一種快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十二烷四烯酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十二烷四烯酸的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在人體內(nèi)，少量脂肪酸以游離形式存在，大部分以結(jié)合形式，如甘油三酯、磷脂、糖 脂等存在。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度，脂肪酸可分為必需脂肪酸和非必需脂肪酸，非必需脂肪酸是指機(jī) 體可以自行合成，不必依靠食物供應(yīng)的脂肪酸；必需脂肪酸是指人體維持機(jī)體正常代謝不 可缺少而自身又不能合成或合成速度慢，無(wú)法滿足機(jī)體需要，必須通過(guò)食物供給的脂肪酸。 必需脂肪酸可分為ω(Omega)-6系列脂肪酸和ω(Omega)-3系列脂肪酸。膳食中必需 脂肪酸缺乏將導(dǎo)致皮膚病變、神經(jīng)和視覺(jué)疑難癥、心臟疾病等問(wèn)題。
[0003] 由于紅細(xì)胞膜上脂肪酸的組成能夠反映人群的長(zhǎng)期飲食結(jié)構(gòu)，而不會(huì)受到短期內(nèi) 飲食的影響。因此，測(cè)定人全血紅細(xì)胞脂肪酸，能夠準(zhǔn)確、客觀的反映機(jī)體內(nèi)不同脂肪酸的 營(yíng)養(yǎng)水平。
[0004] 國(guó)內(nèi)外有關(guān)脂肪酸檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道盛多，涉及到食品、環(huán)境、醫(yī)藥衛(wèi)生、臨床應(yīng)用 等多個(gè)領(lǐng)域，檢測(cè)方法包括氣相色譜法（GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS)和液相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜法（LC-MS/MS)，檢測(cè)樣本類型更是涉及食物、水質(zhì)、藥品、血液、組織等。但是，不同的應(yīng) 用領(lǐng)域及不同的樣品類型，所涉及的樣品處理與脂肪酸檢測(cè)分析流程千差萬(wàn)別，因此不同 領(lǐng)域以及不同樣品類型的脂肪酸檢測(cè)方法之間無(wú)可比性。
[0005] 目前，全血紅細(xì)胞脂肪酸的檢測(cè)主要有GC、GC-MS和LC-MS/MS三種。GC是目前 紅細(xì)胞脂肪酸檢測(cè)的常用方法，但是此方法的檢測(cè)器對(duì)未實(shí)現(xiàn)色譜分離的類似脂肪酸，無(wú) 法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定性分離和定量分析，因此無(wú)法對(duì)多種脂肪酸特異性、準(zhǔn)確的定性和定量分析。 LC-MS/MS方法前處理較為復(fù)雜，且分析結(jié)果重現(xiàn)性較差。而GC-MS方法由于同時(shí)具有氣相 的分離功能和質(zhì)譜的特異性定性、定量功能，所以可以解決GC和LC-MS/MS的弊端，但是現(xiàn) 有的GC-MS方法分析時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)通量較低。
[0006] 中國(guó)專利201210247480. 2公開(kāi)了一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方 法，該方法針對(duì)的樣品為動(dòng)物組織，樣品的前處理包括皂化步驟，還需要充氮?dú)獗Ｗo(hù)，樣品 的前處理復(fù)雜。 因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切需要一種前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、方法靈敏度高、特異性強(qiáng) 的適用于全血紅細(xì)胞脂肪酸的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十二烷 四烯酸的方法，該方法的樣品用量少，前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，定性、定量功能強(qiáng) 大，并且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間短、檢測(cè)通量高。本發(fā)明僅涉及全血樣本紅細(xì)胞二十二烷四烯酸 的檢測(cè)。
[0008] -種快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十二烷四烯酸的方法，包括如下步驟： A) 全血樣品的前處理：從全血樣品中分離紅細(xì)胞，加入內(nèi)標(biāo)溶液和鹽酸-甲醇溶液進(jìn) 行衍生化反應(yīng)，然后加入萃取劑萃取，取上清液并氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)屑尤霃?fù)溶劑，混勻，得到 樣品檢測(cè)液； B) 對(duì)所述樣品檢測(cè)液采用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，氣相色譜條件包括：色譜柱采 用極性色譜柱，載氣為氦氣，不分流進(jìn)樣，線速度流量控制方式，載氣流量為0. 80~1.OOmL/ min，起始柱溫60°C，先升溫至180°C，然后升溫至220°C，整個(gè)升溫程序的梯度時(shí)間為 8~15min;質(zhì)譜條件為：采用電子轟擊離子源，采用全掃描和選擇離子掃描方式。
[0009] 采用上述技術(shù)方案，前處理簡(jiǎn)單，通過(guò)萃取-吹干-復(fù)溶的過(guò)程，有效去除了干 擾物質(zhì)，使紅細(xì)胞中的二十二烷四烯酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性較強(qiáng)、適用于氣相色譜質(zhì)譜儀檢測(cè)的 二十二烷四烯酸甲酯產(chǎn)物；檢測(cè)方法的靈敏度高，特異性強(qiáng)，定性、定量功能強(qiáng)大，準(zhǔn)確性 好，并且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間短、檢測(cè)通量高。
[0010] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)溶液選自十七烷酸。除十七烷酸，外本發(fā)明還可以選用十五烷酸 或十九烷酸作為內(nèi)標(biāo)溶液。
[0011] 優(yōu)選地，所述萃取劑選自正己烷，所述復(fù)溶劑選自正己烷。使用正己烷作為萃取 劑，可以將各種脂肪酸的甲酯化產(chǎn)物萃取出來(lái)，萃取效率高且有效避免了其他物質(zhì)的干擾。
[0012] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)溶液與紅細(xì)胞的體積比為1 : (1~2);所述紅細(xì)胞、鹽酸-甲醇溶 液、萃取劑及復(fù)溶劑的體積比為1 :(1〇~25) :(20~50) :(4~10)。
[0013] 優(yōu)選地，所述紅細(xì)胞、鹽酸-甲醇溶液、萃取劑及復(fù)溶劑的體積比為1 :20 :40 :8。
[0014] 優(yōu)選地，所述極性色譜柱選自規(guī)格為20m*0. 20μm的極性毛細(xì)管色譜柱。
[0015] 優(yōu)選地，所述氣相色譜條件還包括：進(jìn)樣體積為WL，進(jìn)樣口溫度為220~230°C， 后運(yùn)行溫度為240~250 °C，后運(yùn)行時(shí)間為2min，吹掃流量為3. 0~5.OmL/min，總流量為 50. 0~60· 0mL/min，平均線速度為 35. 0~45·Ocm/s。
[0016] 優(yōu)選地，所述質(zhì)譜條件還包括：接口溫度為210~230°C;離子源溫度為220~240°C; 四極桿溫度為140~160°C，溶劑延遲時(shí)間為3. 0~4.Omin，全掃描范圍為m/z60. 00~450. 00。
[0017] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)方法還包括如下步驟：檢測(cè)結(jié)果的定性判斷和/或定量計(jì)算。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)全血樣 品紅細(xì)胞中二十二烷四烯酸的定性和定量檢測(cè)，具有前處理簡(jiǎn)單，有效去除了干擾物質(zhì)，靈 敏度高，特異性強(qiáng)，定性、定量功能強(qiáng)大，準(zhǔn)確性好，并且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間短、檢測(cè)通量高。
[0019] 本發(fā)明采用全掃描和選擇離子掃描同時(shí)進(jìn)行的掃描模式，能夠得到樣品的總離子 流色譜圖和選擇離子色譜圖，總離子流色譜圖可以用于對(duì)化合物進(jìn)行定性，用于檢測(cè)過(guò)程 中監(jiān)測(cè)出峰時(shí)間處的化合物是否為目標(biāo)化合物，以免出現(xiàn)其他干擾。此外，選擇離子掃描對(duì) 每個(gè)化合物的特征離子進(jìn)行掃描，解決了單獨(dú)使用氣相色譜對(duì)脂肪酸進(jìn)行定量不夠準(zhǔn)確的 問(wèn)題，進(jìn)一步提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度和方法的特異性。本發(fā)明所使用的極性色譜柱適合二十二 烷四烯酸的分離分析，色譜柱的高柱效以及低流失，大大降低了質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)的背景干擾，最 低檢出限達(dá)到了 〇.〇lmg/L，檢測(cè)靈敏度高。按本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間為 12min，與現(xiàn)有傳統(tǒng)方法相比，檢測(cè)時(shí)間短，儀器檢測(cè)通量高。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1二十二烷四烯酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021] 圖2全血紅細(xì)胞樣品中脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖。
[0022] 圖3全血紅細(xì)胞樣品中二十二烷四烯酸甲酯的選擇離子色譜圖。
[0023] 圖4全血紅細(xì)胞樣品中十七烷酸甲酯的選擇離子色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0025] 實(shí)施例一全血樣品的前處理 將抗凝全血樣本混勻，離心，棄除上層血漿、白細(xì)胞、血小板等；向剩余紅細(xì)胞中加入等 體積的生理鹽水，混勻后