促卵泡生成素（fsh）定量測定試劑盒及其制備方法與檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療器械生物類免疫體外診斷領(lǐng)域，主要涉及一種基于磁微粒分離化 學(xué)發(fā)光法定量檢測血液中促卵泡生成素（FSH)定量測定試劑盒及其制備方法，以及應(yīng)用該 試劑盒定量檢測促卵泡生成素（FSH)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 促卵泡生成素 （Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH)是一種由垂體前葉分泌的 糖蛋白激素，該激素是垂體分泌的促性腺激素之一。促卵泡生成素（FSH)的主要作用是促 進和維持正常的性腺發(fā)育和生殖功能。促卵泡生成素（FSH)可以促進女性卵泡生成、成熟， 促進顆粒細(xì)胞增殖、起卵泡分泌；可以刺激男性睪丸支持細(xì)胞發(fā)育，并可作用于睪丸曲細(xì)精 管可促進精子形成。正常人血清中FSH基礎(chǔ)值為5~10IU/L。
[0003] 女性體內(nèi)的促卵泡生成素（FSH)分泌具有明顯的周期性，血液中促卵泡生成素 (FSH)的濃度及每日由尿液排泄的促卵泡生成素（FSH)的量隨月經(jīng)周期變化而變化。在絕 經(jīng)或卵巢切除后，以及早熟卵巢的衰退期，血液和尿液中促卵泡生成素（FSH)排出量增加。
[0004] 促卵泡生成素（FSH)在男性體內(nèi)能夠調(diào)控生精小管的發(fā)育以及保持生精作用，男 性體內(nèi)的促卵泡生成素（FSH)分泌無明顯周期性，但在50歲以后略有升高。男性在睪丸衰 退和克蘭費爾特氏綜合癥的初期會出現(xiàn)體內(nèi)促卵泡生成素（FSH)升高。另外，促卵泡生成 素（FSH)的濃度在人體饑餓、腎衰竭、甲狀腺機能亢進和肝硬化時也會有所提高。
[0005] 在國內(nèi)，促卵泡生成素（FSH)檢測主要以國外進口試劑和免疫組化試劑。由于國 外進口試劑和和免疫組化試劑的價格都非常昂貴，給患者帶來很大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，非常不利 于在基層普及。國內(nèi)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國產(chǎn)促卵泡生成素（FSH)免疫化學(xué)發(fā)光檢測試劑 盒目前還較少，并且僅停留在96孔微孔板式技術(shù)水平上，這種落后的檢測技術(shù)的靈敏度較 低、線性窄、特異性較差，也不利于高通量的全自動檢測。
[0006] 因此，有待開發(fā)對促卵泡生成素（FSH)檢測靈敏度高，可靠性強，并能夠同時降低 檢測成本的檢測技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種新的可定量檢測促卵 泡生成素（FSH)的試劑盒，提高檢測靈敏度及可靠性，并降低成本，延長有效期。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0009] -方面，本發(fā)明提供了一種促卵泡生成素（FSH)定量測定試劑盒，該試劑盒包括 校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、抗試劑、磁微粒試劑和發(fā)光底物。
[0010] 該試劑盒中各組分按照如下方法制備：
[0011] 一、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品的配制方法如下：
[0012] 用校準(zhǔn)品緩沖液溶解促卵泡生成素（FSH)，配置校準(zhǔn)品和質(zhì)控品；其中，所述校準(zhǔn) 品緩沖液是通過在IL新生牛血清中加入0.0 lg~0. 05g的四環(huán)素和0.1 g~0. 5g硫酸新 霉素，溶解后經(jīng)過〇. 22 μ m濾膜處理制備；
[0013] 二、抗試劑的制備方法如下：
[0014] (1)、抗試劑緩沖液的制備：
[0015] Tris :12. 12mg，四環(huán)素：0· Olg~0· 05g，綿羊血清：Ig~5g，新生牛血清3g~ l〇g，馬血清Ig~5g加入IL純化水中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓?br>[0016] (2)、異硫氰酸熒光素與促卵泡生成素（FSH)偶聯(lián)，獲得異硫氰酸熒光素標(biāo)記的促 卵泡生成素（FSH)包被抗體：
[0017] 首先用抗試劑緩沖液將異硫氰酸突光素配制成濃度為I. 0~5. Omg/mL的異硫氰 酸熒光素溶液，然后按照促卵泡生成素（FSH)與異硫氰酸熒光素的質(zhì)量之比為1:1. 1,將二 者同時轉(zhuǎn)移到棕色玻璃瓶中，室溫下攪拌1~2小時，充分反應(yīng)后使用pH = 8~9的碳酸氫 鹽緩沖液，進行平衡，然后凝膠層析分離純化出異硫氰酸熒光素標(biāo)記的促卵泡生成素（FSH) 包被抗體；
[0018] (3)、堿性磷酸酶與促卵泡生成素（FSH)的偶聯(lián)，獲得堿性磷酸酶標(biāo)記的促卵泡生 成素（FSH)標(biāo)記抗體：
[0019] 首先用抗試劑緩沖液將堿性磷酸酶配制成濃度為I. 0~5. Omg/mL的堿性磷酸酶 溶液；然后按照堿性磷酸酶與促卵泡生成素（FSH)的摩爾比為1:2~1:10的量將二者轉(zhuǎn)移 至棕色瓶中，室溫下攪拌4~5小時，充分反應(yīng)后使用pH = 8~9的碳酸氫鹽緩沖液平衡， 然后使用凝膠層析分離純化出堿性磷酸酶標(biāo)記的促卵泡生成素（FSH)標(biāo)記抗體，注意含有 連接物的試管的避光防護；
[0020] (4)、將步驟（2)中獲得的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的促卵泡生成素（FSH)包被抗體和 步驟（3)中獲得的堿性磷酸酶標(biāo)記的促卵泡生成素（FSH)標(biāo)記抗體，加入到含有表面活性 劑的Tris鹽緩沖液中，充分?jǐn)嚢韬螳@得所述抗試劑；所述表面活性劑為T Ween20、Triton X-KKKBronidox中的一種或多種，表面活性劑的添加量為0. 01%~0. 5%。
[0021] 本發(fā)明中，所述的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的促卵泡生成素（FSH)包被抗體和堿性磷 酸酶標(biāo)記的促卵泡生成素（FSH)標(biāo)記抗體除能與促卵泡生成素（FSH)特異性結(jié)合外，配對 使用時可與促卵泡生成素（FSH)形成"三明治"夾心結(jié)構(gòu)。
[0022] 三、磁微粒試劑的制備：
[0023] 將抗異硫氰酸熒光素抗體與羧基磁珠偶聯(lián)制得磁微粒試劑。
[0024] (1)、取一定體積的充分混勻后的羧基磁珠濃縮液至反應(yīng)瓶中，將該反應(yīng)瓶在磁場 中放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反應(yīng)瓶中加入2~5倍于反應(yīng)瓶中羧基 磁珠體積的磁微粒緩沖液，震蕩清洗20-30min ;再將反應(yīng)瓶置于磁場中15min后吸去上清。 重復(fù)清洗羧基磁珠3遍。最后將羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混勻；
[0025] (2)、連接反應(yīng)：按照羧基磁珠與抗異硫氰酸熒光素抗體的質(zhì)量比為100:1的比 例，在在羧基磁珠中加入抗異硫氰酸熒光素抗體，2~8°C下保持混勻狀態(tài)反應(yīng)18小時；
[0026] (3)、反應(yīng)瓶在磁場中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磷酸緩沖液清洗3遍，然后 定容至10mg/mL，2~8°C保存，制得所需待用磁微粒試劑。
[0027] 四、發(fā)光底物的制備
[0028] 將ALPS溶解于發(fā)光底物緩沖液中制備發(fā)光底物。
[0029] 用4~10倍于ALPS體積的發(fā)光底物緩沖液充分溶解ALPS。
[0030] 進一步的，本發(fā)明的促卵泡生成素（FSH)定量測定試劑盒，還包括有清洗液。該清 洗液主要用于在檢測過程中清洗與磁微粒試劑反應(yīng)后的樣品，清洗液的具體組分可以參照 所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進行。通常是磷酸二氫鈉、氯化納、Tween20和Proclin300的混合溶 液，在試劑盒制品中可以濃縮清洗液的形式存在，檢測時適當(dāng)稀釋后使用。優(yōu)選的清洗液的 配置方法是：Trisl2. 12g，氯化鈉5. 82g，Tween-2050mL，曲拉通-100, 50mL，加入IL純化水 中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙狻?br>[0031] 另一方面，本發(fā)明還提供了這種促卵泡生成素（FSH)定量測定試劑盒的制備方 法，包括以下步驟。
[0032] 分別配制校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、抗試劑、磁微粒試劑和發(fā)光底物；將校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、抗 試劑、磁微粒試劑和發(fā)光底物獨立地置于包裝容器內(nèi)，得到促卵泡生成素（FSH)的定量測 定試劑盒。
[0033] 再一方面，本發(fā)明提供了利用這種促卵泡生成素（FSH)定量測定試劑盒檢測促卵 泡生成素（FSH)的方法，該方法包括步驟：
[0034] (1)取三支試管分別加15 μ L校準(zhǔn)品、15 μ質(zhì)控品、15 μ L待測樣本；
[0035] (2)每一試管中加入60 μ L抗試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置 37 °C下水浴15分鐘；
[0036] (3)每一試管中加入30 μ L磁微粒試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s， 置37 °C下水浴5分鐘；
[0037] (4)將試管在磁分離器上沉淀2分鐘，緩慢的倒轉(zhuǎn)試管和磁分離器，倒出上清液， 把倒轉(zhuǎn)的試管連同磁分離器一起放在濾紙上，用力拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁上的 所有液滴；
[0038] (5)每支試管中加入300 μ L清洗液，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，混 勻后緩慢的倒轉(zhuǎn)試管和磁分離器，倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同磁分離器一起放在濾紙 上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；，
[0039] (6)重復(fù)步驟（5) -次；
[0040] (7)每一試管中加入200 μ L發(fā)光底物溶液，振蕩混勻3s，用化學(xué)發(fā)光儀檢測發(fā)光 強