特異性多肽探針修飾的金電極、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種特異性多肽探針修飾的金電極、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]精氨酸脫亞氨酶(PAD)是一種能夠催化蛋白質(zhì)分子中精氨酸殘基發(fā)生脫亞氨基作用并產(chǎn)生含瓜氨酸的蛋白質(zhì)的酶，它屬于水解酶類，通過水解作用產(chǎn)生的這一催化過程被稱為瓜氨酸作用。精氨酸脫亞氨酶屬于脒基轉(zhuǎn)移酶家族，廣泛分布于真核及原核生物中。目前，人體中PAD酶家族中的五種PAD酶已被廣泛識別，它們分布于不同的組織及細(xì)胞室中。其中，由于PAD4的特異性表達(dá)與多種疾病的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)，因而關(guān)于PAD4的研究報(bào)道很多。而PAD4與其他PAD酶亞型有著嚴(yán)格的同源序列，因而它的結(jié)構(gòu)及反應(yīng)機(jī)制可作為其他PAD家族酶類的研究模型。在許多人類疾病樣本內(nèi)都可以發(fā)現(xiàn)PAD4活性異常增高，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、阿茲海默綜合征、多發(fā)性硬化癥、狼瘡、帕金森綜合征甚至癌癥。其中，PAD4的特異性表達(dá)導(dǎo)致病變組織中非特異性蛋白的瓜氨酸化作用在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中具有重要意義。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性進(jìn)行性、以炎性滑膜炎為主的自身免疫性疾病，其特征是手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥，經(jīng)常伴有關(guān)節(jié)外器官受累及血清類風(fēng)濕因子陽性，可最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)周圍的軟骨的破壞畸形及功能喪失。這是在首先出現(xiàn)在40和60歲之間的患者中第二常見的關(guān)節(jié)炎癥狀。精氨酸脫亞氨酶4(PAD4)催化肽基精氨酸轉(zhuǎn)化為肽基瓜氨酸，與RA相關(guān)的PAD4基因突變已經(jīng)在相當(dāng)大的人群群體中被識別。RA病人能夠產(chǎn)生可以識別含有瓜氨酸的蛋白質(zhì)的自身抗體，而瓜氨酸化的蛋白水平與疾病的嚴(yán)重程度具有直接關(guān)聯(lián)，尤其在RA的形成階段，因而PAD4被廣泛認(rèn)為在RA的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。目前認(rèn)為，PAD4是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新靶酶，檢測PAD4酶活性是研究其早期診斷方法與篩選治療新藥的重要內(nèi)容之一。
[0003]早期檢測PAD4活性是利用二乙酰一肟比色法測定酶反應(yīng)產(chǎn)物瓜氨酸的含量，從而達(dá)到檢測PAD4酶活的目的。其優(yōu)點(diǎn)是能批量快速檢測，但是強(qiáng)酸性的反應(yīng)條件限制了其檢測限的降低，測定限大約為0.2nmol/L。之后發(fā)展的PAD4檢測技術(shù)如高壓液相層析法、連續(xù)分光光度監(jiān)測法、ABAP測定法、熒光標(biāo)記ABPP測定法等，各有優(yōu)點(diǎn)，但是也存在著諸如操作不易、耗資巨大、測定限不理想等弊端。近年來，伴隨著材料科學(xué)、表面技術(shù)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)等不同學(xué)科間的交叉深入，電化學(xué)技術(shù)正在不斷向前發(fā)展，其應(yīng)用范圍也更加廣泛，尤其在生命科學(xué)領(lǐng)域中，更是發(fā)揮了十分重要的作用。而其中，以生物電化學(xué)又尤為突出。它是生物學(xué)與電化學(xué)的交叉學(xué)科，主要研究在生命過程中的電化學(xué)現(xiàn)象以及外電場對不同生物體系的影響，旨在揭示基于分子水平或超微結(jié)構(gòu)水平的相關(guān)生物事件的本質(zhì)和規(guī)律。由于具有操作簡單，試驗(yàn)周期短，特異性高，重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)靈活等優(yōu)勢，生物電化學(xué)自出現(xiàn)以來就一直備受關(guān)注，如今更是成為研究的熱點(diǎn)。隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展以及醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、納米技術(shù)等更多現(xiàn)代學(xué)科的交叉融合，電化學(xué)將會在生命科學(xué)研究中占據(jù)越來越重要的份額。因此，本研究中我們提出了使用電化學(xué)檢測技術(shù)為表征手段的PAD4活性研究方案，以求達(dá)到成本更低、快速檢測的新方法的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在與提供一種特異性多肽探針修飾的金電極。
[0005]本發(fā)明的目的之二提供該金電極的制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的之三在于用該金電極以實(shí)現(xiàn)對肽酰精氨酸脫亞胺酶4的活性檢測及其抑制劑的篩選。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下機(jī)理:PAD4可以水解蛋白質(zhì)中的精氨酸(Arg)進(jìn)行脫亞氨基形成瓜氨酸，所以我們選擇合成了一段含有堿性氨基酸即精氨酸的肽段，序列為GRGAGRGAC。這段肽段的末端是含有巰基的半胱氨酸，因?yàn)閹€基與金發(fā)生Au-S鍵結(jié)合，使肽段可自組裝到金電極表面，另一方面由于肽段含有作為PAD4酶反應(yīng)位點(diǎn)的精氨酸短肽重復(fù)序列，因而在pH=6.0的條件下在溶液中解離出的氨基多于氨基酸所帶的羧基，所以當(dāng)肽段組裝修飾到金電極表面后，電極表面修飾上了一層帶正電荷的多肽層。在本實(shí)驗(yàn)的電化學(xué)檢測pH條件下(pH=6.0)，帶正電荷的肽段修飾的電極對同樣帶正電荷的電信號分子[Ru(NH3)5C1]2+有靜電排斥作用，因而捕捉的電信號較小。當(dāng)金電極表面修飾的帶有精氨酸的多肽與PAD4酶反應(yīng)后，精氨酸即被水解脫亞氨基成為中性的瓜氨酸，于是電極表面的正電荷減少，此時對電信號分子的靜電排斥作用減弱，因此，當(dāng)修飾肽段與PAD4反應(yīng)后，電信號相應(yīng)增大。
[0008]根據(jù)上述機(jī)理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種特異性多肽探針修飾的金電極，其特征在于該金電極的表面通過金-巰共價鍵的作用自組裝修飾有末端帶有半胱氨酸中段含有肽酰精氨酸脫亞胺酶底物的多肽序列，該多肽的序列為:GRGAGRGAC。
[0009]一種制備上述的特異性多肽探針修飾的金電極的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:將處理過的金電極置于0.5 M H2S04中，在0?1.6 V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速設(shè)置為100 mV/s，直至達(dá)到穩(wěn)定;金電極用超純水沖洗吹干后，浸沒在含多肽的電極修飾溶液中，4°C下靜置16小時后，再浸沒在1 mM巰基己醇水溶液中避光反應(yīng)1小時，用超純水沖洗，吹干，即得到多肽修飾的金電極;上述的含多肽的電極修飾溶液為20 mM pH 6.0的HEPES緩沖溶液中含有濃度為50 μΜ的多肽鏈、10 mM的TCEP。
[0010]上述的金電極的處理方法為:分別用3000目、5000目的砂紙上打磨5分鐘之后，用含有粒度分別為1 μπι、0.3 μ??、0.05 μπι的氧化鋁粉末的絲綢織物或麂皮上依次拋光至鏡面，然后在乙醇、超純水中依次超聲5分鐘，用氮?dú)獯蹈伞Ｈ缓笕饬蛩岷瓦^氧化氫按3:1的體積比組成的混合液即水虎魚溶液滴加到金電極表面反應(yīng)3分鐘，用超純水沖洗干凈，吹干。
[0011]一種肽酰精氨酸脫亞胺酶4的電化學(xué)檢測方法，采用上述的特異性多肽探針修飾的金電極作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑電極作為對電極，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.取精氨酸脫亞氨酶加入到50mM Tris-HCl, ImM CaCl2, pH 7.6的酶反應(yīng)液中形成一系列含精氨酸脫亞氨酶濃度在0.01 nM?50 nM范圍內(nèi)的反應(yīng)體系;將工作電極插入到該反應(yīng)體系中，在37° C金屬浴中反應(yīng)2h;
b.將經(jīng)步驟a處理的工作電極放置于由4.5mL 20mM pH 6.0 HEPES與0.5 mL 50 μΜ五氨合釕組成的檢測溶液中，利用三電極系統(tǒng)，以循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)，檢測釕信號，并在濃度0.01 nM?50 nM范圍內(nèi)，得到電流與PAD4濃度的線性關(guān)系曲線，其線性相關(guān)系數(shù)為0.997 ；
c.利用步驟b所得標(biāo)準(zhǔn)曲線法對待測液進(jìn)行分析檢測，分析精氨酸脫亞氨酶的含量。
[0012]本發(fā)明構(gòu)建了一種簡單、高效的肽酰精氨酸脫亞胺酶活性分析及抑制劑篩選的生物傳感器，利用功能化的多肽探針修飾的金電極與目標(biāo)蛋白酶反應(yīng)前后引起的電荷微環(huán)境變化，借助具有良好導(dǎo)電性的電信號分子[Ru (NH3) 5C1 ]2+對電極表面電荷變化的反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對肽酰精氨酸脫亞胺酶4活性的靈敏檢測。本發(fā)明以肽酰精氨酸脫亞胺酶4作為代表研究了其與多肽探針底物之間的相互作用，理論上可以推廣對其他可以造成電荷變化的小分子或多肽底物與靶蛋白相互作用進(jìn)行檢測。由于肽酰精氨酸脫亞胺酶4本身可以作為是一種檢測靶標(biāo)，用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的診斷和檢測，對疾病的臨床監(jiān)測提供技術(shù)支持，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明的方法原理圖。
[0014]圖2為裸電極、表面修飾50μΜ濃度多肽的修飾電極、修飾電極與50 nM的PAD4反應(yīng)2h，三種情況在濃度為50 μΜ [Ru(NH3)5C1]2+中循環(huán)伏安掃描圖。
[0015]圖3為不同濃度0-100nM PAD4存在情況下電化學(xué)信號的變化圖。其中內(nèi)嵌圖為蛋白質(zhì)濃度在0.01 nM到50 nM范圍內(nèi)與電化學(xué)信號變化值之間的線性關(guān)系圖。
[0016]圖4修飾有多肽底物的金電極分別于50 nM PAD4、1 μΜ BSA、1 μΜ ALP反應(yīng)2h的電化學(xué)信號。
[0017]圖5為不同濃度0、0.05、0.1、0.5、1、5μΜ的抑制劑CL-amidine與5 nM PAD4反應(yīng)后的電化學(xué)信號變化圖。其中內(nèi)嵌圖為抑制劑濃度在0.05 μΜ到5 μΜ范圍內(nèi)與電化學(xué)信號變化值之間的線性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例一:多肽探針修飾的