診斷和治療前列腺癌的方法
【專利說明】診斷和治療前列腺癌的方法
[0001] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究與開發(fā)的聲明
[000引本發(fā)明是根據(jù)國家癌癥研究所（NCI)授予的基金號NCIK08CA160657由政府資 助進(jìn)行的。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0003] 由子搖香材料的參考并入
[0004] 全部并入本文作為參考的是同期提交的計(jì)算機(jī)可讀的核巧酸/氨基酸序列表，所 述序列表確認(rèn)如下；一份生成于2013年12月11日，命名為"715739_ST25.TXT"的4, 225 字節(jié)ASCII(文本）文件。
【背景技術(shù)】
[0005] 前列腺癌是最為常見的惡性疾病，是第二大導(dǎo)致美國男性死亡的疾?。↙i 等，Biochim.Bio地ys.Acta, 1704:87-102(2004))。國家癌癥研究所（NCI)估計(jì)，2013 年美 國診斷出超過230, 000例的新增前列腺癌病例，并且超過29, 000名男性將死于前列腺癌。 前列腺特異性抗原或PSA測試依然被廣泛應(yīng)用于前列腺癌早期檢測。雖然PSA測試檢測出 無癥狀男性中所患有的大部分前列腺癌（(Mettlin等，Cancer, 83巧）：1679-1684 (1998a); Mettlin等，Cancer, 82(2) :249-251 (1998b) ;Hump虹巧等，J.化ol.，155:816-820(1996); 和Grossfeld等，Epidemiol.Rev.，23 (1) : 173-180 (2001))，但是PSA檢測的特異度 較差，當(dāng)PSA截止值被設(shè)為2. 6ng/mL時，特異度將低至33 % (Thompson等，N.Engl. J.Med.，350:2239-2246 (2004))，雖然靈敏度可高達(dá)83 %。PSA檢測特異度差的直接原因是 其他前列腺疾病如良性前列腺增生炬PH)和前列腺炎中PSA分泌的增加。因此，PSA水平 升高指示需要進(jìn)行額外篩查，所述篩查通常W穿刺活檢的形式進(jìn)行。最終，穿刺活檢的結(jié)果 決定前列腺癌的診斷。每年有超過一百萬例前列腺的穿刺活檢，每例活檢成本約為1500美 元，并且還會引起患者的不適。然而其中只有不到二十萬名被診斷為前列腺癌。因此，大部 分穿刺活檢是不必要的。
[0006] 目前，臨床上有許多診斷標(biāo)志物被用于區(qū)分良性前列腺組織與惡性前列腺組 織，所述標(biāo)志物包括例如a-甲基酷基-輔酶A消旋酶（AMACR，p504s)狂hou等，Amer. J.SurgicalPathology, 27 (6) : 772 - 778 (2003))和TMPRSS2-ERG融合基因（化等，Cancer Cell, 17(5) :443 - 54(2010))。但是該些標(biāo)志物缺乏進(jìn)行持續(xù)可靠診斷所需的特異度。相 似地，預(yù)后（pro即ostic)標(biāo)志物（如TMPRSS2-ERG融合基因、PTEN缺失W及SPINK1過表 達(dá)）也在評估各種前列腺癌時缺乏特異度，導(dǎo)致相當(dāng)數(shù)量的前列腺癌除了計(jì)算癌癥格里森 評分外沒有更進(jìn)一步的預(yù)后信息。目前還沒有已知的生物標(biāo)記物可W指示已經(jīng)侵襲進(jìn)入前 列腺周圍軟組織的前列腺癌。
[0007] 因此，有必要采用非侵入式方法對前列腺癌進(jìn)行診斷與預(yù)后，并改善前列腺癌的 治療方法。本發(fā)明提供了該種方法。
[0008] 發(fā)巧概巧
[0009] 本發(fā)明提供了一種抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使前列腺癌細(xì)胞 與抑制可溶性腺巧酸環(huán)化酶（sAC)蛋白活性的物質(zhì)接觸，從而使前列腺癌細(xì)胞的增殖受到 抑制。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種診斷男性對象前列腺癌的方法，所述方法包括；(a)從男性 對象的前列腺獲取細(xì)胞樣品，化）分析所述樣品中sAC基因的表達(dá)或sAC蛋白的生成，W及 (C)將樣品中sAC基因表達(dá)水平或sAC蛋白生成水平與對照進(jìn)行比較，其中與所述對照相 比，所述樣品中sAC基因或sAC蛋白的過量表達(dá)指示所述男性對象患有前列腺癌。
[0011] 本發(fā)明提供了一種為前列腺癌對象選擇治療方案的方法，所述方法包括；(a)從 前列腺癌對象獲取前列腺癌細(xì)胞樣品，化）檢測所述樣品中sAC基因的表達(dá)或sAC蛋白的 生成，（C)將所述樣品中sAC基因或蛋白表達(dá)的水平與對照進(jìn)行比較，（d)根據(jù)（C)的比較 來預(yù)后所述對象的前列腺癌，（e)根據(jù)（d)中對所述對象的預(yù)后來選擇對象的治療方案，W 及（f)向所述對象提供所述治療方案。
[00。]附圖概巧
[001引圖1A顯示了使用如下未經(jīng)處理細(xì)胞系的裂解液進(jìn)行sAC表達(dá)的蛋白印跡分析的 數(shù)據(jù)；PNT2、PC3和LNCaP。圖1B顯示了在PC3與LNCaP細(xì)胞系中使用R40抗體（只識別 "睪丸型"sAC同種型）和R21抗體（識別sAC"睪丸型"和"軀體型"同種型）進(jìn)行sAC同 種型特異性蛋白印跡分析獲得的數(shù)據(jù)。
[0014]圖2顯示了sAC抑制劑KH7對前列腺癌細(xì)胞增殖的效果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。KH7處理后24 小時對細(xì)胞cAMP含量和每皿的細(xì)胞數(shù)量（起始密度；150, 000個細(xì)胞/皿）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 值為平均值 ±SEM(N= 5-8)。* 相比 0ymol/LKH7,P<0. 05。
[00巧]圖3A顯示了使用sAC特異性或亂序（scrambled)的siRNA處理72小時后（左圖） 或使用sAC特異性或亂序（scrambled)shRNA處理72小時后（右圖），使用LNCaP細(xì)胞裂解 液進(jìn)行蛋白印跡分析的數(shù)據(jù)。圖3B-D顯示了SiRNA或shRNA轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖的影響（圖 3B)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性（相對單位（r.U.))(圖3C)與半脫天冬酶-3切割（圖3D)的 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。值為平均值+S.E.(N= 5-6)，* ;相比對照或亂序P<0. 05。蛋白印跡數(shù)據(jù)代表 了具有相似結(jié)果的五個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0016] 圖4A-4F顯示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明了抑制或敲減sAC誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G2期。圖 4A-4C顯示了使用流式細(xì)胞儀對對照LNCaP細(xì)胞、使用sAC抑制劑KH7 (20mol/L)或非活性 類似物KH7. 15 (20mol/L)處理24小時的細(xì)胞或者轉(zhuǎn)染sAC-特異性SiRNA或亂序SiRNA的 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期統(tǒng)計(jì)分析。圖4D包括的圖和圖像分別顯示了LNCaP細(xì)胞使用sAC抑制劑 KH7處理48小時后G2期細(xì)胞群和半脫天冬酶-3切割的時間進(jìn)程。值為平均值+S.E.(n =8-10)，* ;相比對照或亂序SiRNAP<0. 05。圖4E和4F顯示了使用對照LNCaP細(xì)胞、或者 用KH7處理24小時的細(xì)胞或sAC敲減（SiRNA)的細(xì)胞的裂解液，對控制細(xì)胞周期進(jìn)程通過 G2/M期和G1/S期檢測點(diǎn)的蛋白進(jìn)行的蛋白印跡分析。處理?xiàng)l件與圖4A-4D中描述的條件 類似。所有的蛋白印跡數(shù)據(jù)代表=到五個具有相似結(jié)果的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0017] 圖5A-5E顯示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明sACWPKA非依賴性和EPAC依賴性的方式來控制 增殖和細(xì)胞周期。圖5A-5C的圖顯示了每皿細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析（圖5A)、細(xì)胞培養(yǎng)基中 的U)H活性（相對單位（r.U.))(圖5B)W及G2期細(xì)胞群（圖5C)。處理（全部均為24 小時）如下；20mol/LKH7,20mol/LKH7. 15，100mol/L8-pCPT-cAMP巧-pCPT)，100mol/LN 6-苯甲酯基-cAMP化-Bnz)，3mol/LH-89,或lOOmol/L(化）-cAMP-S(化cAMP)。值為平均值 ±S.E.(n= 8-11)，* ;相比對照P<0. 05 ;相比KH7P<0. 05。圖抓和祀顯示了使用LNCaP 細(xì)胞裂解液對Rapl(Rapl-GT巧的活性形式和B-Raf的磯酸化形式進(jìn)行蛋白印跡分析。處 理?xiàng)l件與圖5A-5C描述的條件類似。處理進(jìn)行18小時。所有的蛋白印跡數(shù)據(jù)代表四到六 個具有類似結(jié)果的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明提供了基于可溶性腺巧酸環(huán)化酶（sAC)蛋白的表達(dá)來抑制前列腺癌 細(xì)胞增殖、診斷前列腺癌、W及為前列腺癌患者選擇治療方案的方法。sAC是參與環(huán) AMP(cAMP)生成的可溶性信號酶（見，例如國際專利申請公開版W02001/085753和美國專 利6, 544, 768)。sAC的表達(dá)已在角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、單核細(xì)胞、小汗腺管和人類皮膚 神經(jīng)狂i卵in等，J.Invest.Dermatol.，130:1279-1287 (2010年））、W及身體的其他區(qū)域中 發(fā)現(xiàn)。cAMP介導(dǎo)細(xì)胞對營養(yǎng)條件和細(xì)胞外信號的應(yīng)答，并且早已知道cAMP對細(xì)胞生長和 增殖會產(chǎn)生刺激效果和抑制效果值umont等，TrendsBiochem.Sci.，14:67-71 (1989);和 Rozengu;rt等，Science, 161-166 (1986))。
[0019]cAMP依賴性信號傳導(dǎo)已經(jīng)被顯示在控制細(xì)胞增殖和調(diào)亡的數(shù)個信號傳導(dǎo)途徑 中發(fā)揮作用；然而，還沒有很好地確定cAMP信號對增殖和調(diào)亡的特異性效果。例如，通過 刺激G蛋白響應(yīng)的跨膜腺巧酸環(huán)化酶（tmAC)或使用cAMP類似物處理來增加細(xì)胞內(nèi)cAMP 的含量已在不同細(xì)胞類型中顯示能誘導(dǎo)或抑制增殖（參見，例如化chbaum等，J.Biol. Chem. ,283:4464-4468(2008);Misra和Pizzo'J.Cell.Biochem. ,108:998-1011(2009); Hewer等，J.Mol.Cell.Cardiol. ,50:87-98 (2011);和Lucchi等，PLoS 化e，6:e20785(2011))。類似地，已經(jīng)報(bào)道了cAMP信號傳導(dǎo)對調(diào)亡的多種影響（見，例如 Leone等，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver化ysiol., 293:G673-681(2007);Rudolph 等，J.Biol.Chem.，279:14828-14834 (2004);Smith等，Blood, 105:308-316 (2005) ;W及 aiang和Insel,J.Biol.Chem.，279:20858-20865 (2004))。該些差異可能是由于細(xì)胞類型 或?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ偷牟町?，或者由于tmAC依賴性信號缺乏特異性。
[0020] sAC依賴的cAMP在調(diào)控細(xì)胞增殖中的作用尚不清楚。除了在胞質(zhì)中有定位，sAC 也存在于細(xì)胞核中，在那里其通過蛋白激酶A(PKA)依賴性磯酸化來控制核cAMP反應(yīng)元 件結(jié)合蛋白（CREB)轉(zhuǎn)錄因子的活性（見，例如Zippin等，F(xiàn)ASEBJ.，17:82-84(2003))。 最近的研究還表明當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞從良性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘ㄈ缙つw鱗狀細(xì) 胞癌和黑色素瘤）時，sAC從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核遷移（見，例如，Zippin等，J.Invest. Dermatol.，130:1279-1287 (2010);和Magro等，Arch.Dermatol.，148:335-：M4 (2012))。
[0021] 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括 使前列腺癌細(xì)胞與抑制可溶性腺巧酸環(huán)化酶（sAC)蛋白活性的物質(zhì)接觸。術(shù)語"前列腺癌" 與術(shù)語"前列腺腫瘤（carcinoma)"為同義詞，指前列腺組織中形成的癌癥。"前列腺癌細(xì) 胞"指從前列腺癌中獲得