一種五味子中5-羥甲基糠醛的含量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥材化學(xué)成分的檢測，特別涉及五味子中的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 五味子[Schisandra chinensis(Turcz. )Baill.]為木蘭科五味子屬 (Schisandra)多年生左旋落葉木質(zhì)藤本植物，其成熟果實(shí)干燥后作藥用，因其果實(shí)甘、酸、 辛、苦、咸五味俱全，故名五味子，主產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧等地，習(xí)稱"北五味子"。具有收 斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功能。用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、 盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥。五味子多為9月前后成熟，為漿果，果 實(shí)含水量較高，采收后需及時(shí)加工干燥以利于貯存保證藥材品質(zhì)。傳統(tǒng)多采用陰干、曬干等 方式，因其需要大量勞動力且受天氣情況影響干燥過程不易控制，現(xiàn)多采用烘干的方式進(jìn) 行干燥。但是不同的干燥時(shí)間和干燥溫度對藥材品質(zhì)具有重要影響。
[0003] 5-羥甲基糠醛（5-HMF)，又稱5-羥甲基-2-糠醛，是由葡萄糖等單糖化合物在高 溫或弱酸等條件下產(chǎn)生的一個(gè)醛類化合物，是Maillard反應(yīng)的典型產(chǎn)物之一。文獻(xiàn)中表述 該化合物對人體橫紋肌和內(nèi)臟有損害，具有神經(jīng)毒性，能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生積蓄中毒， 2010年版中國藥典二部中明確規(guī)定了它在含葡萄糖注射液中的限量。此外，近年來也有 研究表明，它具有抗氧化、抗心肌缺血、改變血液流變學(xué)等對人體有益的作用。目前5-HMF 測定主要為UV法和HPLC法，五味子應(yīng)用廣泛，在加工干制的過程中會產(chǎn)生5-HMF，但是五 味子藥材中5-HMF的含量測定未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV建立五味子藥材中 5-HMF的含量測定方法，對于研究炮制作用機(jī)理，規(guī)范炮制工藝，控制飲片炮制質(zhì)量具有一 定意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的五味子中5-羥甲基糠 醛的含量檢測方法。
[0005] 本發(fā)明提供的五味子中5-羥甲基糠醛含量的檢測方法，包括以下步驟
[0006] (A)供試品溶液的制備；
[0007] (B)對照品溶液的制備；
[0008] (C)高效液相色譜法測定：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液，注入液相色 譜儀，按照一定的色譜條件測定，外標(biāo)法定量，計(jì)算，即得。
[0009] 上述步驟(A)為取過60目篩的五味子藥材粉末，冰浴超聲或冰浴振搖提取，將得 到提取離心，過濾，定容，過〇. 45 y m濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0010] 進(jìn)一步的，上述步驟（A)為取過60目篩的五味子藥材粉末0. 5-1. 5g，精密稱定，置 離心管中，加入甲醇12mL，冰浴超聲或冰浴振搖提取，每次20-30min，共提取3-4次，合并提 取液，離心，過濾，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，搖勻，過0. 45 y m濾膜，取續(xù)濾液作為 供試品溶液。
[0011] 更進(jìn)一步的，上述步驟(A)為取過60目篩的五味子藥材粉末約l.OOg，精密稱定， 置離心管中，加入甲醇12mL，冰浴超聲提取，每次25min，共提取3次，合并提取液，離心，過 濾，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，搖勻，過0. 45 y m濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0012] 上述步驟（B)為精密稱取5-HMF對照品，加甲醇溶解，定容，搖勻即得。
[0013] 進(jìn)一步的，取5-HMF對照品5. 00-8. OOmg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并 定容至10mL，搖勻。從中精密吸取3mL置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得，4°C儲藏 備用。
[0014] 更進(jìn)一步的，精密稱取5-HMF對照品6. 00mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至 10mL，搖勻。從中精密吸取3mL置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得，4°C儲藏備用。
[0015] 上述的步驟（C)中的色譜條件可以采用下述的色譜條件：
[0016] 色譜柱：選自c18或c8柱；
[0017] 流動相：選自體積比為5-15 : 95-85的甲醇-0.5%醋酸水溶液或體積比為 10-15:90-85乙腈-水溶液，等度洗脫；
[0018]流速：0?8-1. 2mL ? mirf1 ;
[0019]檢測波長：280-284nm ;
[0020] 柱溫：25-35 °C ;
[0021] 進(jìn)樣量：10-20uL;
[0022] 更進(jìn)一步的，上述的步驟（C)中的色譜條件為
[0023]色譜柱：C18;
[0024] 流動相：選自體積比為15 : 85的甲醇-0. 5%醋酸水溶液
[0025]流速：lmL ? mirf1 ;
[0026]檢測波長：284nm ;
[0027]柱溫：30°C;
[0028]進(jìn)樣量：10iiL;
[0029] 本發(fā)明采用的方法和實(shí)驗(yàn)條件是經(jīng)過篩選獲得的，能夠達(dá)到精確測定的目的，以 下為本發(fā)明的篩選過程：
[0030] 檢測波長的篩選
[0031] 5-HMF紫外吸收波長有280nm，282nm，284nm等多個(gè)，經(jīng)過200~400nm全波長掃 描，說明本實(shí)驗(yàn)5-HMF在284nm下有最大吸收，優(yōu)選284nm作為測定波長。本試驗(yàn)采用PDA 檢測器對樣品和對照品進(jìn)行了峰純度驗(yàn)證，結(jié)果表明在本試驗(yàn)所確定的檢測條件下，5-HMF 峰不含其他干擾成分。
[0032] 提取方法的篩選
[0033] 5-HMF的生成與溫度密切相關(guān)，溫度較高可能導(dǎo)致或加速美拉德反應(yīng)的發(fā)生，所以 沒有考慮熱提取的方法以避免加熱過程產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)考察了冰浴超聲提取法與冰浴振 搖提取取法，結(jié)果表明兩種方法相差不大。因超聲提取法操作簡單，優(yōu)選超聲提取法。具體 篩選如下：
[0034] 取五味子干燥果實(shí)，粉碎，過60目篩，精密稱取1. 0000g于錐形瓶中，加入10ml甲 醇，分別采用冰浴超聲提取和振搖提取兩次，每次提取15min，平行2次，提取時(shí)用錫箔紙包 住錐形瓶。取提取液過濾，定容至25ml容量瓶中，搖勻，過0.45um濾膜，進(jìn)高效液相測定。 記錄峰面積，峰面積_的為最佳提取方式，見表1.
[0035]表1不同提取方式的5-HMF峰面積
[0037] 由以上數(shù)據(jù)可以看出冰浴超聲提取5-羥甲基糠醛效果相差不大，由于超聲提取 方便，所以選擇冰浴超聲提取五味子干燥果實(shí)中的5-羥甲基糠醛。
[0038] 提取溶劑用量篩選
[0039] 取五味子干燥果實(shí)，粉碎，過60目篩。精密稱取五味子粉末1. OOOOg于錐形瓶中， 分別加入藥材量5、10、15、20、25倍體積的甲醇溶液，所述的倍數(shù)是指水的體積和五味子的 質(zhì)量倍數(shù)（v/V)，通常是L/kg、mL/g，以此類推；冰浴超聲提取15min，提取一次，平行2次， 提取時(shí)用錫箔紙包住錐形瓶。取提取液過濾，定容至25ml容量瓶中，過0. 45um濾膜，進(jìn)高 效液相測定。記錄峰面積，峰面積最高的為最佳溶劑用量，見表2和圖3
[0040] 表2不同溶劑用量的5-HMF峰面積
[0042] 由以上數(shù)據(jù)可以看出隨著料液比的增加，5-HMF的含量先增加后減小，當(dāng)料液比為 1 :10時(shí)糠醛含量最高，料液比為1:15和1 :20比1:10略微降低相差不多，當(dāng)料液比增加為 1:25時(shí)峰面積下降。
[0043] 提取時(shí)間的篩選
[0044] 取五味子干燥果實(shí)，粉碎，過60目篩。精密稱取五味子粉末1. OOOOg于錐形瓶中， 加入10ml甲醇溶液，分別冰浴超聲提取5min，15min，25min，35min，提取一次，平行2次，提 取時(shí)用錫箔紙包住錐形瓶。取提取液過濾，定容至25ml容量瓶中，過0. 45um濾膜，進(jìn)高效 液相測定。記錄峰面積，峰面積最_的為最佳提取時(shí)間，見表3和圖4
[0045] 表3不同提取時(shí)間的5-HMF峰面積
[0046]
[0047] 由以上數(shù)據(jù)可以看出隨著提取時(shí)間的增加，糠醛的含量增加，最后趨于平穩(wěn)。提取 時(shí)間為15min, 25min, 35min時(shí)5-HMF含量相差不多。
[0048] 提取次數(shù)的篩選
[0049] 五味子粉碎，過60目篩。精密稱取五味子粉末1. OOOOg于錐形瓶中，加入10ml甲 醇溶液，冰浴超聲提取15min，提取時(shí)用錫箔紙包住錐形瓶。每提取一次都取提取液過濾，定 容至25ml容量瓶中，過0