信息學(xué)以及合成多肽等篩選和鑒定了多種IgGFc片段的抑制性多肽，其中抑制Fc-FcyR結(jié)合的TG19320三肽四聚體在小鼠體內(nèi)顯現(xiàn)對腎小球腎炎良好的抑制功效。Medgyesi等在人IgGlFc片段中鑒定了誘導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)的功能性多肽，來源于CH2區(qū)Pro234-Ser298的多肽與細(xì)胞表面FcYRIIB特異結(jié)合，可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和ERK的磷酸化，并能抑制BCR介導(dǎo)的C^+反應(yīng)。然而，小分子多肽對受體的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于完整的抗體分子，多肽親和力的提高等問題尚有待解決。三.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種人Fc7RII線性配體結(jié)合表位，為鑒定本發(fā)明的多肽在體外的抑制活性，分別進行了多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制和人IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制，表明線性表位多肽對人FcYRII親和人IgG顯現(xiàn)出良好的抑制功效。本發(fā)明的技術(shù)方案是人FcYRII受體線性配體結(jié)合表位，其特征是該表位的氨基酸序列為Cys-Thr-Gly-Asn國Ile誦Gly-Tyr畫Thr國Leu-Phe-Ser-Ser-Lys畫Pro-Val-Thr-Ile國Thr-Val。所述的人FcYRII受體線性配體結(jié)合表位為合成多肽。所述的線性配體結(jié)合表位在多肽鏈N端氨基化或乙?；蛟诙嚯逆淐端羧基化或酰胺化。編碼所述的人FcYRII受體線性配體結(jié)合表位的核苷酸序列。本發(fā)明利用DNASIS軟件將huFcyRIIA與boFcyRILhuFcyRIffi和moFcYRIIB的氨基酸序列進行比對分析，并參照huFcyRIIA及huFcYRIIB的晶體結(jié)構(gòu)，在EC2結(jié)構(gòu)域設(shè)計合成人Fc/RII多肽6條，Dot-blot分析表明人FcyRII的154-172位多肽CTGNIGYTLFSSKPVTITV是特異結(jié)合人IgG的有效多肽，為人FcYRII的線性配體結(jié)合表位，位于受體EC2結(jié)構(gòu)域FG環(huán)；多肽縮短結(jié)果顯示，多肽CTGNIGYTLFSSK為最短，仍然與人IgG具有較強結(jié)合活性的多肽。為鑒定本發(fā)明的多肽在體外的抑制活性，分別進行了本發(fā)明多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制和人IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制。在進行本發(fā)明多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制中，將人FcyRII胞外區(qū)cDNA亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a，在大腸桿菌中高效表達(dá)了人FcYRII胞外區(qū)，以快速稀釋復(fù)性方法從包涵體變性蛋白中回收了具有良好結(jié)合活性的人FqRII胞外區(qū)重組蛋白，用ELISA方法測定了本發(fā)明多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制效率。為了進行多肽對人IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制，我們將人FcYRII受體分子表達(dá)在細(xì)胞表面，將人Fc"/RII編碼區(qū)cDNA亞克隆到表達(dá)載體pcDNA3，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過G418抗性篩選和連續(xù)克隆化，獲得了在COS-7細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)受體分子的人FcyRII轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，其IgG-RBC玫瑰花環(huán)形成率達(dá)90%左右，用流式細(xì)胞術(shù)檢測本發(fā)明多肽對人IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制效果。本發(fā)明的積極有益效果l.本項發(fā)明利用生物信息學(xué)、多肽合成、細(xì)胞免疫學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)，化學(xué)合成了人FcYRII的線性配體結(jié)合表位多肽，并進行了分析鑒定，通過多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制和人IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制實驗，半數(shù)抑制量IC5o能達(dá)到112.3nM，表明該線性表位多肽對人FcYRII親和人IgG顯現(xiàn)出良好的抑制功效。2.本發(fā)明是對人FcR線性配體結(jié)合表位的探索研究，對深入了解Fc7R-IgG相互作用的分子基礎(chǔ)有重要意義，為人FcR耙標(biāo)藥物的分子設(shè)計提供新的思路。3.人FcYRII線性配體結(jié)合表位多肽的發(fā)明，為尋找療效高而副作用小治療自身免疫病的藥物提供新思路，對解決目前困擾人類身體健康的自身免疫性疾病具有重要意義。四.圖1:是顯示FcyRIIEC2結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對結(jié)果圖2:是顯示原核表達(dá)質(zhì)粒pETshuRII的雙酶切鑒定及PCR鑒定圖3:是顯示pETshuRII/BL21(DE3)表達(dá)情況及免疫印跡檢測其融合表達(dá)圖4:是顯示表達(dá)蛋白的純化圖5:是顯示ELISA檢測復(fù)性蛋白shuRII的活性圖6:是顯示R116-C6多肽對人IgG與可溶性人FcYRII結(jié)合的抑制圖7:是顯示真核表達(dá)質(zhì)粒pc3huRII的雙酶切鑒定及PCR鑒定圖8:是顯示人FcYRII轉(zhuǎn)染細(xì)胞單克隆抗體鑒定結(jié)果圖9:是顯示表達(dá)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面的huFcYRII受體分子能與人IgG^異結(jié)合圖10:是顯示RII6-C6多肽能抑制人IgG與穩(wěn)定表達(dá)在COS-7細(xì)胞上huFcYRII的結(jié)合五.具體實施例方式實施例一huFcyRII多肽設(shè)計利用DNASIS(Ver.2.5，Hitachi)軟件將huFcyRIIA(NP—067674)與boFcyRI1(NP_776964)、huFcyRIIB(NP—003992)和moFcyRIIB(NP—034317)的氨基酸序列進行比對分析(圖l)，并參照huFc/RIIA(Maxwelletal.,1999;Sondermannetal.,2001)及huFcYRIIB(Sondermannetal.，1999)的晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計合成huFcYRII多肽6條，分別覆蓋其EC2結(jié)構(gòu)域的A-B、B-C、C-C'、C'-E、E-F和F-G環(huán)，除huRH2和huRII6多肽N端含有Cys外，其余4條多肽N端均加入Cys，用于載體蛋白偶聯(lián)(見表l)。表lhuFcyRII多肽的特性及與人IgG的反應(yīng)性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>a為了后續(xù)的連接多肽序列的N端括號內(nèi)是另外加上的半胱氨酸殘基，bDot-blot檢測各條肽與人IgG的結(jié)合，"+"表明人IgG與該肽特異結(jié)合，"-"表明人IgG與該肽不結(jié)合，e根據(jù)huFcyRII的晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測的部位。實施例二huFcYRII多肽的合成程序及篩選程序利用Symphony12通道多肽合成儀(ProteinTechnologiesInc.)在Fmoc-氨基酸-王樹脂(Fmoc-AminoAcidsattachedtoWangResin，上海吉爾)上以固相多肽合成方法(solid-phasepeptidesynthesis)合成多肽，多肽合成按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行。具體流程如下設(shè)計合成多肽序列—peptide程序分析—設(shè)計合成程序—按樹脂的取代值計算并稱取Fmoc-AA-Wang-resin或Rinkresin~DMF溶漲樹月旨—*力口20%piperidine脫Fmoc保護，攪動6min—^B下一位氨基酸和HBTU進行?；磻?yīng)，N2攪動反應(yīng)30min—f用Kaiser法或TNBS法測試反應(yīng)的完成情況—申DMF洗5次，每次lmin—重復(fù)帶有*的步驟，在樹脂上連接下一位氨基酸，直到該多肽序列合成完成—根據(jù)組成肽鏈氨基酸不同選取適當(dāng)?shù)脑噭┯肨FA法裂解肽鏈與樹脂的連接—冷乙醚沉淀TFA多肽—SephadexG-25脫鹽純化—HPLC和LC-MS分析鑒定和純化多肽—多肽與載體的偶聯(lián)—Dot-ELISA測試人IgG與多肽的結(jié)合—配體結(jié)合表位多肽的縮短—測試縮短多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制—測試縮短多肽對IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制。huFcYRII多肽及其縮短序列均按5-20pmol/條合成，在其N端均含有Cys殘基，可與SMCC雙功能試劑形成二硫鍵，偶聯(lián)于載體蛋白。合成多肽經(jīng)HPLC和LC-MS鑒定，其結(jié)構(gòu)正確，純度均可達(dá)到80%以上。實施例三huFcyRII多肽的偶聯(lián)應(yīng)用異型雙功能試齊USulfo-SMCC(MW:436.37，SpacerArmLength:11.6A，Pierce)通過將載體蛋白BSA上的-NH2和多肽N端Cys的-SH相連，形成人工結(jié)合抗原多肽BSA-Pep。偶聯(lián)步驟為(1)稱取4mg無IgG的牛血清白蛋白(IgG-freeBSA，Sigma-Aldrich)溶于0.5ml偶聯(lián)緩沖液(O.lMPBpH7.2，0.15MNaCl，1^iMEDTA)。(2)在50plDMSO中溶解lmgSulfo-SMCC(MW:436.37，Spacerarmlength:11.6A，Pierce),加入BSA溶液，充分混勻，室溫反應(yīng)lh或37。C30min，并不時混勻。(3)4。C對偶聯(lián)緩沖液過夜透析，換液3次，去除多余偶聯(lián)劑。該溶液即為SMCC活化BSA載體蛋白(SMCC-BSA)，用偶聯(lián)緩沖液調(diào)整蛋白濃度為5mg/ml。(4)稱取2mg多肽/條，以50pl二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，加入150pl含5mMEDTA的0.01MPB(pH7.2)，制備多肽儲存液，濃度為10mg/ml。(5)偶聯(lián)時，取IO|^1多肽儲存液(IOOpg)，加入等體積含5mMEDTA的0.01MPB(pH7.2);與20|ilSMCC-BSA溶液(100pg)充分混合，室溫反應(yīng)4h，4。C過夜孵育。(6)以O(shè).OlMPB(pH7.2)調(diào)整偶聯(lián)多肽濃度至lmg/ml，用于人IgG結(jié)合試驗。實施例四huFcyRn受體線性配體結(jié)合表位的初步鑒定1.Dot-blot在硝酸纖維素膜(Millipore)上點印BSA偶聯(lián)多肽(lng/dot)，以huFcyRII重組蛋白(shuRII)和載體蛋白BSA作陽性和陰性對照；自然干燥后，將印跡膜放入含0.2%明膠的洗滌液(0.05%Tween20，0.01MPBSpH7.2，PBST)中37。C封閉lh;加入以0.2%明膠稀釋的10ng/mlHRP標(biāo)記人IgG(HRP-IgG)溶液37'C孵育1h，以PBST充分洗滌；用AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole)顯色試劑盒(中杉金橋公司)參照操作說明進行顯色。結(jié)果判定時，以包被huFcYRII重組蛋白點呈現(xiàn)棕紅色顏色反應(yīng)，BSA對照點不出現(xiàn)顏色反應(yīng)進行判定，見表l。2.huFcyRII線性配體結(jié)合表位的精確定位為精確定位huFcyRII線性配體結(jié)合表位，從C端逐個縮短huRI16多肽的氨基酸殘基，合成C端截短的系列多肽，并以Dot-blot檢測其與人IgG的結(jié)合能力，見表2。在IgG-結(jié)合試驗中，C端截短多肽RII6-C6為最短的與人IgG具有較強結(jié)合活性的多肽。表2huRI16多肽的C端截短多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例五線性配體結(jié)合表位多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制1.huFcyRII基因克隆參照張改平研究員論文中紅細(xì)胞裂解法分離牛外周血白細(xì)胞的方法，從新鮮抗凝人血中分離人白細(xì)胞。該論文A必為..ZhangG1994.5ov/"e/gG^P/Z)7^asis人UniversityofHertfordshire,Hatfield.(即出自刊物名稱為博士論文，題目為5ov/"e/gGFc及ece//ora，第30-31頁)。用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取總RNA，將分離的總RNA按照TAKARA3TULLRACE試劑盒說明合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為30^1:TotalRNA(約L5pg)4|iL，Oligod(T)18(50pmol/pL)3^L,5xM-MLVBuffer6pL，dNTPMixture(10mMeach)3，RNaseInhibitor(40u/pL)0.75，ReverseT認(rèn)scriptaseM國MLV(RNaseH)(200u/jiL)0.75jiL，RNasefreeWater12.5^L。將上述反應(yīng)液混合后在PCR儀中按下面程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42°C60min，72°C15min。以上述cDNA為模板，以huR2Al5、-CACAGTGCTGGGATGACTATGGAG-3、，huR2A25、-GACCACATGGCATAACGTTACTC-3、為引物，用大連寶生物生物工程有限公司(TAKARA)LATaq擴增huFcYRII全長，PCR反應(yīng)體系為25uL:cDNA4^L,TAKARALATaq0.25^L，10xLAbuffer2.5pL，dNTP(2.5mMeach)2jiL，huR2Al(上游引物)(20pmol/pL)1pL，huR2A2(下游引物)(20pmol/pL)1pL，Water14.25pL。PCR條件為94。C3min1個循環(huán)；94。C30sec，55。C30sec，72°C2min，共35個循環(huán)；72。C10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)10/。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收目的片段。并與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建huFcYRII基因克隆pTRII。2.huFcyRII胞外區(qū)蛋白(shuRII)在大腸桿菌中的表達(dá)2.1huFcyMI胞外區(qū)原核表達(dá)質(zhì)粒pETshuRII的構(gòu)建以pTRII質(zhì)粒為模板，以引物PHR2-1-28a:5'-TTTGAATTCGCTCCCCCAAAGGCTGTG-3'，PHR2畫2-28a:5'-TTTCTCGAGTGGTGAAGAGCTGCCCATG-3'，由TAKARA公司合成。用TAKARAPremixTaq擴增huFcyRII胞外區(qū)基因，在PCR產(chǎn)物兩端分別引入&o及I、^TzoI酶切位點。PCR反應(yīng)體系為50uL:PremixTaq25fiL，模板DNA2jiL，PHR2-卜28a(上游引物)2jiL，PHR2-2-28a(下游引物)2jiL，Water19pL。PCR條件為94。C3min1個循環(huán)；94。C30sec，55"C30sec，72°C1min，共35個循環(huán)；72°C10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收目的片段經(jīng)五co/I和A7ioI雙酶切，獲得的目的片斷插入表達(dá)載體pET28a相應(yīng)酶切位點，重組pET28a轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)，挑取單克隆提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并命名為pETshuRII。2.2ShuRI1蛋白的表達(dá)將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達(dá)宿主菌中，挑取單菌落，接種到5mlLB(含IOOng/mL卡那霉素)培養(yǎng)基中37'C振蕩培養(yǎng)過夜，次日以10%的接種量轉(zhuǎn)入5ml的LB培養(yǎng)基(含100ng/mL卡那霉素)中，培養(yǎng)至OD600nm約0.6時，力口IPTG(終濃度為1mmol/L)進行誘導(dǎo)，再于37'C培養(yǎng)3-7h，離心(4000r/minx20min)收集菌體，用含400pg/ml溶菌酶的PBS重懸菌體，30'C水浴30min裂解細(xì)菌，超聲波處理裂解菌體溶液99x3s，間歇8s(冰浴)，4°C12000r/min離心20min，分離細(xì)胞裂解液上清和沉淀，以SDS-PAGE鑒定表達(dá)結(jié)果。2.3Westernblot檢測IPTG誘導(dǎo)的pETshuRII全菌和未誘導(dǎo)全菌進行12%SDS-PAGE后，將電泳分離的蛋白帶電轉(zhuǎn)到PVDF膜，0.2%明膠封閉過夜，將膜放入PBST中洗6次，每次3min，加1:500倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的人IgG37'C孵育1h，PBST洗膜6次，每次3min，AEC顯色檢測目的蛋白。2.4包涵體純化誘導(dǎo)表達(dá)250ml細(xì)菌培養(yǎng)物，離心收集表達(dá)菌體。在20ml裂解緩沖液(lysisbuffer)(10mMTrisPH8.0，150mMNaCl，10mMEDTA，10%甘油，2mMDTT，0.5mMPMSF，400^ig/ml溶菌酶)中超聲破碎后，離心收集包涵體沉淀。用洗滌緩沖液(washbuffer)(1%Triton-lOO，50mMTrisPH8.0,100mMNaCl，lOmMEDTA，2mMDTT)洗滌包涵體5次，每次25ml;然后用重懸緩沖液(resuspensionbuffer)(50mMTrisPH8.0，100mMNaCl，10mMEDTA,2mMDTT)洗滌1次，最后離心沉淀即為純化后的包涵體。2.5ShuRII蛋白的復(fù)性稀釋復(fù)性法將洗滌純化后的包涵體用2mlguanidinebuffer(6mol/L鹽酸胍，50腿ol/LTris-ClpH8.0，10讓ol/LEDTA，10訓(xùn)ol/LDTT，100mMNaCl，10%甘油)于4'C攪拌約10h溶解變性，離心去除不溶物，再用guanidinebuffer將shuRII變性液稀釋至5ml，室溫放置0.5-1h;將變性液分四批逐滴加入250ml復(fù)性緩沖液(refoldingbuffer)(100mMTrispH8.0,400mML-精氨酸鹽酸鹽，2mMEDTA，5mM還原型谷光苷肽，0.5mM氧化型谷光苷肽，0.1mMPMSF，0.1mM疊氮化鈉)中，終濃度為0.1mg/mL，每次間隔12h,使復(fù)性時間達(dá)到60h。將250ml復(fù)性液8000r/min4。C離心25min，取上清，用5kDaMWCO濃縮管把上清復(fù)性液濃縮至所需濃度。2.6ELISA鑒定活性分別以10Kig/mLshuRII復(fù)性前和復(fù)性后蛋白包被酶標(biāo)板，0.2%明膠封閉。分別將不同濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的人IgG(HRP-huIgG)(0.01-25lig/ml)溶液加入包被板中，檢測人IgG與酶標(biāo)板上shuRII復(fù)性前和復(fù)性后蛋白的結(jié)合，比較復(fù)性前后蛋白的活性。以不結(jié)合人IgG的BSA為陰性對照蛋白。2.7線性配體結(jié)合表位多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制以10^ig/mlshuRII重組蛋白包被酶標(biāo)板，0.2%明膠封閉。分別將不同濃度的多肽(0.1-70iiM)與等體積10pg/mlHRP-IgG溶液混合，置4'C反應(yīng)2h;將多肽-IgG混合物加入shuRII重組蛋白包被板中，檢測人IgG與酶標(biāo)板上shuRII重組蛋白的結(jié)合，觀!l定多肽對shuRII蛋白結(jié)合人IgG的抑制效率。不結(jié)合人IgG的多肽和無關(guān)蛋白BSA為陰性對照。3.結(jié)果3.1pETshuRII表達(dá)載體的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pTRII為模板，以引物PHR2-l-28a和PHR2-2-28a擴增huFc/RII胞外區(qū)基因，通過五co/I和^oI雙酶切將huFcYRII胞外區(qū)基因定向插入表達(dá)載體pET-28a中。經(jīng)過PCR鑒定和酶切鑒定，結(jié)果表明huFcyRII胞外區(qū)基因已定向插入到表達(dá)載體中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pETshuRII見圖2。圖2是顯示原核表達(dá)質(zhì)粒pETshuRII的雙酶切鑒定及PCR鑒定，圖中Lanes:M1.DL2000DNAmarker;1.(mFcYRII胞外區(qū)的PCR產(chǎn)物(537bp);2.pETshuRII被五coRI和J^oI雙酶切后的產(chǎn)物(5369bp,537bp);M2.iDNA/州wffllDNAmarker(23130，9416，6557，4361，2322，2027，564bp).3.2ShuRII蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析及Westernblot鑒定分別取IPTG誘導(dǎo)3h、5h、7h后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，在24.8kD左右處均出現(xiàn)一條明顯的特征蛋白質(zhì)表達(dá)帶，并且IPTG誘導(dǎo)5h后蛋白質(zhì)表達(dá)量趨于穩(wěn)定。將菌體經(jīng)超聲破碎，離心后得上清液和沉淀，上清未見到表達(dá)產(chǎn)物，表明體外重組表達(dá)蛋白主要以包涵體形式存在(圖3A)。i達(dá)蛋白在PVDF膜上顯示一大小為24.8kD的蛋白印跡，而重組質(zhì)粒誘導(dǎo)前細(xì)菌裂解液則沒有，表明表達(dá)蛋白能與人IgG特異結(jié)合(圖3B)。圖3顯示的是pETshuRlI/BL21(DE3)表達(dá)情況及免疫印跡檢測其融合表達(dá)，圖中(A)SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá).Lanes:M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)對照；l.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)前細(xì)菌裂解液；2.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)3h后細(xì)菌裂解液；3.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)5h后細(xì)菌裂解液；4.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)7h后細(xì)菌裂解液；5.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解液上清；6.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解液沉淀；(B)Westernblot分析蛋白特異性。3.3ShuRII蛋白的純化根據(jù)文獻(xiàn)報道pH值偏堿的變性液有利于復(fù)性，我們釆用了pH8.0緩沖液對shuRII包涵體進行六次超聲洗滌純化，SDS-PAGE分析顯示，洗滌后包涵體純度可達(dá)90%以上，見圖4，表明洗滌效果較好，為以后的復(fù)性奠定了基礎(chǔ)。圖4顯示的是表達(dá)蛋白的純化。圖中Lanes:M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)對照；1.pETshuRII/BL21(DE3)細(xì)胞裂解不溶性包涵體；2.包涵體第一次洗滌后的純化產(chǎn)物；3.包涵體第三次洗滌后的純化產(chǎn)物；4.包涵體第五次洗滌后的純化產(chǎn)物；.5.包涵體第六次洗滌后的純化產(chǎn)物。3.4ELISA檢測復(fù)性蛋白的活性純化后的蛋白進一步經(jīng)稀釋復(fù)性以獲得適當(dāng)空間結(jié)構(gòu)。為了檢測復(fù)性蛋白shuRII與配體的結(jié)合活性，我們將復(fù)性后和復(fù)性前蛋白(包涵體)均以10|ig/ml包被酶標(biāo)板，用不同濃度的HRP-huIgG(0.01-25pg/ml)進行檢測。如圖5所示，顯示ELISA檢測復(fù)性蛋白shuRII的活性，從圖中可看出，隨著配體濃度的升高二者ELISA的OD值區(qū)別顯著變大，表明經(jīng)稀釋復(fù)性后已獲得具有活性的蛋白(結(jié)果為三次重復(fù)實驗的平均值)。3.5線性配體結(jié)合表位多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制用RII6-C6多肽與HRP-IgG相作用，測定其對可溶性huFcYRH結(jié)合人IgG的抑制作用。在競爭ELISA中，RII6-C6多肽能夠抑制人IgG與可溶性huFcYRII的結(jié)合，抑制能力隨著RII6-C6多肽濃度的增加而增強，但并不能完全抑制，而不結(jié)合人IgG的對照多肽及BSA對HRP-IgG與可溶性受體的結(jié)合未產(chǎn)生明顯影響。圖6是顯示RII6-C6多肽對人IgG與可溶性人FcYRII結(jié)合的抑制，結(jié)果為三次重復(fù)實驗的平均值。實施例六線性配體結(jié)合表位多肽對IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制1.真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定以pTRII質(zhì)粒為模板，以引物PCR2-1:5'-ATAGAATTCGCTGGGATGACTATGGAG-3'，PCR2-2:5'-GGGCTCGAGCATAACGTTACTCTTTAG-3'，用TAKARAPremixTaq擴增huFcYRII編碼區(qū)(ORF)全長cDNA(含信號肽序列)，PCR反應(yīng)體系為50uL:PremixTaq25^L，模板DNA2pL，PCR2-12pL，PCR2-22|iL，Water19|iL。PCR條件為94。C3min1個循環(huán)；94°C30sec，55。C30sec，72。C1min，共35個循環(huán)；72。C10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)10/。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收目的片段經(jīng)五o^I和A^I雙酶切，獲得的目的片斷插入表達(dá)載體pcDNA3相應(yīng)酶切位點，重組pcDNA3轉(zhuǎn)M.co/z'JM109感受態(tài)細(xì)胞，并以含50pg/mL氨芐青霉素的營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)。挑取單克隆提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并命名為pc3huRI1。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染2.1質(zhì)粒制備用Qiagen質(zhì)粒提取試劑盒提取純化真核表達(dá)質(zhì)粒pc3huRI1。以Bg/n消化pc3huRII質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收目的片段用無菌水溶解，以核酸蛋白分析儀(Beckman公司)測定DNA含量。線性化表達(dá)質(zhì)粒pc3huRII用于huFcyRII的穩(wěn)定表達(dá)。2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選利用脂質(zhì)體Lipofectamine7142000轉(zhuǎn)染試劑以線性化pc3huRII質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以20mL含400ng/mLG418的DMEM/10完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)至96孔培養(yǎng)板，毎孔200mL，置37°C50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每34d換液l次。轉(zhuǎn)染后710d，待細(xì)胞克隆長至l/4l/2孔時，消化細(xì)胞克隆，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至另一96孔培養(yǎng)板擴大培養(yǎng)，待長成細(xì)胞單層后，以免疫熒光檢測huFcYRII的表達(dá)，保留原96孔板細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆以有限稀釋法對陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆進行連續(xù)3次克隆化，建立穩(wěn)定表達(dá)huFcYRII的細(xì)胞株。將免疫熒光檢測陽性細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中擴大培養(yǎng)，用含200pg/mLG418的DMEM/10選擇培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至510cells/mL，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200pL，37°C50mL/LC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1015d，以免疫熒光檢測huFcyRII的表達(dá)。對huF(7Ri1陽性細(xì)胞克隆進行2次和3次克隆化，使其克隆孔免疫熒光陽性率達(dá)85%以上，并在液氮中凍存克隆細(xì)胞。3.免疫熒光檢測將轉(zhuǎn)染pcDNA3/huFcyRI1的COS-7-huFcYRII細(xì)胞以lxl(^密度種植在96孔板中，同時以未轉(zhuǎn)染pcDNA3/huFcyRII的COS-7細(xì)胞作為對照，24h細(xì)胞貼壁后用PBS緩沖液沖洗3次，封閉液(0.002g/mL明膠)封閉30min，以鼠抗人CD32單克隆抗體(20pg/mL)為一抗4""C孵育lh，用PBS輕柔漂洗6次；以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗閉光孵育1h，PBS緩沖液沖洗后用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察huFqRII在細(xì)胞上的表達(dá)情況。4.玫瑰花環(huán)試驗參照張改平研究員論文中的玫瑰花環(huán)形成方法，該論文出處為ZhangCl1994.5ov/"e/gG及eceptorj(P/Z)7Tze一，UniversityofHertfordshire,Hatfield.,第54-58頁。以玫瑰花環(huán)試驗檢測huFcYRII在COS-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面與其配體人IgG的結(jié)合。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)經(jīng)鞣酸處理后用PBS配成50mL/L的紅細(xì)胞懸液，取lmL50mL/L鞣酸處理的SRBC與等量的200pg/mL的人IgG混合，在室溫條件下混合孵育45min，用PBS漂洗3次，最終配成IOmL/L的人IgG-SRBC。在96孔板中培養(yǎng)huFcYRII轉(zhuǎn)染細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層，以預(yù)溫的無血清DMEM/0培養(yǎng)基(37"C)漂洗細(xì)胞，加入dmem/0培養(yǎng)基，毎孔200mL，37'C孵育2h，以洗脫結(jié)合在細(xì)胞表面的牛IgG;將10mL/L人IgG-SRBC懸液緩慢加到細(xì)胞單層，每孔50^L;37。C孵育10min，室溫靜置35min;用PBS輕柔漂洗6次；用甲醇(含3mL/LH202)室溫固定細(xì)胞IOmin，PBS漂洗3次；每孔加PBS100fiL，在顯微鏡下觀察細(xì)胞表面形成的玫瑰花環(huán)。在細(xì)胞單層加入IOpg/mLHRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，每孔50A，37'C孵育30min;用PBST充分洗滌，以AEC染色試劑盒染色；用顯微鏡觀察玫瑰花環(huán)中SRBC的顯色。5.線性配體結(jié)合表位多肽對IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制制備表達(dá)huFqRII的COS-7細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至lxl07/mL。用DMEM/0培養(yǎng)基(含O.l%的疊氮鈉)稀釋RII6-C6多肽，分別與等體積的人IgG-FITC懸液混合，置4。C反應(yīng)lh，以不同濃度的RII6-C6多肽(0.1-700|iM)結(jié)合人IgG;將RII6-C6-IgG-FITC混合物加到穩(wěn)定表達(dá)huFcyRII的細(xì)胞懸液中，置4'C反應(yīng)lh，洗滌3次后用流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制效果，并設(shè)立隨機組合的多肽及無關(guān)蛋白BSA為陰性對照。6.結(jié)果6.1真核表達(dá)質(zhì)粒pc3huRI1的構(gòu)建以克隆到T載體上的陽性質(zhì)粒為模板，用引物PCR2-l和PCR2-2，擴增到huFqrRII編碼區(qū)(ORF)全長971bpcDNA(含信號肽)序列。將huFcyRII全長cDNA亞克隆到pcDNA3的巨細(xì)胞病毒啟動子(Pcmv)下游，經(jīng)PCR鑒定及五coRI和屈ol雙酶切鑒定，成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pc3huRI1，鑒定結(jié)果見圖7，圖7顯示真核表達(dá)質(zhì)粒pC3huRlI的雙酶切鑒定及PCR鑒定。圖7中Ml:X陽HindIIIdigestMarker(23130,9416，6557，4361，2322，2027，564bp);1:pc3huRI1被五coRI和WoI酶切的產(chǎn)物；2:用引物PCR2-1和PCR2-2擴增的PCR產(chǎn)物(971bp);M2:DL2000Marke《2000，1000,750，500,250，lOObp)。6.2穩(wěn)定表達(dá)hiiFcyRII轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立以線性化表達(dá)質(zhì)粒pc3huRII轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)、免疫熒光檢測和連續(xù)克隆化，建立了穩(wěn)定表達(dá)huFqRII的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，約90%的轉(zhuǎn)染細(xì)胞看到熒光，見圖8A;而未轉(zhuǎn)染的COS-7對照細(xì)胞未看到熒光，見圖8B，表明huFcyRII受體分子有效表達(dá)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面。圖8.為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3/huFcYRII細(xì)胞的免疫熒光檢測結(jié)果。圖中A:轉(zhuǎn)染pc3huRI1的COS-7細(xì)胞(200x);B:未轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞(200x)。6.3huFcyRII在COS-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面與其配體的結(jié)合表達(dá)huFcyRII受體分子的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以人IgG-SRBC進行玫瑰花環(huán)試驗，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞周圍形成明顯的玫瑰花環(huán)，而未轉(zhuǎn)染的COS-7對照細(xì)胞不結(jié)合人IgG-SRBC沒有玫瑰花環(huán)的形成見圖9，表明表達(dá)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面的huFcyRII受體分子能與人IgG特異結(jié)合。圖中A:轉(zhuǎn)染pc3huRI1的COS-7細(xì)胞(200x);B:未轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞(200x).6.4線性配體結(jié)合表位多肽對IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制不同濃度的RII6-C6多肽與人IgG-FITC相互作用，在穩(wěn)定表達(dá)huFc/RII轉(zhuǎn)染細(xì)胞上測定RII6-C6多肽對人IgG與huFqrRlI結(jié)合的抑制效果。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，RII6-C6多肽能夠抑制人IgG與huFcyRII的結(jié)合，抑制能力隨著RII6-C6多肽濃度的增加而增強，ICso為112.3(xM;而對照多肽無關(guān)蛋白BSA在高濃度下也沒有抑制效果(結(jié)果為三次重復(fù)實驗的平均值)，見圖io。序列表<110>河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>人FcYRII線性配體結(jié)合表位<130>多肽合成的方法<160>1<170>Patentlnversion3.4<210>1-<211>19<212>PRT<213>人工序列<400>1CysThrGlyAsnlieGlyTyrThrLeuPheSerS尹rLysProValThr151015lieThrVal權(quán)利要求1.人FcγRII受體線性配體結(jié)合表位，其特征是該表位的氨基酸序列為Cys-Thr-Gly-Asn-Ile-Gly-Tyr-Thr-Leu-Phe-Ser-Ser-Lys-Pro-Val-Thr-Ile-Thr-Val。2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的人FCYRI授體線性配體結(jié)合表位，其特征是人FcYRII受體線性配體結(jié)合表位為合成多肽。3.根據(jù)權(quán)利要求l中所述的人FqRII受體線性配體結(jié)合表位，其特征是所述的線性配體結(jié)合表位在多肽鏈N端氨基化或乙酰化。4.根據(jù)權(quán)利要求l中所述的人FqRII受體線性配體結(jié)合表位，其特征是所述的線性配體結(jié)合表位在多肽鏈C端羧基化或酰胺化。5.編碼權(quán)利要求l中所述的人FcYRII受體線性配體結(jié)合表位的核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及人FcγRII線性配體結(jié)合表位，該表位的氨基酸序列為Cys-Thr-Gly-Asn-Ile-Gly-Tyr-Thr-Leu-Phe-Ser-Ser-Lys-Pro-Val-Thr-Ile-Thr-Val，本發(fā)明利用生物信息學(xué)、多肽合成、細(xì)胞免疫學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)，化學(xué)合成了人FcγRII的線性配體結(jié)合表位多肽，并進行了分析鑒定，通過多肽對人IgG-可溶性受體結(jié)合的抑制和人IgG-細(xì)胞表面受體結(jié)合的抑制實驗，表明該線性表位多肽對人FcγRII親和人IgG顯現(xiàn)出良好的抑制功效，對深入了解FcγR-IgG相互作用的分子基礎(chǔ)有重要意義，為人FcR靶標(biāo)藥物的分子設(shè)計提供新的思路。文檔編號C12N15/12GK101367868SQ200810141550公開日2009年2月18日申請日期2008年9月28日優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日發(fā)明者喬松林,俊席,紅張,張利娜,張改平,楊艷艷,王選年,苗現(xiàn)偉,東趙,鄧瑞廣,郅玉寶,郭軍慶申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院