研制，但是本發(fā)明所述方法并不限于在該儀器上使用，本發(fā)明適用于其他任何廠家及型號(hào)的生化分析儀便攜式表面等離子體諧振生化分析儀，僅需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行修訂。本發(fā)明所采用的SPR-2002型表面等離子體諧振生物傳感器為中國科學(xué)院電子學(xué)研究所傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行研制，但是本發(fā)明所述方法并不限于在該儀器上使用，本發(fā)明適用于其他任何廠家及型號(hào)的表面等離子體諧振生物傳感器，僅需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行修訂。
【附圖說明】
[0026]圖1是現(xiàn)有技術(shù)中禽流感病毒檢測方法示意圖；
[0027]圖2是本發(fā)明中禽流感病毒檢測方法流程示意圖；
[0028]圖3是本發(fā)明中利用抑制免疫檢測法檢測禽流感病毒的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)曲線；
[0029]圖4是本發(fā)明中利用抑制免疫檢測法檢測禽流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0030]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0031]本發(fā)明公開了一種基于便攜式表面等離子體諧振(SPR)生化分析儀的禽流感病毒檢測方法，其利用白行研制的便攜式SPR生化分析儀以及配套試劑盒，實(shí)現(xiàn)對(duì)禽流感病毒的現(xiàn)場、實(shí)時(shí)、快速和無需標(biāo)記的檢測，所述便攜式表面等離子諧振生化分析儀已申請(qǐng)專利并獲得授權(quán)(專利號(hào):CN101592606B)，SPR生化分析儀的尺寸其體積在20X5X10cm3以內(nèi)，重量小于5kg。當(dāng)然，本發(fā)明中也可以使用普通的SPR生化分析儀來實(shí)現(xiàn)。
[0032]圖2示出了本發(fā)明提出的禽流感病毒檢測方法流程示意圖。如圖2所示，該方法包括:
[0033]步驟1、將從環(huán)境中獲取的待測樣品如水、空氣等與裂解液混合后溫浴一段時(shí)間后注入SPR生化分析儀，或?qū)⑽唇?jīng)任何預(yù)處理的待測樣品單獨(dú)注入SPR生化分析儀，或?qū)⒋郎y樣品與抗禽流感病毒抗體混合后注入SPR生化分析儀；
[0034]步驟2、在所述SPR生化分析儀中，待測樣品在SPR敏感芯片表面反應(yīng)預(yù)定時(shí)間，最好小于10分鐘；
[0035]步驟3、SPR生化分析儀計(jì)算出禽流感病毒的濃度數(shù)值，并根據(jù)預(yù)先設(shè)定的警戒值進(jìn)行報(bào)警或不報(bào)警。
[0036]其中，所述SPR敏感芯片包括兩種，第一種是將禽流感病毒抗體固定在SPR金屬膜上而構(gòu)成敏感膜，所述禽流感病毒抗體為針對(duì)禽流感病毒表面蛋白NA的抗體；第二種是將禽流感病毒抗原固定在SPR金屬膜上以構(gòu)成敏感膜，所述禽流感病毒抗原是指禽流感病毒內(nèi)部蛋白Ml。
[0037]下面說明利用SPR敏感芯片A檢測禽流感病毒的原理:
[0038]固定在芯片表面的禽流感病毒抗體能夠和禽流感病毒表面的蛋白NA特異性地結(jié)合，當(dāng)含有禽流感病毒的樣品流過芯片表面時(shí)，抗體與蛋白NA結(jié)合，將樣品中的禽流感病毒捕獲到芯片的表面，使芯片表面的折射率發(fā)生變化，從而產(chǎn)生SPR響應(yīng)值。SPR響應(yīng)值與樣品中的病毒濃度成正比。由于其檢測原理是基于禽流感病毒表面蛋白與抗體的特異性結(jié)合，所以在利用敏感芯片A進(jìn)行檢測時(shí)，不需要對(duì)禽流感病毒進(jìn)行預(yù)處理(裂解)。
[0039]利用SPR敏感芯片B檢測禽流感病毒的原理是:
[0040]將禽流感病毒抗原固定在SPR敏感芯片的表面以構(gòu)成敏感膜，將待測樣品進(jìn)行預(yù)處理，并與抗體混合后流過芯片表面，如果樣品中含有禽流感病毒，則在經(jīng)過預(yù)處理(裂解)后，禽流感病毒內(nèi)部蛋白Ml將釋放出來，與抗體結(jié)合，從而抑制了抗體與芯片表面的蛋白Ml結(jié)合。樣品中病毒的濃度與SPR響應(yīng)值成反比。將含有已知濃度禽流感病毒的樣品與抗禽流感病毒抗體充份混合，然后注入SPR生化分析儀，產(chǎn)生響應(yīng)值。利用一系列已知濃度的禽流感病毒進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，將所得一系列響應(yīng)值作為縱坐標(biāo)，禽流感病毒的濃度作為橫坐標(biāo)畫圖，即可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用未知濃度的禽流感病毒樣品進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，將此響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，則能夠計(jì)算出樣品中所含的禽流感病毒的含量。由于利用敏感芯片B檢測是基于禽流感病毒內(nèi)部蛋白與抗體相互作用的原理，所以需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理(裂解)，將Ml蛋白釋放出來進(jìn)行檢測。
[0041]圖3為利用抑制免疫檢測法檢測禽流感病毒的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)曲線，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值。利用一系列已知濃度的禽流感病毒進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，將所得一系列響應(yīng)值作為縱坐標(biāo)，禽流感病毒的濃度作為橫坐標(biāo)畫圖，即可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0042]圖4為利用抑制免疫檢測法檢測禽流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用未知濃度的禽流感病毒樣品進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，將此響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，則能夠計(jì)算出樣品中所含的禽流感病毒的含量。
[0043]本發(fā)明基于直接免疫檢測原理提供了配套試劑盒A，包括:SPR敏感芯片A，陰性及陽性對(duì)照，磷酸緩沖液，說明書。
[0044]本發(fā)明基于抑制免疫檢測原理提供了配套試劑盒B，包括:SPR敏感芯片B，抗禽流感病毒抗體，裂解液，陰性及陽性對(duì)照，磷酸緩沖液，說明書。
[0045]所述SPR敏感芯片的基板材料為玻璃或塑料，基板表面有兩層金屬膜，包括下層鉻膜，和上層金屬膜為金膜或銀膜，上層金屬膜不限于金或銀，上層金屬膜的厚度為40_50nm,優(yōu)選為45nm,下層鉻膜厚度為3_7nm,優(yōu)選為5nm。
[0046]SPR敏感芯片是在SPR裸金屬片上固定特異性敏感膜而制成的，其制備過程如下:將表面的金屬膜經(jīng)過葡聚糖修飾的SPR敏感芯片用去離子水清洗，并將其表面吹干；將芯片浸泡在0.4M N-羥基琥珀酰亞胺(EDC)和0.1M N-乙基-N’ _( 二甲氨基丙基)碳二亞胺(NHS)的混合液(1:1 ;v / V)中，芯片表面進(jìn)行活化10分鐘，活化后用去離子水清洗后吹干；將禽流感病毒抗體用PH4.2-4.6醋酸緩沖液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛群?，滴加在芯片表面以制備第一種SPR敏感芯片A ;或?qū)⑶萘鞲胁《究乖胮H值4.2-4.6醋酸緩沖液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛群螅渭釉谛酒砻嬉灾苽涞诙NSPR敏感芯片B ;20°C反應(yīng)5分鐘；將芯片泡入IM乙醇胺溶液中反應(yīng)10分鐘，以滅活剩余的結(jié)合位點(diǎn)；快速將芯片用去離子水吹干，置于4°C保存。
[0047]其中，步驟I中樣品前處理方法是將樣品中的禽流感病毒部份或全部裂解后進(jìn)行檢測，以增強(qiáng)檢測靈敏度，裂解液為Triton或SDS，工作濃度為10% -0.5%，優(yōu)選為1%;溫浴的溫度為25-45度，優(yōu)選為37度，溫浴的時(shí)間10-90min，優(yōu)選為30min ;樣品不經(jīng)過裂解前處理也可以直接進(jìn)行應(yīng)急檢測。
[0048]利用本發(fā)明提出的基于便攜式SPR生化分析儀檢測禽流感病毒的方法，被檢測的禽流感病毒包括所有亞型的完整禽流感病毒顆?；虿《舅槠约耙匀魏我阎姆绞将@得的禽流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
[0049]利用本發(fā)明提出的基于便攜式SPR生化分析儀檢測禽流感病毒的方法，含有禽流感病毒的待測樣品包括病毒培養(yǎng)物、咽喉試子、血清樣品、水，但不限于這幾類樣品。
[0050]利用本發(fā)明跳出的基于便攜式SPR生化分析儀檢測禽流感病毒的方法，可作為一種判斷環(huán)境樣品(如河流、土壤、空氣)是否被禽流感病毒污染方法。
[0051]本發(fā)明將更為細(xì)致地描述，并以以下的例子和實(shí)驗(yàn)作為參考，但不限于以下的例子和實(shí)驗(yàn)。在一個(gè)利用便攜式表面等離子體諧振(SPR)生化分析儀檢測禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)中，只要是SPR敏感芯片表面的特異性敏感膜，能夠特異性地結(jié)合禽流感病毒并且在便攜式SPR生化分析儀中配套使用，各種變化和修飾都在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)，不背離本發(fā)明。本發(fā)明的保護(hù)范圍不應(yīng)限于此實(shí)施方式。
[0052]本發(fā)明實(shí)施例中提出的制備第一種SPR敏感芯片的方法包括:葡聚糖修飾SPR裸金屬膜芯片的金屬膜表面，然后用去離子水清洗，并將其表面吹干。將上述芯片浸泡在0.4MN-羥基琥珀酰亞胺(EDC)和