312:604-608(1984);和hkeda等,化Uire, 314:452-454(1985))。單鏈抗體可 W使用如美國專利5, 476, 786、5, 132, 405,和4, 946, 778中披露的方法來制備。
[0034] 結(jié)合sAC蛋白的抗體片段可W使用本領(lǐng)域中已知的任何合適技術(shù)生成??贵w片段 的示例包括但不限于,F(xiàn)(油')2片段,所述F(油')2段可通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生, F油'片段,所述F油'片段可通過還原F(油')2片段的二硫橋產(chǎn)生,W及F油片段,所述F油 片段可通過木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體產(chǎn)生。
[0035] 檢測針對sAC的抗體,如結(jié)合樣品中sAC的抗體,W便獲得或辨別sAC染色模式。 針對sAC抗體的檢測可W通過任何合適的技術(shù)來完成,所述技術(shù)包括但不限于酶介導(dǎo)(例 如堿性磯酸酶、辣根過氧化物酶等)技術(shù)或巧光基團介導(dǎo)(例如門TC、TR口C、AMCA等)技 術(shù)。在一個實施方式中,抗體結(jié)合是通過檢測sAC抗體的標記來檢測的。在另一個實施方 式中,初級抗體是通過檢測二級抗體或與一級抗體結(jié)合的試劑而進行來檢測,其中,在進一 步的實施方式中,二級抗體被標記并進行檢測。
[0036] 可W使用任何合適的標記W獲得或辨別sAC染色模式。合適的標記包括但不限 于,基于酶、巧光、化學(xué)發(fā)光、放射性和染料分子。其它試劑和材料可用于獲得或辨別sAC染 色模式,如將石蠟包埋樣品進行脫蠟的脫蠟組分、預(yù)處理和封閉試劑、擴增試劑、洗漆緩沖 液、封閉試劑、和共染色試劑。
[0037]幾種抗sAC抗體已經(jīng)確定,包括例如R5、R6. 2、R7、R14、R21、R33、R37、R40、R41、 R47. 1、R52、R53、貼4和R59(參見例如Kamenetsky,"哺乳動物具有多種不同的受調(diào)控的 cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)(MammalianCellsPossessMultiple,DistinctlyRegulated cAMPSi即alingCascades)"博:t論文,康奈爾大學(xué)威爾醫(yī)學(xué)院(WeillMedicalCollege ofCornellUniversity),公開號AAT3251733[ProQuestDocumentID1276395511] (2006))。該些抗體的祀向sAC的表位在SEQIDN0S;l-8中提供。優(yōu)選的抗體包括R21 抗體,所述R21抗體是一種定向針對人sACfl蛋白的203-216位氨基酸的小鼠單克隆抗體 狂i卵in等,J.Invest.Dermatol.,130 巧):1279-1287 (2010) ),R40 抗體W及貼2 抗體,所 述貼2抗體能與包含SEQIDNO;9的表位結(jié)合。
[003引相比于對照組,男性對象樣品中sAC基因或蛋白的過量表達指示男性對象患有前 列腺癌。當sAC基因的表達高于正常水平或sAC蛋白的生成高于正常水平時,分別為sAC 基因"過量表達"或sAC蛋白質(zhì)"過量生成"。sAC基因的正常表達或sAC蛋白的正常生成 分別是在非患病對象或者在懷疑患有前列腺癌的男性患者的非患病組織中,sAC基因的表 達或sAC蛋白的生成。
[0039]sAC基因的過量表達或sAC蛋白的過量生成可W通過分別比較樣品與對照(例如 陽性或陰性對照)中sAC基因表達或sAC蛋白生成的水平進行檢測。對照可W通過例如在 已知前列腺癌或相關(guān)病癥為陰性的人類對象或樣品,或在懷疑患有前列腺癌的男性對象的 非疾病組織(陰性對照),或者是在已知前列腺癌或相關(guān)病癥為陽性的人類對象或樣品(陽 性對照)中,測量sAC基因表達的水平或sAC蛋白的生成。對照還可W通過由任何合適的 制備方法由預(yù)先確定的標準來提供(例如從已知前列腺癌或相關(guān)病癥是陽性或陰性的對 象群體中得到的sAC基因的表達狀況或sAC蛋白的生成狀況)。當與陰性對照比較sAC基 因的表達或sAC蛋白的生成時,過量表達或過量生成可分別定義為表達或生成水平分別比 對照的表達或生成水平高出任意倍數(shù)(例如,相比于陰性對照的1. 5倍、2倍、5倍、10倍、20 倍、50倍、100倍,甚至更高的表達)。
[0040] 本發(fā)明還提供了為前列腺癌對象選擇治療方案的方法。該方法包括(a)從前列 腺癌對象獲取前列腺癌細胞樣品,化)檢測所述樣品中sAC基因的表達或sAC蛋白的生成, (C)將所述樣品中sAC基因表達水平或sAC的蛋白生成水平與對照進行比較,(d)根據(jù)(C) 的對比結(jié)果預(yù)后所述對象的前列腺癌,(e)根據(jù)(d)中對所述對象所做的預(yù)后選擇對象的 治療方案,W及(f)向所述對象提供所述治療方案。上述與本發(fā)明其它實施方式有關(guān)的前 列腺癌細胞樣品和測定sAC基因表達及sAC蛋白生成的描述,也適用于上述為前列腺癌對 象選擇治療方案的方法的相同的方面。
[0041] 本文所使用的術(shù)語"預(yù)后",是指預(yù)測患者病情的結(jié)果。在為前列腺癌患者選擇治 療方案的發(fā)明方法的上下文中,對照可W通過例如在已知各階段前列腺癌為陽性的人類對 象集合中測量sAC基因的表達或sAC蛋白的生成來提供。對照也可W通過任何合適的制備 方法、由在各前列腺癌階段中sAC基因的表達或sAC蛋白的生成的預(yù)先確定的標準來提供 (如已知不同階段的前列腺癌為陽性的對象群體中獲得的sAC基因的表達狀況或sAC蛋白 的生成狀況)。在該種方式中,臨床醫(yī)生可W將前列腺癌對象的樣品與多個不同的前列腺癌 階段進行比較,W便更準確地確定前列腺癌對象疾病的階段和侵襲性。
[0042] 所述發(fā)明性方法中的預(yù)后前列腺癌進一步包括計算前列腺癌細胞樣品的格里森 (Gleason)評分。格里森評分(或格里森分級系統(tǒng))基于病理學(xué)來分級前列腺癌。較高的 格里森評分指示癌癥的侵襲性更強并且預(yù)后性更差。確定格里森評分首先設(shè)及使用低顯微 鏡檢查特定前列腺癌樣品的特異性腫瘤模式,所述模式被指定為模式1-5,如表1中所述。
[0043] 表1-用于確定格里森評分的模式
[0044]
[0046]格里森評分被計算為兩個數(shù)字的總和;(1)最常見模式評分和(2)第二常見模式 評分。格里森評分范圍為2至10,10分表示預(yù)后性最差。然后根據(jù)格里森評分評定格里森 等級,將癌癥分為低級、中級、高級。在該方面,低級腫瘤的格里森評分為6或更小,中級腫 瘤的格里森分值為7,高級腫瘤的格里森評分為8-10。
[0047] 如果例如格里森評分的預(yù)后檢測表明對象的前列腺癌可能已擴散進入前列腺或 身體的其他部分(即轉(zhuǎn)移),將進行附加檢測W確定癌癥的確切階段,W便選擇針對該階 段的最有效的治療方案。可確定前列腺癌準確階段的附加檢測和程序包括,但不限于骨掃 描、磁共振成像(MRI)、CAT掃描(CT掃描)、盆腔淋己結(jié)切除術(shù)W及精囊活檢??蒞根據(jù)例 如Edge等(編),美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)分期手冊(AmericanJointCommitteeon Cancer(AJCC)StagingManual),第 7 版(2010)或SE邸編碼和分期手冊(S邸RProgram CodingandStagingManual),NIH出版號13-5581,美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部國家癌癥研究 所(2013)中描述的指南,將前列腺癌分為I期、II期、III期或IV期。
[0048] 一旦確定前列腺癌對象的預(yù)后,本發(fā)明的方法包括根據(jù)對象的預(yù)后來選擇對象的 治療方案,并為對象提供所述治療方案。對對象的前列腺癌進行準確分期可W更好的選擇 并應(yīng)用治療方法。影響對象前列腺癌確切分期的知識使得臨床醫(yī)生對該患者選擇最恰當和 最有用的治療或處理方法,同時避免無效甚至適得其反的治療方法。
[0049] 選擇的治療方案可W包括在本領(lǐng)域中已知的任何合適的、并在治療任何階段前 列腺癌中都顯示出效果的治療方案或藥物制劑,包括但不限于主動監(jiān)測、外科手術(shù)、放射 治療、激素治療、化學(xué)治療、生物治療、二磯酸鹽治療、單克隆抗體治療、冷凍手術(shù)、高強 度聚焦超聲和/或質(zhì)子束放射治療(參見,例如,化rwich,A. ,Ann.化col. , 17Suppl. 10 :x211-213(2006);和化stmaR.,Ann. 0ncol.,17Suppl. 10:x207-210(2006))。例如,護理 I期前列腺癌的現(xiàn)行標準可包括動態(tài)監(jiān)測、根治性前列腺切除術(shù)(通常與盆腔淋己結(jié)切除 術(shù))、外粒子束放射治療、內(nèi)放射治療、高強度聚焦超聲臨床試驗和/或冷凍手術(shù)臨床試驗。 護理II期、III期和IV期前列腺癌的標準包括許多在I期前列腺癌中采用的治療方法,但 還進一步包括質(zhì)子束放射治療、控制癌癥和減輕泌尿癥狀的治療(例如,激素治療、內(nèi)放射 治療、經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)(TUR巧和新型放射治療)、和癌已轉(zhuǎn)移至骨的控制疼痛的治療 (例如,止痛藥、外粒子束放射和單克隆抗體祀向治療)。
[0050] 下列實施例進一步說明本發(fā)明,但是當然,不應(yīng)W任何方式被解釋為限制其范圍。
[00川 實施例1
[0052] 本實施例證明sAC蛋白在前列腺癌細胞中過量生成。
[0053] 對良性和惡性前列腺組織樣品中的sAC基因表達、sAC蛋白亞細胞定位W及sAC蛋 白分布進行了檢測。對來自12例前列腺癌根治術(shù)標本的腫瘤和良性組織用鼠單克隆sAC抗 體(R21)進行免疫組織化學(xué)染色。兩例腫瘤良好分化(格里森評分6),7例中度分化(格 里森評分7),3例低分化(格里森評分8-10)。
[0054] 簡言之,對5微米厚的福爾馬林固定石蠟包埋組織切片進行脫蠟,并根據(jù)制造 商的熱誘導(dǎo)表位修復(fù)1方法及其配套試劑,通過BondIII自動染色機(Autostainer) (LeicaMicrosystems公司,伊利諾伊州布法羅格羅夫炬ufTaloGrove))對其進行染色。 如前所述狂ippin等,J.Invest.Dermatol. , 130:1279-1287 (2010);和Magro等,Arch. Dermatol.,148:335-344 (2012)),小鼠單克隆R21sAC抗體(CEPBiotech公司,R21-I肥,佛 羅里達州塔馬拉克(Tamarac))W1 ;750的稀釋度使用,接著在次級(postprimary)堿性 磯酸酶步驟中處理20分鐘進行信號放大,應(yīng)用3, 3' -二氨基聯(lián)苯胺處理10分鐘,最后洗脫 并用蓋玻片裝配。
[00巧]所有載玻片由有經(jīng)驗的泌尿病理學(xué)家W非盲方式評價。在對研究案例進行評估之 前,前列腺測試案例由兩位醫(yī)師進行檢查,W確定相對染色強度分類為弱(1+)、中等(2+)、 W及強(3+)。一種將針對每個強度水平的組織染色百分比納入考量的組織學(xué)評分系統(tǒng) 化-評分炬arnes等,Br.J.Cancer. , 74:445-51 (1996)))被用于量化染色量。H-評分按照 如下等式來計算;H-評分=(%細胞染色"1+")Xl+(%細胞染色"2+")X化(%細胞染色 "3+")X3。因此,H-評分范圍為0到300。對每個案例的細胞中染色定位(即,細胞質(zhì)區(qū) 室,頂端/管腔邊界(apicaVluminalborder)或核小室)進行記錄。當sAC特異性DAB 沉淀物(棟色)覆蓋并遮蔽蘇木精染色(藍色)的細胞核時,核染色為陽性。細胞質(zhì)染色 被定義為sAC-特異性DAB沉淀不覆蓋細胞核。每個案例的染色分布變化(即靠近前列腺 外圍("囊狀")的組織相對于更靠近內(nèi)部的區(qū)域)也進行記錄。