一種基于多孔硅的高血壓血清學(xué)的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，特別涉及一種基于多孔硅的高血壓血清學(xué)的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓是一種嚴(yán)重影響人類健康的慢性疾病，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病、腎臟疾病、器官衰竭甚至死亡的重要危險(xiǎn)因素，是人群中最為常見的慢性非傳染性疾病，也是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病，具有較高的病死率。在全世界廣泛流行，無論發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家均具有極高的患病率，我國高血壓呈現(xiàn)出快速上升的趨勢。臨床治療藥物分為利尿藥、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素II受體阻滯劑等幾類。個(gè)體化治療是有效控制高血壓病情的關(guān)鍵，但目前的個(gè)體化給藥一般通過根據(jù)患者服藥后的表觀療效結(jié)合醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行給藥劑量和給藥時(shí)間的摸索，存在極大的人為誤差。
[0003]腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)與高血壓具有密切的關(guān)系。血管緊張素I基本沒有生物學(xué)活性，而是經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Ang1tensin Converting Emzyme, ACE)剪切C-末端兩個(gè)氨基酸殘基而形成血管緊張素II。血管緊張素II具有高效的收縮血管作用，從而使血壓升高；血管緊張素II也能刺激腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮。醛固酮能促進(jìn)腎臟對水和鈉離子的重吸收，繼而增加體液容量，升高血壓。目前多數(shù)高血壓藥物針對該系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，如:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑和腎素抑制劑等幾類。對于該系統(tǒng)的關(guān)鍵因子進(jìn)行檢測對于指導(dǎo)高血壓個(gè)體化給藥具有重要意義。該系統(tǒng)的關(guān)鍵因子包括血管緊張素、腎素和醛固酮等。
[0004]另外，心鈉肽和內(nèi)皮素與高血壓治療也有密切關(guān)系。心鈉肽是一種由心房合成、貯存和分泌的活性多肽，又稱心房利鈉因子(ANF)或心房利鈉肽(ANP)。具有強(qiáng)大的利鈉、利尿、舒張血管、降低血壓和對抗腎素一血管緊張素系統(tǒng)和抗利尿激素作用。內(nèi)皮素是由21個(gè)氨基酸組成的生物活性多肽。內(nèi)皮素具有強(qiáng)烈的收縮冠狀動(dòng)脈、腎小動(dòng)脈；內(nèi)皮素是迄今所知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，其作用時(shí)間持久，刺激心鈉素的釋放，提高全身血壓；抑制腎素釋放等作用。
[0005]目前，臨床針對血管緊張素、腎素、醛固酮、心鈉肽和內(nèi)皮素五種指標(biāo)的檢測方法有放射免疫分析法、發(fā)光免疫分析法、高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法等幾種。這些方法一次僅能檢測一種指標(biāo)，通量較低，且具有檢測周期長、靈敏度低或有放射污染等缺點(diǎn)。
[0006]目前報(bào)道的基于多孔硅微腔的生物傳感器很多，檢測方法包括:反射光譜的檢測和拉曼、熒光光譜的檢測。
[0007]CN101710118A公開了一種基于多孔硅三元結(jié)構(gòu)微腔的光學(xué)免疫檢測方法，該方法采用基于計(jì)算機(jī)精確控制的電化學(xué)腐蝕方法制備多孔硅微腔，其中多孔硅微腔內(nèi)上、下的Bragg(布拉格)結(jié)構(gòu)由三種電流密度交替進(jìn)行電化學(xué)腐蝕而形成，其特征在于對于不同條件制備的多孔硅微腔進(jìn)行編碼可以實(shí)現(xiàn)多元檢測，如果是一元檢測則不需要編碼，使抗體或抗原在多孔硅三元結(jié)構(gòu)微腔的孔洞里結(jié)合，多元檢測中抗原或抗體的種類利用多孔硅微腔的編碼進(jìn)行標(biāo)識(shí)，而通過生物反應(yīng)前后的光譜峰位變化進(jìn)行檢測樣品中相應(yīng)的抗原或抗體濃度，所述檢測方法包括以下步驟:
1)抗原或抗體固定在多孔硅微腔的孔洞里，如果是需要編碼的多元檢測，那么一種編碼的多孔硅微腔對應(yīng)固定一種待測生物分子的特異性抗原或抗體，沖洗未結(jié)合的分子并封閉多孔硅微腔里的未結(jié)合生物分子的空白鍵位，記錄測定固定有抗原或抗體的多孔硅微腔光譜；
2)不同多孔硅微腔與不同濃度待測溶液發(fā)生反應(yīng)，使抗原-抗體在多孔硅微腔的孔洞里特異性結(jié)合，反應(yīng)后進(jìn)行沖洗，記錄多孔硅微腔光譜及編碼確定種類和濃度。
[0008]這種光學(xué)免疫檢測方法不僅兼具多孔硅和光子帶隙結(jié)構(gòu)傳感器的諸多優(yōu)異性能，而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性很好，通過編碼檢測技術(shù)更是可以實(shí)現(xiàn)多元檢測。此外，由于采用的制備方法較為簡單，價(jià)格相對低廉，有一定的商業(yè)應(yīng)用前景。
[0009]CN103558184A涉及一種基于多孔硅非標(biāo)記實(shí)時(shí)在線檢測霍亂毒素的方法。該方法利用多孔硅為傳感基底，在多孔硅表面修飾疏水基團(tuán)后，通過疏水性相互作用固定脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，當(dāng)樣品中含有霍亂毒素時(shí)，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)特異的結(jié)合毒素分子，利用多孔硅的反射干涉光譜，經(jīng)過傅里葉紅外轉(zhuǎn)化后，實(shí)時(shí)非標(biāo)記檢測多孔硅有效薄膜的厚度變化，對霍亂毒素進(jìn)行定量和定性檢測。該方法可以對霍亂毒素實(shí)時(shí)在線檢測，最低檢測限為InM，該傳感基底可以重復(fù)使用。
[0010]CN103293109A涉及免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，公開了一種光學(xué)無標(biāo)記血清學(xué)檢測方法及其系統(tǒng)。將多孔硅光學(xué)微諧振腔生物傳感器作為換能器產(chǎn)生對生物分子敏感的響應(yīng)光信號，通過采集包被生物探針分子后的多孔硅光學(xué)微諧振腔生物傳感器所產(chǎn)生的第一光信號和捕獲目標(biāo)生物分子后的多孔硅光學(xué)微諧振腔生物傳感器所產(chǎn)生的第二光信號，根據(jù)第一光信號和第二光信號的比較結(jié)果，得到檢測結(jié)果。由于無需對檢測對象進(jìn)行添加標(biāo)記處理，對試劑需求量少，降低了檢測的復(fù)雜度和成本。并且，基于硅工藝制備，成本低，方便集成于手持設(shè)備中，而且響應(yīng)速度快，能迅速得到檢測結(jié)果。
[0011]本發(fā)明以給予高血壓個(gè)體化治療指導(dǎo)為目標(biāo)，針對其關(guān)鍵指標(biāo)診斷技術(shù)的不足，期望研發(fā)一種能夠客觀評估高血壓藥物給藥的劑量，對高血壓個(gè)體化治療提供指導(dǎo)的血清學(xué)檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種基于多孔硅的高血壓血清學(xué)的檢測方法。其中，以對稱三元結(jié)構(gòu)的多孔硅微腔作為檢測平臺(tái)。每5篇多孔硅微腔單元構(gòu)成一個(gè)反應(yīng)檢測平臺(tái)，每一片單元編號對應(yīng)于5中待檢測抗原。相應(yīng)的待檢測抗原有5種，分別是血管緊張素，腎素，醛固酮，心鈉肽和內(nèi)皮素。該5種抗原和相應(yīng)的抗體均可以通過商業(yè)渠道購得，本發(fā)明所用5種抗原和相應(yīng)的抗體(血清)由新醫(yī)大一附院提供。
[0013]本發(fā)明提供一種基于多孔硅的高血壓血清學(xué)的檢測方法，包括如下步驟:
⑴制備多孔娃Bragg反射鏡；
⑵多孔硅Bragg反射鏡的表面功能化處理；
⑶分別將5種待測抗原的抗血清化學(xué)處理固定在多孔硅Bragg反射鏡上；
⑷將5片多孔硅微腔組裝成一個(gè)傳感基底； (5)將傳感基底浸泡于含有5中抗原的血清樣品中，分別檢測每個(gè)單元浸泡前后的反射光譜，依據(jù)單元1-5反射光譜所發(fā)生的紅移，依次判斷樣品中是否含有第1-5種抗原。如樣品中含有第I種抗原，那么單元I的反射光譜會(huì)發(fā)生紅移，如樣品中含有第2種抗原，那么單元2的反射光譜會(huì)發(fā)生紅移，如樣品中含有第3種抗原，那么單元3的反射光譜會(huì)發(fā)生紅移，如樣品中含有第4種抗原，那么單元4的反射光譜會(huì)發(fā)生紅移，如樣品中含有第5種抗原，那么單元5的反射光譜會(huì)發(fā)生紅移。
[0014](6)根據(jù)反射光譜紅移的量計(jì)算出每一種抗原的濃度，以此得到樣品溶液中5種抗原的有無和多少。
[0015]優(yōu)選，步驟⑴的制備方法如下:將化學(xué)清洗好的單晶硅片置于盛有HF及乙醇混合溶液的腐蝕槽中，進(jìn)行兩種電流交替的電化學(xué)腐蝕，腐蝕的全過程由計(jì)算機(jī)主導(dǎo)電化學(xué)腐蝕平臺(tái)精確自動(dòng)控制，設(shè)計(jì)控制多孔硅Bragg反射鏡的中心波長位于中紅外波段；首先對低孔隙率多孔硅層進(jìn)行腐蝕，優(yōu)選的，腐蝕電流密度設(shè)置為10-20mA，腐蝕時(shí)間15-25 ;然后對高孔隙率多孔硅層進(jìn)行腐蝕，優(yōu)選的，腐蝕電流密度設(shè)置為60-80mA，腐蝕時(shí)間5-15s ;為了保證每一層的均勻性，需及時(shí)補(bǔ)充氟離子的濃度，在每一層形成后，優(yōu)選電流停頓5-10s ;總周期數(shù)為9 ;最后將所有腐蝕好的多孔硅Bragg反射鏡樣品在KOH溶液中浸泡，優(yōu)選KOH溶液的濃度為1-5mmol/L，浸泡時(shí)間優(yōu)選3_8 min，用于增大孔徑，使生物分子能夠充分地進(jìn)入。
[0016]優(yōu)選，步驟⑵的制備方法如下:①將步驟⑴制備好的樣品放入溫度為40_50°C體積分?jǐn)?shù)為20-30%的H2O2中浸泡0.5-2 h，取出后用去離子水沖洗并在N 2氣環(huán)境中干燥?’②將樣品放入用甲苯溶液稀釋的氨丙基三乙氧基硅烷APTES中浸泡I h進(jìn)行硅烷化反應(yīng)樣品取出后分別用甲苯、甲醇-甲苯、甲醇及去離子水反復(fù)沖洗，再置于隊(duì)氣環(huán)境中干燥，然后在烘烤；④將烘烤后的樣品浸泡在戊二醛水溶液，并用PBS磷酸緩沖液，反復(fù)沖洗去除殘余的戊二醛。
[0017]優(yōu)選，步驟⑶的方法如下:分別用微量移液器將足以覆蓋整個(gè)多孔硅表面的待測抗原的抗血清滴加到每片多孔硅Bragg反射鏡上，然后在30-40°C下放置lh，然后用Tween-20與磷酸的混合溶液PBST反復(fù)沖洗，去除未偶聯(lián)到多孔娃Bragg反射鏡中的抗血清，并在N2氛圍中干燥。
[0018]更優(yōu)選地，步驟⑴的制備方法如下:將化學(xué)清洗好的單晶硅片置于盛有HF及乙醇混合溶液(體積比1:1)的腐蝕槽中，進(jìn)行兩種電流交替的電化學(xué)腐蝕，腐蝕的全過程由基于LabVIEW的計(jì)算機(jī)主導(dǎo)電化學(xué)腐蝕平臺(tái)精確自動(dòng)控制，設(shè)計(jì)控制多孔娃Bragg反射鏡的中心波長位于多孔硅材料吸收很小的中紅外波段；首先對低孔隙率多孔硅層進(jìn)行腐蝕，腐蝕電流密度設(shè)置為20mA，腐蝕時(shí)間24 s ;然后對高孔隙率多孔硅層進(jìn)行腐蝕，腐蝕電流密度設(shè)置為80mA，腐蝕時(shí)間1s ;為了保證每一層的均勻性，需及時(shí)補(bǔ)充氟離子的濃度，在每一層形成后，電流停頓10 s ;總周期數(shù)為9 ;最后將所有腐蝕好的多孔硅Bragg反射鏡樣品在I mmol/LKOH溶液中浸泡5 min，用于增大孔徑，使生物分子能夠充分地進(jìn)入。
[0019]更優(yōu)選地，步驟⑵