專利名稱：生物標志物表達的可再現量化的制作方法
生物標志物表達的可再現量化相關申請交叉引用本申請要求2008年9月16日申請的美國專利申請61/097，415的優(yōu)先權權益，其公開內容通過引用全部組合于此。
背景技術：
本發(fā)明涉及使用算法自動進行生物標志物表達分析的領域，以增強獨立于操作員的分析和化驗結果再現性從而在診斷化驗中更好地預測值。迄今為止，組織切片的生物標志物評估依賴于傳統(tǒng)的細胞化學和免疫組織化學 (IHC)技術，這些技術在大規(guī)模和大量化驗存在之前已得到大量發(fā)展。傳統(tǒng)方法的重大缺陷在于測試的主觀性質及缺乏標準化。盡管IHC測試已展現了臨床實用性(如Her2/ Here印Test)，但這些測試的值最近已表明受到進行測試的地點的影響。檢驗Her2測試的再現性的兩個最近的研究已表明在本地和中央實驗室測試之間可能有多達20%的誤差 (Perez et al.J.Clinic. One. (2006)24:3032-8 ；Paik S et al. Benefit from adjuvant trastuzumab may not be confined topatients with IHC 3+and/or FISH positive tumors =Central testing results fromNSABP B-31 (2007) 25 :511-22)。組織微陣列技術為組織試樣的大量分析提供機會(Konen，J. et al.，Nat. Med. 4 844-7(1998) ；Kallioniemi, 0. P. et al.，Hum. Mol. Genet. 10:657-62(2001) ；Rimm, D. L. et al. ,Cancer J. 7 :24-31 Q001))。例如，使用組織微陣列快速進行大規(guī)模研究的能力可為識別和確認藥品靶點、預斷標志(如雌激素受體(ER)和HER2/神經鞘)及候選療法提供關鍵 fn息ο本發(fā)明首次實現了原地生物標志物量化的全自動標準化，使得實驗室之間、機器之間、操作員之間及不同日期之間的染色變化最小。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及組織試樣、整個組織切片(WTQ及組織微陣列(TMA)的生物標志物表達的可再現量化，以減小多次試驗或多批之間因操作員、設備、設施及其它因素的差異引起的變化性。在此描述的系統(tǒng)和方法用得分的歸一化實現生物標志物的自動定位和量化從而在多次試驗之間具有更大的再現性，而與位置、操作員或儀器的變化無關。本發(fā)明的一實施例涉及在制作在載玻片上的組織試樣中可再現量化生物標志物表達的方法，包括(a)獲取制作在載玻片上的組織試樣，其已被染色以使能定位至少一細胞區(qū)室和至少一生物標志物；(b)使用包括光源的標準化光學系統(tǒng)獲取已染色組織試樣的一個或多個包含像素的圖像；(c)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分數據信號和噪聲；(d)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的數據信號；(e)可選地，自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于用于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的至少一生物標志物的數據信號； (f)量化表達在至少一細胞區(qū)室的每一細胞區(qū)室中的生物標志物的量；藉此制作在載玻片上的組織試樣中的生物標志物表達可再現地量化。在一實施例中，標準化光學系統(tǒng)包括其強度和光通路變化性已歸一化的光源。在另一實施例中，標準化光學系統(tǒng)允許自動調節(jié)曝光時間以優(yōu)化在圖像像素中捕獲的動態(tài)數據范圍。在一實施例中，每一自動分析步驟以無人監(jiān)督的方式進行。在一實施例中，對歸屬于兩個以上細胞區(qū)室的數據信號進行區(qū)分。在一實施例中，對表達在兩個以上細胞區(qū)室的每一細胞區(qū)室中的生物標志物的量進行量化。在一實施例中，以約95%的置信區(qū)間區(qū)分歸屬于兩個以上細胞區(qū)室的數據信號。在一實施例中，本發(fā)明方法還包括評估一個或多個制作在載玻片上的組織試樣或一個或多個包含像素的圖像或其一個或多個放大部分的質量。在一實施例中，本發(fā)明方法實現可再現割點確定。在一實施例中，對于每一試樣，本發(fā)明方法在批次之間實現85%以上的試樣分類一致性。在另一實施例中，對于每一試樣，本發(fā)明方法在批次之間實現90%以上的試樣分類
一致性。在一實施例中，本發(fā)明方法實現生物標志物表達的量化測量的再現性水平高于 80%。在另一實施例中，本發(fā)明方法實現生物標志物表達的量化測量的再現性水平高于 90%。在另一實施例中，本發(fā)明方法實現生物標志物蛋白質的量化測量的再現性水平高于 95%。在一實施例中，本發(fā)明方法實現生物標志物表達的量化測量的再現性水平落在約 90%到約97%的范圍中。在一實施例中，本發(fā)明方法實現生物標志物表達的量化測量的變化系數(％ CV) 低于20%。在另一實施例中，本發(fā)明方法實現生物標志物表達的量化測量的變化系數(％ CV)低于10%。在另一實施例中，本發(fā)明方法實現生物標志物表達的量化測量的變化系數 (%CV)低于5%。在另一實施例中，本發(fā)明方法實現生物標志物表達的量化測量的變化系數(％ CV)落在約4%到約7%的范圍中。在一實施例中，制作在載玻片上的組織試樣已用一種或多種試劑的最佳稀釋進行染色。在另一實施例中，最佳稀釋產生具有最佳動態(tài)范圍度量的一個或多個包含像素的圖像。在一實施例中，本發(fā)明方法由計算機實施。在另一實施例中，本發(fā)明致力于一種計算機可讀介質，該介質包括存儲于其上的、由處理器運行以執(zhí)行在此所述的方法的計算機可讀指令。在另一實施例中，本發(fā)明致力于攜載用于實施在此所述的方法的計算機可讀指令的電磁信號。本發(fā)明還致力于具有存儲于其上的計算機可讀指令的計算機可讀介質， 計算機可讀指令由處理器運行以執(zhí)行可再現量化制作在載玻片上的組織試樣中的生物標志物表達的方法，該方法包括(a)獲取制作在載玻片上的組織試樣的一個或多個包含像素的圖像，前述組織試樣已被染色以使能使用包括光源的標準化光學系統(tǒng)定位至少一細胞區(qū)室和至少一生物標志物；(b)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分數據信號和噪聲；(c)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的數據信號；及(d)量化表達在至少一細胞區(qū)室的每一細胞區(qū)室中的生物標志物的量；藉此制作在載玻片上的組織試樣中的生物標志物表達可再現地量化。在計算機可讀介質的優(yōu)選實施例中，存儲于其上并由處理器運行的計算機可讀指令還包括執(zhí)行在所述量化步驟之前具有下述可選步驟的方法的指令自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于用于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的至少一生物標志物的數據信號。在本發(fā)明的又一實施例中，用于可再現量化制作在載玻片上的組織試樣中的生物標志物表達的系統(tǒng)包括(a)配置成至少放大制作在載玻片上的組織試樣的一部分的一個或多個透鏡，所述組織試樣已被染色以使能定位至少一細胞區(qū)室和至少一生物標志物；(b) 標準化光學系統(tǒng)，包括與一個或多個透鏡光通信的光源和圖像傳感器，標準化光學系統(tǒng)獲取已染色組織試樣的一個或多個包含像素的圖像；(C)與標準化光學系統(tǒng)通信的處理器模塊，該處理器模塊配置成(i)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分數據信號和噪聲；(ii)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的數據信號；及(iii)量化表達在至少一細胞區(qū)室的每一細胞區(qū)室中的生物標志物的量；藉此制作在載玻片上的組織試樣中的生物標志物表達可再現地量化。 在該系統(tǒng)的優(yōu)選實施例中，處理器模塊還配置成可選地自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于用于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的至少一生物標志物的數據信號。該分析優(yōu)選在量化步驟(iii)之前進行。本發(fā)明的其它特征、目標和優(yōu)點可從下述附圖、詳細描述和強烈要求明顯看出。


圖1示出了可再現量化表達在制作在載玻片上的包含細胞的生物試樣如病人的組織試樣的一個或多個細胞組成的每一細胞組成中的生物標志物的量的過程。圖2示出了可再現量化表達在制作在載玻片上的包含細胞的生物試樣的一個或多個細胞組成的每一細胞組成中的生物標志物的量的圖像處理步驟的過程。圖3為按傳統(tǒng)IHC得分(χ軸)對543種情形分類的變換的HER2 AQUA 得分(y軸)的框式圖表，其中兼有AQUA 和IHC得分信息。用于跨所有類進行均值比較的單向ANOVA分析很有意義(P < 0. 001)。在此之后，對于多個比較使用Tamhane的T2統(tǒng)計量的分析表明每一類之間具有明顯差異(所有P值< 0. 05)。圖4A-C示出了對于583種情形比較跨儀器㈧、操作員⑶和染色批次(C)的歸一化Lc^2變換的HER2 AQUA 得分的框式圖表，其中指出了所有情形的平均<% CV。圖5A-C示出了 Kaplan-Meier 5年特定疾病的生存分析圖表，對于將簇群分為 HER2 低(84· 5% )和 HER2 高(I5· 5% )的儀器 1 HER2 AQUA 得分(A)的 X-tile 確定的割點，表明了累計生存17.8%的明顯降低[Monte Carlo P < 0. 001 ；培訓/確認P = 0.002]，即從75. 7降低到57.9%。該割點應用于儀器2(B)和儀器3 (C)，具有顯著性(分別為P < 0.001和P = 0.004)及等效曲線形狀和組成，對于儀器2[HER2低(83.6%)； HER2高(16.4% )；累計生存降低15.4%，即從75. 5降低到60. 1 % ]，及對于儀器3 [HER2 低(84.9% ) ；HER2高(14. 1% )；累計生存降低13. 5%，即從74. 9降低到61. 4% ]。圖6A-F示出了對于每一指出的儀器組(A、B)、操作員組(C、D)和批次組(E、F)， 基于為參考目的產生的X-tile割點(如儀器1)比較陽性(POS)和陰性(NEG)簇群分離的 2X2列聯表。還示出了 95%置信區(qū)間的總體一致性、陽性一致率和陰性一致率。
圖7A-C為分為陰性一致、陽性一致和不一致情形的頻率分布，以表明不一致出現在乳腺癌病例簇群內的哪里，其中㈧儀器2(AQUA 得分)對儀器1(割點)；(B)操作員2 (AQUA 得分)對操作員1 (割點)；及(C)批次2 (AQUA 得分)對批次ι (割點)。不一致的病例位于指出的割點中及附近，并不跨越整個分布。圖8A-D示出了 AQUA 分析和EGFR化驗的分析性能。㈧對于748個病例，跨3 天染色天數(D)、機器(M)和操作員(0)的HER2的log(2)變換的AQUA 得分的框式圖表，其中指出了 ％CV。(B)對跨3個載玻片和3天染色天數的乳腺腫瘤、正常和細胞系控制 (η = 152)的測試陣列產生的EGFRAQUA 得分的線性回歸分析，其中指出了平均R值和斜率。(C)來自⑶的40個腫瘤的EGFR的1呢2變換的AQUA 得分的框式圖表，其中指出了 ％ CV。(D)來自(B)的35個細胞系O倍冗余)的EGFR的1呢2變換的AQUA 得分的框式圖表，其中指出了 ％CV。圖9A-D示出了下面例4的結果。圖9A-C為來自三個病理學家的Allred得分相較于針對相同試樣產生的AQUA 得分的框式圖表。圖9D為表明每一病理學家的Allred 和AQUA 得分之間的關聯的表。圖10A-B示出了㈧基于AQUA 得分的病人分群；及⑶群組的生存，如例4中所述。圖IlA-B使用Allred得分㈧和AQUA 得分(B)比較特定疾病的五年生存。圖12A-B示出了由3位病理學家使用Allred計分方法讀同一 TMA載玻片確定的 ER表達得分的比較(A)，及由3臺PM-2000儀器讀同一 TMA載玻片確定的ER表達AQUA得分的比較(B)0
具體實施例方式除非另外定義，在此使用的所有技術和科學術語均具有與本發(fā)明所屬技術領域的一般技術人員通常理解一樣的含義。如本說明書及所附權利要求中使用的，單數形式“一” 及“該”包括多于一個的所提及對象，除非內容明確指示不同于此的含義。例如，提及“細胞”時包括兩個以上細胞的組合等。通常，在此使用的命名法及下述細胞生物學、免疫組織化學及成像(如細胞和組織)中的實驗室程序均眾所周知并在本領域普遍采用。應意識到，在此所示和描述的具體實施均為本發(fā)明的例子，并不意于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。此外，這些技術適合遠程會議、機器人視覺、無人駕駛車輛中的應用或任何其它類似的應用。適合在本發(fā)明中使用的技術也可在下述申請中找到2008年5月14日申請的 12/153，171,2008 年 6 月 13 日申請的 12/139，370,2008 年 8 月 5 日申請的 12/186，294, 2008年8月7日申請的12/188，133、及2008年8月四日申請的12/201，753，每一這些申請通過引用全部組合于此。圖1示出了可再現量化表達在制作在載玻片上的包含細胞的生物試樣如病人的組織試樣的一個或多個細胞組成的每一細胞組成中的生物標志物的量的過程。過程100開始步驟105為獲取已染色、制作在載玻片上的包含細胞的生物試樣，其中染色劑以使能定位至少一細胞區(qū)室和至少一生物標志物的方式施加。至少一細胞區(qū)室包括但不限于細胞質、細胞核和細胞壁。至少一生物標志物可包括經CY5熒光信號標記或檢測的生物標志物，用于檢測腫瘤細胞。例子包括但不限于HER2、ER、PR、EGFR、ERCCl、TS等。過程100繼續(xù)即步驟110，獲取已染色組織試樣的包含像素的圖像或一組圖像。包含像素的圖像或一組圖像可使用包括光源的標準化光學系統(tǒng)獲取，如光學顯微鏡系統(tǒng)。包含像素的圖像可通過使用數字圖像傳感器的標準化光學系統(tǒng)獲得，如數碼照相機。在一些實施例中，數字圖像可通過模擬照相機取得，其中所得到的模擬圖像或膠卷通過數字掃描儀或等效裝置數字化。在至少部分實施例中，照相機可直接或間接安裝到顯微鏡上以獲取顯微照片形式的包含像素的圖像。作為備選或除此之外，照相機可依賴于到現有成像系統(tǒng)上的視頻輸出線的直接連接。在一些實施例中，光源包括具有可見光譜、紅外(IR)光譜和紫外(UV)光譜中的一個或多個的波長的光。照相機可以是視頻攝像機或延時攝影序列，提供包含動態(tài)細胞活動的實時及消逝時間的圖像。由過程100獲得的包含像素的圖像接著在步驟115進行分析以從圖像像素導出一個或多個數據集以區(qū)分數據信號和噪聲。該分析可自動進行，例如使用處理器進行。處理器可包括一個或多個計算機處理器，可根據預編程的指令集進行控制。在一些實施例中，區(qū)分數據信號和噪聲包括信號的統(tǒng)計分析，例如導致具有信號的像素與具有歸屬于噪聲的信號的像素分離的無人監(jiān)督的聚類分析。在一些實施例中，區(qū)分數據信號和噪聲可包括將制作在載玻片上的組織試樣的聚焦圖像從制作在載玻片上的組織試樣的散焦圖像減去而實現。 在一些實施例中，散焦圖像可包括剛好在制作在載玻片上的組織試樣下面聚焦的圖像。通常，使圖像散焦相當于空間低通濾波器，使能進行數據信號可與其比較的背景測量。接下來，由過程100獲得的包含像素的圖像在步驟120進行分析以從圖像像素導出一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的數據信號。該分析也可自動進行，例如使用預編程的計算機或專用特殊用途處理器。在一些實施例中，分化可能取決于歸屬于施加到制作在載玻片上的試樣的標志物或染色劑的熒光。在一些實施例中，致力于至少一細胞區(qū)室的染色劑的熒光的波長變化。在一些實施例中，藍色熒光可與細胞核受體(DAPI)相關聯，綠色熒光可與細胞質受體(細胞角蛋白)相關聯，及紅色熒光可與細胞膜受體(α-連結蛋白)相關聯。優(yōu)選地，染色劑按使能定位至少一細胞區(qū)室和至少一生物標志物的方式施加。在一些實施例中，前面在步驟105中描述的至少一生物標志物用于檢測腫瘤細胞或目標蛋白質或目標抗原并可以是制作在載玻片上的組織試樣中的腫瘤細胞的指示。過程100包括使先前分化的歸屬于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的數據信號與所檢測的腫瘤細胞或腫瘤罩相關聯的步驟。這樣，在步驟125，自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于用于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的至少一生物標志物的數據信號。在過程 100的步驟130，可再現地量化表達在制作在載玻片上的組織試樣的至少一細胞區(qū)室中的生物標志物的量。圖2示出了可再現量化表達在制作在載玻片上的試樣的一個或多個細胞組成的每一細胞組成中的生物標志物的量的圖像處理步驟的詳細過程200。過程200以步驟205 開始，獲取已染色組織試樣的數字圖像。數字圖像按與方法100中步驟105、110中所描述類似的方式獲取。接著，過程200進行步驟210、215和220，測試在信號完整性、試樣完整性和圖像完整性方面的圖像質量。如果信號完整性、試樣完整性和圖像完整性中的任一或多個圖像質量測試失敗，則分析時去除該數字圖像，或作上標記以由操作員在步驟225人工查看該數字圖像并決定在分析時接受該數字圖像或在步驟2 去除該數字圖像。通過信號完整性、試樣完整性和圖像完整性的圖像質量測試或通過數字圖像的人工查看將數字圖像確定為候選圖像以進一步在過程200中進行圖像處理。未能通過信號完整性、試樣完整性和圖像完整性中的任一或多個的圖像質量測試或未能通過數字圖像的人工查看將數字圖像確定為低質量，并拒絕該數字圖像。簡言之，信號完整性包括細胞區(qū)域化、熒光強度和飽和像素百分比估計。飽和可通過確定包含像素的圖像中的預定數量的像素由包括最大或接近最大的值的數據和數據結構表示進行估計。試樣完整性包括確定存在足夠的感興趣試樣(如腫瘤組織)用于分析。圖像完整性包括檢測任何散焦圖像，在TMA 的情形下，分析和檢測任何裂開圖像。在本發(fā)明已結合其具體實施例進行描述的同時，應當理解，其能夠進行進一步的修改。此外，本申請意于覆蓋本發(fā)明的任何變化、使用或調整，包括落在本發(fā)明所屬技術領域的已知或通常實踐內及落在所附權利要求的范圍內的本發(fā)明派生技術方案。在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用組合于此，就像特別及個別指出每一個別出版物、專利或專利申請以通過引用進行組合一樣。1、試樣任何包含細胞的試樣均可由本發(fā)明方法進行分析。例如，試樣可從病人收集的組織準備。作為備選，試樣可以是包含細胞的生物試樣如血液試樣、骨髓試樣或細胞系。試樣可以是整個組織或顯微鏡載玻片上的TMA切片。具體地，當使用組織微陣列(TMA)時，試樣可在載玻片上排列為“斑”或“組織斑”，每一組織斑對應于特定試樣。這些準備制作在載玻片上的組織試樣的方法在本領域眾所周知并適合在本發(fā)明中使用。2、生物標志物如在此使用的，生物標志物是可在生物試樣中進行測量的分子，其為組織類型、正?；虿≡^程、或對治療干預的反應的指示。在特定實施例中，生物標志物選自下組蛋白質、肽、核酸、脂質及碳水化合物。更具體地，生物標志物可以是蛋白質。某些標志物為特定細胞的性狀，同時其它標志物已確定與特定疾病或情況相關聯。已知預斷標志物的例子包括生化酶標志物，例如半乳糖基轉移酶II、神經元特異性烯醇化酶、質子ATP酶、及酸性磷酸酶。激素或激素受體標志物包括人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促腎上腺皮質激素、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、雌激素受體、孕酮受體、雄激素受體、gClq-R/p33補體受體、IL-2受體、p75神經營養(yǎng)蛋白受體、PTH受體、甲狀腺激素受體、及胰島素受體。淋巴標志物包括α -1-抗胰糜蛋白酶、α -1-抗胰蛋白酶、B細胞標志物、bcl_2、 bcl-6、B淋巴細胞抗原36kD、BMl (骨髓標志物)、BM2 (骨髓標志物)、半乳糖凝集素_3、顆粒酶B、HLA I類抗原、HLA II類(DP)抗原、HLA II類(DQ)抗原、HLA II類(DR)抗原、人中性粒細胞防御素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白Μ、κ輕鏈、λ 輕鏈、淋巴細胞/組織細胞抗原、巨噬細胞標志物、胞壁質酶(溶菌酶)、Ρ80間變型淋巴瘤激酶、漿細胞標志物、分泌性白細胞蛋白酶抑制因子、T細胞抗原受體(JOVIl)、T細胞抗原受體(J0VI3)、末端脫氧核苷酸轉移酶、未分類B細胞標志物。腫瘤標志物包括α胎蛋白、載脂蛋白D、BAG-I (RAP46蛋白)、CA19_9(唾液酸路易士)、CA50 (癌相關的粘蛋白抗原)、CA125 (卵巢癌抗原)、CA242 (腫瘤相關的粘蛋白抗原)、嗜鉻粒蛋白A、簇蛋白(載脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮相關的抗原、上皮特異性抗原、表皮生長因子受體、雌激素受體(ER)、大囊腫病液體蛋白-15、肝細胞特異性抗原、HER2、 heregulin、人胃粘蛋白、人乳脂肪球、MAGE-1、基質金屬蛋白酶、黑色素A、黑色素瘤標志物 (HMB45)、間皮蛋白、金屬硫蛋白、小眼轉錄因子(MITF)、Muc-I核糖蛋白、Muc-I糖蛋白、 Muc-2糖蛋白、Muc-5AC糖蛋白、Muc-6糖蛋白、髓過氧物酶、Myf_3 (橫紋肌肉瘤標志物)、 Myf_4(橫紋肌肉瘤標志物)、MyoDl (橫紋肌肉瘤標志物)、肌紅蛋白、nm23蛋白、胎盤堿性磷酸酶、前清蛋白、孕酮受體、前列腺特異性抗原、前列腺酸性磷酸酶、前列腺抑制肽、PTEN、 腎細胞癌標志物、小腸粘蛋白抗原、四聯凝集素、甲狀腺轉錄因子-1、基質金屬蛋白酶1的組織抑制因子、基質金屬蛋白酶2的組織抑制因子、酪氨酸酶、酪氨酸酶有關的蛋白-1、絨毛蛋白、血管性血友病因子、CD34、CD34、II 類，CD51 Ab-I、CD63、CD69、Chkl、Chk2、claspin C-met、C0X6C、CREB、細胞周期蛋白D1、細胞角蛋白、細胞角蛋白8、DAPI、結蛋白、DHP(1， 6-二苯基-1，3，5-己三烯)、上皮鈣粘蛋白、EEA1、EGFR、EGFRvIII、EMA(上皮膜抗原)、 ER、ERB3、ERCCl、ERK、E-選擇蛋白，FAK、纖連蛋白、F0XP3、γ -Η2ΑΧ、GB3、GFAP、穿膜蛋白、 GM130、外周蛋白 97、GRB2、GRP78BiP、GSK3 β、HER-2、組蛋白 3、組蛋白 3_K14_Ace[乙?；M蛋白H3(賴氨酸14)抗體]、組蛋白3_K18-Ace [組蛋白H3-賴氨酸乙?；?8]、組蛋白3_ K27-TriMe [組蛋白H3 (三甲基K27)]、組蛋白3_K4_diMe [ 二甲基組蛋白H3 (賴氨酸4)抗體]、組蛋白3_K9-Ace[乙?；M蛋白H3(賴氨酸9)]、組蛋白3_K9_triMe [組蛋白3-三甲基賴氨酸9]、組蛋白3_S10-Phos [組蛋白H3磷酸化(Ser 10)抗體，有絲分裂標志物]、組蛋白4、組蛋白H2A.X_S139-Phos [組蛋白H2A. X磷酸化(Ser 139)抗體]、組蛋白H2B、二甲基組蛋白 H3 (K4)、三甲基組蛋白 H4(K20-Chip 級)、HSP70、尿激酶、VEGF Rl、ICAM-I、IGF-I、 IGF-1R、IGF-1 受體 β、IGF-II、IGF_IIR、IKB-α IKKE、IL6、IL8、整聯蛋白 α νβ 3、整聯蛋白 α νβ 6、整聯蛋白α V/⑶51、整聯蛋白Β5、整聯蛋白Β6、整聯蛋白Β8、整聯蛋白β 1 (⑶四)、 整聯蛋白β 3、整聯蛋白0 5整聯蛋白86、頂5-1、叫86(11、蛋白激酶(^2抗體、^^ -1、 輕鏈 Ab-4(雞尾酒)、λ 輕鏈、κ 輕鏈、Μ6Ρ、Mach2、ΜΑΡΚΑΡΚ-2、ΜΕΚ1、MEKl/2(Ps222)、 MEK2、MEK1/2 (47E6)、MEK1/2 封閉肽、MET/HGFR、MGMT、線粒體抗原、Mitotracker 綠 FM、 MMP-2、MMP9、E-鈣粘附蛋白、mTOR、ATP酶，N-鈣粘附蛋白、腎病蛋白、NFKB、NFKB ρ 105/p50、 NF-KB P65、Notchl、Notch2、Notch3、OxPhos 絡合物 IV、pl30Cas、p38MAPK、p44/42 MAPK 抗體、P504S、P53、P70、P70S6K、廣譜鈣粘附蛋白、樁蛋白、P-鈣粘附蛋白、PDI、pEGFR、磷酸化AKT、磷酸化CREB、磷酸化EGF受體、磷酸化GSK3 β、磷酸化Η3、磷酸化HSP-70、磷酸化 ΜΑΡΚΑΡΚ-2、磷酸化ΜΕΚ1/2、磷酸化p38 MAP激酶、磷酸化p44/42 MAPK、磷酸化p53、磷酸化 H(C、磷酸化S6核糖蛋白、磷酸化Src、磷酸化Akt、磷酸化Bad、磷酸化IKB_a、磷酸化mTOR、 磷酸化NF- κ Bp65、磷酸化p38、磷酸化p44/42 MAPK、磷酸化p70 S6激酶、磷酸化Rb、磷酸化Smad2、PIM1、PIM2、PKC β、足細胞標志蛋白、PR、PTEN、Rl、Rb 4H1、R-鈣粘附蛋白、核糖核苷酸還原酶、RRMl、RRMl 1、SLC7A5、NDRG, HTF9C、HTF9C、CEACAM、p33、S6 核糖蛋白、Src、 存活素、突觸足蛋白、多配體聚糖4、踝蛋白、Tensin、胸苷酸合酶、Tuberlin、VCAM-l、VEGF、 波形蛋白、凝集素、YES、ZAP-70及Ζ^。 細胞周期相關的標志物包括凋亡蛋白酶活化因子-1、bcl-w, bcl-x、溴脫氧尿苷、 CAK(cdk活化激酶)、細胞凋亡敏感性蛋白(CAQ、半胱氨酸蛋白酶2、半胱氨酸蛋白酶8、 CPP32 (半胱氨酸蛋白酶3)、細胞周期蛋白依賴激酶、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白Bi、細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白D2、細胞周期蛋白D3、細胞周期蛋白E、細胞周期蛋白G、DNA
10片段裂解因子(^末端)、!^8(0)95)、？￡18相關的死亡結構域蛋白1￡18配體1611-1、1 0-38、 Mcl-1、微小染色體維持蛋白、錯配修復蛋白(MSffi)、聚(ADP核糖)聚合酶、增生細胞核抗原、P16蛋白、p27蛋白、p3kdc2、p57蛋白(Kip2)、pl05蛋白、Stat 1 alpha、拓撲異構酶 I、拓撲異構酶Π α、拓撲異構酶III α、拓撲異構酶II β。神經系統(tǒng)組織和腫瘤標志物包括α B晶體蛋白、α介連蛋白、α核突觸蛋白、淀粉樣前體蛋白、β淀粉樣蛋白、鈣結合蛋白、膽堿乙酰轉移酶、谷氨酸轉運蛋白1、GAP43、神經膠質纖維酸性蛋白、谷氨酸受體2、髓磷脂堿性蛋白、神經生長因子受體(gp75)、成神經細胞瘤標志物、神經絲68kD、神經絲160kD、神經絲200kD、神經特異性烯醇化酶、煙堿型乙酰膽堿受體α 4、煙堿型乙酰膽堿受體日2、外周蛋白、蛋白基因產品9、5-100蛋白、5-羥色胺、SNAP-25、突觸蛋白I、突觸素τ、色氨酸羥化酶、酪氨酸羥化酶、泛素。簇群區(qū)分標志物包括CDla、CDlb, CDlc, CDld, CDle, CD2、CD3 δ、CD3 ε、CD3 γ、 CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8 3、CD9、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、CDwl2、CD13、CD14、CD15、 CD15s、CD16a、CD16b、CDwl7、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、 CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34,CD35,CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a, CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、 CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、 CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、 CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79a、CD79b、CD80、 CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CDw93、CD94、 CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CDlOU CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、 CD107b、CDw 108, CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDwll9、CD120a、CD 120b, CD121a、 CDwl21b、CD122、CD123、CD124、CDwl25、CD126、CD127、CDw 128a, CDw 128b, CD130、CDwl31、 CD132、CD134、CD135、CDwl36、CDwl37、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、 CD144、CDw 145, CD146、CD147、CD148、CDw 149, CDw 150, CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、 CD156、CD157、CD158a、CD 158b, CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、及 TCR- ζ。其它細胞標志物包括著絲粒蛋白F(CENP-F)、巨蛋白、內皮蛋白、核纖層蛋白 A&C [ΧΒ10]、LAP-70、粘蛋白、核孔復合蛋白、ρ180片狀體蛋白、ran、r、組織蛋白酶D、Ps2蛋白、Her2-神經鞘、P53、SlOO、上皮標志物抗原(EMA)、TdT、MB2、MB3、PCNA 和 Ki67。3、組織染色包含細胞的試樣可使用任何試劑或生物標志物標簽進行染色，如與特定生物標志物或與各種類型的細胞或細胞區(qū)室直接反應的染料或染色劑、組織化學制品、或免疫組織化學制品。并非所有染色劑/試劑均適合。因此，采用的染色劑的類型及其施加順序應進行適當考慮，但本領域技術人員可容易地確定。前述組織化學制品可以是可由透射顯微鏡法檢測的生色團或可由熒光顯微鏡法檢測的熒光團?？偟膩碚f，包含試樣的細胞可用包括至少一組織化學制品的溶液孵育，其將與目標的化學基直接反應或結合。一些組織化學制品必須用媒染劑或金屬共同孵育以使能染色。包含細胞的試樣可用對感興趣成分染色的至少一組織化學制品和用作復染劑并結合感興趣成分外面區(qū)域的另一組織化學制品的混合物進行孵育。作為備選，多個探針的混合物可在染色時使用，并提供識別特定探針的位置的方式。對包含細胞的試樣進行染色的過程在本領域眾所周知。
下述非限制性的列表提供可用作組織學成像劑(染色劑或復染劑)的示例性生色團及其目標細胞、細胞區(qū)室或細胞組分曙紅(堿性細胞組分、細胞質)、蘇木精(核酸)、橘黃G (紅色血液、胰、及垂體細胞)、亮綠SF (膠原)、Romanowsky-GiemsW整體細胞形態(tài))、 May-Grunwald(血液細胞)、藍色復染劑(Trevigen)、乙基綠(CAS)(淀粉樣蛋白)、福爾根-萘酚黃S(DNA)、GiemSa(對不同細胞區(qū)室進行差異著色)、甲基綠(淀粉樣蛋白)、派洛寧(核酸)、萘酚黃(紅血細胞)、中性紅(核)、巴氏(Papanicolaou)染色劑(通常包括蘇木精、曙紅Y、橘黃G和Bismarck褐的混合物)(整體細胞形態(tài))、紅色復染劑B (Trevigen)、 紅色復染劑C(Trevigen)、天狼星紅(淀粉樣蛋白)、福爾根試劑(對品紅)(DNA)、倍花青鉻明礬(DNA)、倍花青鉻明礬和萘酚黃S (DNA)、甲基綠-派洛寧Y (DNA)、硫堇-福爾根試劑 (DNA)、吖啶橘黃(DNA)、亞甲基藍(RNA和DNA)、甲苯胺藍(RNA和DNA)、阿爾新藍(碳水化合物)、釕紅(碳水化合物)、蘇丹黑(類脂)、蘇丹IV(類脂)、油紅-0(類脂)、Van Gieson 三色染色劑(酸性品紅和苦味酸混合物)(肌肉細胞)、Masson三色染色劑(蘇木精、酸性品紅和淺綠混合)(對膠原、細胞質、細胞核進行不同地著色)、醛品紅(彈性蛋白纖維)、 及Weigert染色劑(區(qū)分網狀和膠原纖維)。前述染色劑的綜合列表、其描述及一般用途在 R. D. Lillie, "Conn' sBiological Stains，，,8th ed·,Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md. (1969)中給出。前述適當的媒染劑及成分為本領域技術人員眾所周知。下述非限制性列表提供了示例性的熒光組織染色劑及其適用的目標細胞、細胞區(qū)室或細胞組分4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(核酸)、曙紅(堿性細胞組分、細胞質)、Hoechst 33258和Hoechst 33M2 (兩種雙苯甲亞胺)(核酸)、碘化丙啶(核酸)、光譜橘黃(核酸)、光譜綠(核酸)、喹吖因(核酸)、熒光素-鬼筆環(huán)肽(肌動蛋白纖維)、色霉素A3(核酸)、吖啶黃素-福爾根反應(核酸)、金胺O-福爾根反應(核酸)、溴化乙啶 (核酸)、Nissl染色劑(神經元)、高親和力DNA熒光團如POPO、BOBO、YOYO和Τ0Τ0等、熔合到結合蛋白的綠色熒光蛋白，如組蛋白、ACMA、喹吖因和吖啶橘黃。大量專有熒光細胞器專用探針可通過商業(yè)途徑獲得，并包括線粒體專用探針 (MitoFluor 和 MitoTracker 染料)、內質網胃(ER)和 Golgi 探針(ER-Tracker 及各種神經酰胺共軛物)、及溶酶體探針(LysoTracker染料)。這些探針及許多非專有的熒光組織化學制品在可從俄勒岡州Eugene的MolecularProbes獲得的Handbook of Fluorescent Probes and Research Products 8th Ed. (2001)中描述。每一包含細胞的試樣可用適當的酶培養(yǎng)基共同孵育，其為感興趣的細胞組分及在酶活動場所產生彩色沉淀物的適當試劑。前述酶組織化學染色劑專用于特定目標酶。用酶組織化學染色劑染色可用于確定細胞組分或特定類型的細胞。作為備選，酶組織化學染色劑可在診斷上用于測細胞中酶活性的量。多種酶培養(yǎng)基和檢測化驗在本領域眾所周知。酸性磷酸酶可通過幾種方法進行檢測。在用于酸性磷酸酶的Gomori方法中，細胞制備用甘油磷酸鹽和硝酸鉛孵育。酶使磷酸鹽游離，其與鉛結合以產生磷酸鉛，一種無色沉淀物。之后，將組織浸入硫化銨溶液中，其與磷酸鉛反應以形成硫化鉛，一種黑色沉淀物。作為備選，細胞可用包括pararosanilin-HCl、亞硝酸鈉、萘酚ASBl磷酸鹽(培養(yǎng)基)及醋酸佛羅那緩沖液的溶液孵育。該方法在酸性磷酸酶活動區(qū)域產生紅色沉淀物。由于酸性磷酸酶的特性含量，溶酶體可通過使用該化驗與其它細胞質顆粒和細胞器區(qū)分開。脫氫酶可通過用適于脫氫酶和四唑的種的培養(yǎng)基孵育細胞而進行定位。酶將氫子從培養(yǎng)基轉移到四唑，將四唑還原為甲臢，一種黑色沉淀物。例如，NADH脫氫酶是呼吸鏈的絡合物I的組分并主要定位到線粒體。針對其已開發(fā)眾所周知的染色技術的其它酶及其主要細胞位置或活動包括但不限于ATP酶(肌纖維)、琥珀酸鹽脫氫酶(線粒體)、細胞色素c氧化酶(線粒體)、磷酸化酶(線粒體)、磷酸果糖激酶(線粒體)、乙酰膽堿酯酶(神經細胞)、乳糖分解酵素(小腸)、白氨酸氨肽酶(肝細胞)>myodenylate脫氨酶(肌細胞),NADH心肌黃酶(紅細胞)、 及蔗糖酶(小腸)。免疫組織化學是最敏感和特殊的組織化學技術之一。每一試樣t可與包括特別結合的探針的示蹤結合成分組合?？刹捎枚喾N標記，如熒光團、或產生吸收光或發(fā)熒光產物的酶。大量標記已知可用于與單一結合事件有關的強信號。在染色時使用的多個探針可用一個以上可區(qū)別的熒光標記進行標記。這些顏色區(qū)別提供識別特定探針的位置的方式。制備熒光團和蛋白質的共軛物如抗體的方法在文獻中廣泛描述，因而不需要在此進行例證。盡管有至少120，000種商用抗體，示例性的主要抗體，其已知特別結合細胞組成且目前用為用于研究的免疫組織化學染色劑中的組分及在有限情形下用于診斷各種疾病， 包括雌激素受體抗體(乳腺癌)、孕酮受體抗體(乳腺癌)、P53抗體(多種癌)、Her-2/neU 抗體(多種癌)、EGFR抗體(上皮生長因子，多種癌)、組織蛋白酶D抗體(乳腺及其它癌)、 Bcl-2抗體(凋亡細胞)、E-鈣粘蛋白抗體、CA125抗體(卵巢及其它癌)、CA15_3抗體(乳腺癌)、CA19-9抗體(結腸癌)、c-erbB-2抗體、P-糖蛋白抗體(MDR，多抗藥性)、CEA抗體 (癌胚抗原)、視網膜母細胞瘤蛋白(Rb)抗體、ras oneoprotein(p21)抗體、Lewis X(也稱為⑶15)抗體、Ki-67抗體(細胞增殖)、PCNA(多種癌)抗體、⑶3抗體(T細胞)、⑶4抗體 (協(xié)助T細胞)、CD5抗體(T細胞)、CD7抗體(胸腺細胞、未成熟的T細胞、NK殺傷細胞)、 ⑶8抗體(抑制基因T細胞)、⑶9/p24抗體(ALL)、⑶10 (也稱為CALLA)抗體(急性淋巴細胞白血病)、CDllc抗體(單核細胞、粒細胞、AML)、CD13抗體(髓樣單核細胞、AML)、CD14抗體(成熟的單核細胞、粒細胞)、⑶15抗體(Hodgkin病)、⑶19抗體(B細胞)、⑶20抗體(B 細胞)、⑶22抗體(B細胞)、⑶23抗體(活性B細胞、CLL)、⑶30抗體(活性T和B細胞、 Hodgkin病)、⑶31抗體(血管發(fā)生標志物)、⑶33抗體(骨髓細胞、AML)、⑶34抗體(內皮干細胞、間質瘤)、CD35抗體(樹突細胞)、CD38抗體(漿細胞、活性T、B和骨髓細胞)、 ⑶41抗體(血小板、巨核細胞)、LCA/⑶45抗體(白細胞通用抗原)、⑶45R0抗體(協(xié)助、誘導T細胞)、⑶45RA抗體(B細胞)、⑶39，⑶100抗體、⑶95/Fas抗體(細胞凋亡)、⑶99抗體(Ewings肉瘤標志物、MIC2基因產品)、⑶106抗體(VCAM-1、活性內皮細胞)、泛素蛋白抗體(Alzheimer病)、CD71(運鐵蛋白受體)抗體、c-myc (腫瘤蛋白和半抗原)抗體、細胞角蛋白(運鐵蛋白受體)抗體、波形蛋白(內皮細胞)抗體(B和T細胞)、HPV蛋白(人乳頭狀瘤病毒)抗體、κ輕鏈抗體(B細胞)、λ輕鏈抗體(B細胞)、黑素體(HMB^)抗體(黑素瘤)、前列腺特異性抗原(PSA)抗體(前列腺癌)、S_100抗體(黑素瘤、salvary、神經膠質細胞)、τ抗原抗體(Alzheimer病)、纖維蛋白抗體(上皮細胞)、角蛋白抗體、細胞角蛋白抗體(腫瘤)、α-連環(huán)蛋白抗體(細胞膜)、Τη_抗原抗體(結腸癌、腺癌和胰腺癌)、1， 8-ANS(l-苯胺萘-8-磺酸)抗體、C4抗體、2C4 CASP級抗體、2C4 CASPa抗體、HER-2抗體、 a B晶體蛋白抗體、α半乳糖苷酶A抗體、a -連環(huán)蛋白抗體、人VEGF Rl(Flt-I)抗體、整聯蛋白B5抗體、整聯蛋白0 6抗體、磷酸化5此原癌基因抗體、8吐抗體、8(^-2抗體、8(^-6抗體、β-Catanin抗體、β-連環(huán)蛋白抗體、整聯蛋白0\^3抗體工ErbB-2 Ab_12抗體、鈣連蛋白抗體、鈣網蛋白抗體、CAM5. 2(低摩爾重量細胞角蛋白抗體)抗體、Cardiotin(R2G) 抗體、組織蛋白酶D抗體、雞多克隆半乳糖苷酶α抗體、c-Met抗體、CREB抗體、C0X6C抗體、細胞周期蛋白Dl Ab-4抗體、細胞角蛋白抗體、結蛋白抗體、DHP(l-6 二苯基-1，3，5-己三烯)抗體；DSB-X生物素化羊抗雞抗體、E-鈣粘蛋白抗體、EEAl抗體、EGFR抗體、EMA (上皮膜抗原)抗體、ER(雌激素受體)抗體、ERB3抗體、ERCCl ERK (Pan ERK)抗體、E-選擇蛋白抗體、FAK抗體、纖連蛋白抗體；FITC-羊抗鼠IgM抗體、F0XP3抗體、GB3抗體、GFAP (膠質纖維酸性蛋白)抗體、巨蛋白抗體、GM130抗體、羊a h Met抗體、高爾基體蛋白97抗體、 GRB2抗體、GRP78BiP抗體、GSK-3 β抗體、肝細胞抗體、HER-2抗體、HER-3抗體、組蛋白3抗體、組蛋白4抗體、組蛋白Η2Α X抗體、組蛋白Η2Β抗體、HSP70抗體、ICAM-I抗體、IGF-I抗體、IGF-I受體抗體、IGF-I受體β抗體、IGF-II抗體、1KB- α抗體、IL6抗體、IL8抗體、整聯蛋白β 3抗體、整聯蛋白β 5抗體、整聯蛋白b8抗體、Jagged 1抗體、蛋白激酶C0 2抗體、LAMP-I抗體、M6P (甘露糖6-磷酸鹽受體)抗體、MAPKAPK-2抗體、MEKl抗體、MEK2抗體、線粒體抗原抗體、線粒體標志物抗體、Mitotracker綠FM抗體、MMP-2抗體、MMP9抗體、 Na+/K ATP酶抗體、Na+/K ATP酶α 1抗體、Na+/K ATP酶α 3抗體、N-鈣粘蛋白抗體、去氧腎上腺素抗體、NF-p50抗體、NF-P65抗體、Notch 1抗體、OxPhos絡合物IV_Alexa488偶聯抗體、pl30Cas 抗體、P38 MAPK 抗體、p44/42 MAPK 抗體、P504S Clone 13H4 抗體、P53 抗體、P70 S6K抗體、P70磷酸化激酶封閉肽抗體、廣譜鈣粘蛋白抗體、樁蛋白抗體、P-鈣粘蛋白抗體、PDI抗體、磷酸化AKT抗體、磷酸化CREB抗體、磷酸化GSK-3- β抗體、磷酸化Η3抗體、磷酸化ΜΑΡΚΑΡΚ-2抗體、磷酸化MEK抗體、磷酸化p44/42 MAPK抗體、磷酸化ρ53抗體、 磷酸化NF-p65抗體、磷酸化p70 S6激酶抗體、磷酸化PKC (廣譜)抗體、磷酸化S6核糖體蛋白抗體、磷酸化Src抗體、磷酸化Bad抗體、磷酸化HSP27抗體、磷酸化IKB_a抗體、磷酸化P44/42 MAI3K抗體、磷酸化p70 S6激酶抗體、磷酸化Rb (Ser807/811)(視網膜母細胞瘤) 抗體、磷酸化HSP-7抗體、磷酸化p38抗體、Pim-I抗體、Pim_2抗體、PKC^抗體、PKC^ 11 抗體、足細胞標志蛋白抗體、I3R抗體、PTEN抗體、Rl抗體、Rb 4H1(視網膜母細胞瘤)抗體、 R-鈣粘蛋白抗體、RRMl抗體、S6核糖體蛋白抗體、S-100抗體、足細胞骨架蛋白抗體、多配體蛋白聚糖4抗體、Talin抗體、Tensin抗體、Tuberlin抗體、尿激酶抗體、VCAM-I抗體、VEGF 抗體、波形蛋白抗體、ZAP-70抗體、及^B。 可與主要抗體偶聯的熒光團包括但不限于熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、Cy2、 Cy3、Cy5、VECTOR 紅、ELF (酶標記的熒光)、CyO, CyO. 5、CyU Cyl. 5、Cy3、Cy3. 5、Cy5、 Cy7、FluorX、鈣黃綠素、鈣黃綠素-AM、CRYPT0FLU0R 、橘黃(42kDa)、橘紅(35kDa)、金 (3IkDa)、紅(42kDa)、深紅(40kDa)、BHMP、BHDMAP、Br-Oregon、Lucifer 黃、Alexa染料系列、 N-W-(7-硝基苯-2-草酸-1，3-重氮-4-基)氨基]己酰](NBD)、B0DIPY 、氟化硼絡合二吡咯甲川、Oregon 綠、MIT0TRACKER 紅、DiOC7 (3)、DiIC18、藻紅蛋白、藻膽蛋白、BPE (240kDa)、 RPE(MOkDa)、CPC(264kDa),APC(104kDa)、光譜藍、光譜淺綠、光譜綠、光譜金、光譜橘黃、光譜紅、NADH、NADPH、FAD、紅外(IR)染料、環(huán)狀⑶P核糖(c⑶PR)、CalcofIuor白、麗絲胺、傘形酮、酪氨酸和色氨酸。多種其它熒光探針可從俄勒R州Eugene的Molecular ftx)beS及許多其它制造商獲得禾口 / 或在 Handbook of Fluorescent Probesand Research Products 8th Ed. (2001)中廣泛描述。
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信號的進一步修改可通過使用可通過使用特定結合成員的組合實現，如抗體和抗抗體，其中抗抗體結合到目標抗體探針的保存區(qū)域，尤其是其中抗體來自不同的種。作為備選，可使用特定結合的配體-受體對，如生物素-抗生蛋白鏈菌素，其中主要抗體與該對的一個成員偶聯，及另一成員用可檢測的探針標記。因此，有效地建立了結合成員的夾合，其中第一結合成員結合到細胞組成并用于為輔助結合作準備，其中輔助結合成員可以也可不包括標記，其可進一步為第三次結合作準備，其中第三結合成員將提供標記。輔助抗體、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或生物素中的每一個用可檢測的基團單獨標記，其可以是引導具有實質上不可溶顏色反應產物的底物、熒光染料(染色劑)、發(fā)光染料或非熒光染料的比色反應的酶。包含每一這些選擇的例子在下面列出。原則上，可使用符合下述情形的任何酶(i)可與主要抗體偶聯或間接結合(如經偶聯的抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素、輔助抗體)；及(ii)使用可溶底物提供不可溶產物(沉淀)。例如，采用的酶可以是堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β -半乳糖苷酶和/或葡萄糖氧化酶；及底物可相應為堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β -半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶底物。堿性磷酸酶(AP)底物包括但不限于AP藍底物(藍色沉淀，Zymed目錄p. 61)、AP 橘黃底物(橘黃、沉淀、Zymed)、AP紅底物(紅、紅色沉淀、Zymed)、5_溴_4_氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP底物、青綠色沉淀)、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基藍四唑/碘硝基四唑(BCIP/INT底物、黃-棕沉淀、Biomeda)、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基藍四唑(BCIP/NBT底物、藍/紫)、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基藍四唑/碘硝基四唑 (BCIP/NBT/INT、棕色沉淀、DAK0)、固紅(紅)、洋紅-光(洋紅)、萘酚AS-BI磷酸酯(NABP)/ 固紅TR(紅)、萘酚AS-BI磷酸酯(NABP)/新品紅(紅)、萘酚AS-MX磷酸酯(NABP)/新品紅(紅)、新品紅AP底物(紅)、對硝基苯磷酸酯(PNPP、黃、可水溶)、VECTOR 黑(黑)、 VECTOR 藍(藍)、VECTOR 紅(紅)、Vega紅(樹莓紅色)。辣根過氧化物酶(HRP，有時縮寫為P0)底物包括但不限于2，2’-連氮基-雙-3-乙基苯-二氫噻唑磺酸酯(ABTS、綠、可水溶)、氨乙基咔唑、3-氨基-9-乙基咔唑AEC(3A9EC、 紅)、α-萘酚派洛寧(紅)、4_氯-1-萘酚GC1N、藍、藍-黑)、3，3' - 二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB、棕)、鄰二茴香胺(綠)、鄰苯二胺(0PD、棕、可水溶)、TACS藍(藍)、TACS紅(紅)、 3,3' ,5,5'-四甲基聯苯胺(TMB、綠或綠/藍)、TRUE BLUE (藍)、VECTOR VIP(紫)、 VECTOR SG (煙藍-灰)、及Zymed藍HRP底物(鮮艷藍)。葡萄糖氧化酶(GO)底物包括但不限于硝基藍四唑(NBT、紫色沉淀)、四硝基藍四唑(TNBT、黑色沉淀)、2-(4_碘苯基)-5-(4-硝基苯基)-3-苯基氯化四唑(INT、紅或橘黃色沉淀)、四唑藍(藍)、硝基四唑紫(紫)、及溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑(MTT、紫)。所有四唑底物均需要葡萄糖作為共同底物。葡萄糖氧化及四唑鹽還原并形成不可溶甲臜，甲臜形成彩色沉淀。β -半乳糖苷酶底物包括但不限于5-溴-4-氯-3-吲哚β -D-半乳糖苷(X_gal、 藍色沉淀)。與每一所列出的底物相關聯的沉淀具有獨一無二的可檢測的光譜特征(組分)。酶也可在催化底物的發(fā)光反應時進行引導，例如但不限于熒光素酶和發(fā)光蛋白質，具有能夠發(fā)光或引導第二底物的第二反應的實質上不可溶的反應產物，例如但不限于熒光素和ATP或腔腸素和Ca.2+，具有發(fā)光產物。下述整體組合于此的文獻提供另外的例子J. M Elias (1990) Immunohistopathology :A practical approach to diagnosis.ASCP Press (AmericanSociety of Clinical Pathologists) , Chicago ； J.F. McGinty, F.E.B1 oom (1983)Doub1eimmunostaiηing reveals distinctions among opioidpeptidergic neurons in the medialbasal hypothalamus. Brain Res. 278 145-153 ； 及 Τ. Jowett(1997)Tissue In situHybridization :Methods in Animal Development. John Wiley & Sons, Inc. ,NewYork ；J Histochem Cytochem 1997 December 45(12) :1629-1641o核酸生物標志物可使用原位雜交(ISH)進行檢測?？偟膩碚f，核酸序列探針用熒光探針或配體受體對如生物素/抗生物素蛋白的一成員合成和標記，其用可檢測的基團標記。示例性的探針和基團在前面部分中描述。序列探針與細胞中的目標核苷酸序列互補。包含目標核苷酸序列的每一細胞或細胞區(qū)室可結合標記的探針。在分析時使用的探針可以是DNA或RNA寡核苷酸或多核苷酸，及不僅可包含自然出現的核苷酸而且還可包含其類似物如dioxygenindCTP、生物素dcTP 7-氮雜鳥嘌呤核苷、疊氮胸苷、肌苷或尿苷。其它有用的探針包括肽探針及其類似物、分支基因DNA、擬肽類、肽核酸和/或抗體。探針與感興趣的目標核酸序列應具有足夠的互補性，使得在目標核酸序列和探針之間出現穩(wěn)定和特定的結合。穩(wěn)定雜交所需要的同源度隨雜交的嚴格性變化。傳統(tǒng)的ISH、雜交和探針選擇方法在下述文獻中描述；Leitch, et al. In SituHybridization :a practical guide， Oxford BIOS Scientific Publishers, MicroscopyHandbooks v.27 (1994)；及 Sambrook， J.，Fritsch，E. F.，Maniatis，T.，MolecularCloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press (1989)。在一實施例中，在這里描述的當前化驗中使用的試劑如染色或IHC試劑的最佳稀釋可在數量上自動確定。在一實施例中，對多個稀釋組進行成像，其中每一稀釋組包括不同的相應稀釋值和免疫測定染色強度值的相應排列。對多個稀釋組中的每一組，相對于免疫測定染色強度值的相應排列確定相應的動態(tài)范圍度量。已發(fā)現相應的動態(tài)范圍度量，選擇具有數字上最佳動態(tài)范圍度量的稀釋組，及該稀釋組的稀釋值選擇為在本發(fā)明中使用的試劑的最佳稀釋水平的表示。例如，制作在載玻片上的組織試樣利用上述普通免疫組織化學技術用主要抗體的稀釋系列之一染色。所得到的已染色試樣中的每一個使用用于查看可檢測的信號并獲得圖像的系統(tǒng)成像，前述圖像如數字染色圖像。獲取圖像的方法在下面更詳細地描述。因此，所獲得的圖像之后由本發(fā)明方法使用從而用于在數量上確定本發(fā)明中使用的試劑的最佳濃度。每一組組織試樣包括多個不同的、用相應滴定量稀釋準備的組織試樣，使得不同的組織試樣組具有不同的相應滴定量稀釋。對多組組織試樣的像素化圖像進行量化分析。對于多個稀釋組中的每一稀釋組，計算動態(tài)范圍度量及染色特異性。在本發(fā)明的一實施例中，動態(tài)范圍度量為平均絕對偏差。在本發(fā)明的另一實施例中，對該數據進行l(wèi)og 變換，及動態(tài)范圍度量為標準偏差、方差和擺幅比的加權組合。計算染色的特異性以在使噪聲最小的同時使特定信號最大化。染色的特異性可這樣計算將與染色特異性區(qū)室相關聯的一組免疫測定染色強度值求和然后計算該染色特異性區(qū)室的染色特異性平均值；也將與非染色特異性區(qū)室相關聯的一組免疫測定染色強度值求和然后計算非染色特異性平均值。 在計算這兩個平均值之后，染色特異性平均值除以非染色特異性平均值以產生染色的特異性，或信噪度量。在這樣的實施例中，數字上大靈敏度的染色值為最佳。在另一實施例中，非染色特異性平均值除以染色特異性平均值以產生染色的靈敏度。在前述實施例中，數字上小靈敏度的染色值為最佳。在計算每一稀釋組的動態(tài)范圍度量和染色靈敏度之后，動態(tài)范圍度量和染色靈敏度可相互組合以產生每一稀釋組的組合值。所得到的組合值用于選擇具有數字上最佳組合值的稀釋組。與所選稀釋組相關聯的是試劑的最佳稀釋的稀釋值表示。 可選地，該方法執(zhí)行多個比較以試圖識別多個染色特異性和非染色特異性區(qū)室。4、儀器標準化和圖像收集一旦試樣已被染色，任何光學或非光學成像裝置可用于檢測染色劑或生物標志物標記，例如豎立或倒置光學顯微鏡、掃描共焦顯微鏡、攝像機、掃描或隧穿電子顯微鏡、掃描探針顯微鏡、及成像紅外檢測器等。在一實施例中，成像裝置為顯微鏡系統(tǒng)，其包括配置成照射目標試樣的照明源、配置成產生所照射目標試樣的放大圖像的光學器件、及配置成捕獲所放大圖像的數字圖像的檢測器如數碼相機。量化結果可通過處理所捕獲的數字圖像獲得。前述圖像處理可包括本領域技術人員已知的圖像處理技術。在至少部分實施例中，前述圖像捕獲和圖像處理中的一個或多個在處理器的幫助下完成。處理器可包括實施預編程的指令的計算機。例如，組織試樣或組織微陣列可按如下所述成像用戶將微陣列放在試樣臺上。用戶調節(jié)試樣臺使得感興趣的第一區(qū)域或第一組織斑位于視場中心并由CCD照相機聚焦。物鏡應調節(jié)到適當的分辨率，例如0. 6毫米試樣可以10倍放大率進行查看。如果有石蠟，試樣通常對應于光強度比周圍石蠟高的區(qū)域，與通過各種手段評估的一樣，包括源自已染色組織的可見光散射、組織自身熒光或熒光標簽的信號。計算機使用計算機軟件(Softworx 2. 5, Applied Precision, Issaquah, WA)和成像平臺(如 Deltavision)可獲得低分辨率圖像(如具有16位分辨率的64像素X64像素)。計算機自動將試樣臺平移約等于視場的量。之后，計算機獲得第二低分辨率圖像。該過程重復直到計算機已獲得整個組織試樣或微陣列的圖像為止。之后，計算機使用商用軟件產生整個組織試樣或微陣列的合成圖像?？蛇x地，為標準化使用特定系統(tǒng)獲得的量化結果，可確定系統(tǒng)內在因素以考慮例如沿光通路的激發(fā)源的強度變異性和設備變異性。為此，激發(fā)光源的強度的度量也可通過使用內嵌燈強度測量工具獲得。同樣，標準或校準試樣如校準顯微鏡載玻片的測量可使用特定系統(tǒng)獲得以確定一個或多個光通路因素。使用前述校準載玻片對于基于熒光的IHC應用特別有用，其中校準載玻片的試樣熒光區(qū)在相應帶寬內發(fā)出輻射。熒光發(fā)射使能以一個或多個相應波長中的每一波長表征光通路。這些測量可同時或分別獲得?？蛇x地，本發(fā)明系統(tǒng)還包括構造成將照明源的標準化試樣重定向到檢測器的校準裝置，盡管已發(fā)現本發(fā)明方法不需要使用這樣的裝置。在至少部分實施例中，系統(tǒng)處理器配置成確定特定顯微鏡的校正因子。校正因子可從使用校準裝置獲得的照明源的標準化試樣的測量結果確定。校正因子可(由處理器)用于校正目標試樣的所檢測圖像的任何強度變化。例如，校準塊因子(CC)通過與通用標準塊比較進行確定。光源因子(LQ通過對捕獲的校準表面圖像的像素強度求和進行確定。光通路因子(OP)是對每一塊/試樣組合取的16個圖像的平均總光強度的商。CC和OP因子對于進行研究的特定硬件系統(tǒng)是固有的，因而僅需要校準一次或在懷疑光學系統(tǒng)中已發(fā)生某些類型的修改時進行校準。標準化AQUA 得分如下所示標準化AQUA 得分=原始AQUA 得分*cc因子*LS因子*0P因子其中，CC和OP因子在系統(tǒng)安裝/構造時確定，LS因子同時進行測量。在一些實施例中，系統(tǒng)處理器配置以用于獲得校準因子的指令(如軟件)。作為備選或另外，系統(tǒng)處理器配置以使用校正因子校正所檢測的圖像的指令。前述校準用于降低同一顯微鏡系統(tǒng)內照明源強度隨著時間的過去可能出現的變化性，及降低使用不同顯微鏡系統(tǒng)和/或不同照明源獲得的量化結果之間的變化性。5、圖像優(yōu)化a、曝光時間可選地，可對來自所收集圖像的像素強度數據的動態(tài)范圍進行優(yōu)化以進一步降低批次之間的變化，尤其降低因染色強度和影響曝光時間的設備差異引起的變化。該過程包括在第一曝光時間捕獲照相機視場內的對象的圖像，使得所捕獲的圖像包括預定數量的像素，其中每一像素具有強度值。查詢所捕獲圖像的像素強度的頻率分布以確定頻率分布的像素強度的最高出現頻率的區(qū)域。然后，自第一曝光時間調節(jié)曝光時間以將該最高頻率分布區(qū)域移向強度值范圍的中間。換言之，確定直方圖的質心(COM)或頻率分布，從其計算調節(jié)的曝光時間以獲得像素強度的優(yōu)化動態(tài)范圍。之后，在調節(jié)后的曝光時間捕獲該對象的第二圖像，從而使得圖像具有最佳動態(tài)范圍。有多種方式可校正在此描述的方法中的曝光。一種校正技術為以比先前圖像更長或更短的曝光時間迭代獲取新的圖像，直到飽和像素最小化且獲得最佳動態(tài)范圍為止。該迭代過程使能快速調節(jié)曝光時間以在檢測范圍內減低像素強度從而優(yōu)化曝光和動態(tài)范圍。 然而，該過分簡單化的方法可能導致系統(tǒng)飽和像素過校正并將新的曝光時間設置得太低。 因此，希望將曝光時間校正的攻擊性修改為與先前圖像中有多少像素飽和成正比。為此，新的曝光時間可計算為E = E' χ (1-(0. 5)(1+s)),其中
權利要求
1.在制作在載玻片上的組織試樣中可再現量化生物標志物表達的方法，包括(a)獲取制作在載玻片上的組織試樣，其已被染色以使能定位至少一細胞區(qū)室和至少一生物標志物；(b)使用包括光源的標準化光學系統(tǒng)獲取已染色組織試樣的一個或多個包含像素的圖像；(c)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分數據信號和噪聲；(d)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的數據信號；(e)可選地，自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于用于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的至少一生物標志物的數據信號；(f)量化表達在至少一細胞區(qū)室的每一細胞區(qū)室中的生物標志物的量； 藉此，制作在載玻片上的組織試樣中的生物標志物表達得以可再現地量化。
2.根據權利要求1的方法，其中所述標準化光學系統(tǒng)包括其強度和光通路變化性已歸一化的光源。
3.根據權利要求1的方法，其中所述標準化光學系統(tǒng)允許自動調節(jié)曝光時間以優(yōu)化在圖像像素中捕獲的動態(tài)數據范圍。
4.根據權利要求1的方法，其中每一自動分析步驟以無人監(jiān)督的方式進行。
5.根據權利要求1的方法，其中對歸屬于兩個以上細胞區(qū)室的數據信號進行區(qū)分。
6.根據權利要求1的方法，其中對表達在兩個以上細胞區(qū)室的每一細胞區(qū)室中的生物標志物的量進行量化。
7.根據權利要求1的方法，其中以約95%的置信區(qū)間區(qū)分歸屬于兩個以上細胞區(qū)室的數據信號。
8.根據權利要求1的方法，還包括評估一個或多個制作在載玻片上的組織試樣或一個或多個包含像素的圖像或其一個或多個放大部分的質量。
9.根據權利要求1的方法，該方法實現可再現割點確定。
10.根據權利要求1的方法，對于每一試樣，所述方法在批次之間實現85%以上的試樣分類一致性。
11.根據權利要求1的方法，對于每一試樣，所述方法在批次之間實現90%以上的試樣分類一致性。
12.根據權利要求1的方法，所述方法實現生物標志物表達的量化測量的再現性水平高于80%。
13.根據權利要求1的方法，所述方法實現生物標志物表達的量化測量的再現性水平高于90%。
14.根據權利要求1的方法，所述方法實現生物標志物蛋白質的量化測量的再現性水平高于95%。
15.根據權利要求1的方法，所述方法實現生物標志物表達的量化測量的再現性水平落在約90%到約97%的范圍中。
16.根據權利要求1的方法，所述方法實現生物標志物表達的量化測量的變化系數％ CV低于20%。
17.根據權利要求1的方法，所述方法實現生物標志物表達的量化測量的變化系數％ CV低于10%。
18.根據權利要求1的方法，所述方法實現生物標志物表達的量化測量的變化系數％ CV低于5%。
19.根據權利要求1的方法，所述方法實現生物標志物表達的量化測量的變化系數％ CV落在約4%到約7%的范圍中。
20.根據權利要求1的方法，其中制作在載玻片上的組織試樣已用一種或多種試劑的最佳稀釋進行染色。
21.根據權利要求20的方法，其中所述最佳稀釋產生具有最佳動態(tài)范圍度量的一個或多個包含像素的圖像。
22.—種計算機可讀介質，該介質包括存儲于其上的、由處理器運行以執(zhí)行在制作在載玻片上的組織試樣中可再現量化生物標志物表達的方法的計算機可讀指令，所述方法包括(a)獲取制作在載玻片上的組織試樣的一個或多個包含像素的圖像，所述組織試樣已被染色以使能使用包括光源的標準化光學系統(tǒng)定位至少一細胞區(qū)室和至少一生物標志物；(b)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分數據信號和噪聲；(c)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的數據信號；及(d)量化表達在至少一細胞區(qū)室的每一細胞區(qū)室中的生物標志物的量；藉此，制作在載玻片上的組織試樣中的生物標志物表達可再現地量化。
23.根據權利要求22的計算機可讀介質，其中存儲于其上并由處理器運行的計算機可讀指令還包括執(zhí)行在所述量化步驟之前具有下述可選步驟的方法的指令自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于用于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的至少一生物標志物的數據信號。
24.用于可再現量化制作在載玻片上的組織試樣中的生物標志物表達的系統(tǒng)，包括(a)配置成至少放大制作在載玻片上的組織試樣的一部分的一個或多個透鏡，所述組織試樣已被染色以使能定位至少一細胞區(qū)室和至少一生物標志物；(b)標準化光學系統(tǒng)，包括與一個或多個透鏡光通信的光源和圖像傳感器，標準化光學系統(tǒng)獲取已染色組織試樣的一個或多個包含像素的圖像；(c)與標準化光學系統(tǒng)通信的處理器模塊，該處理器模塊配置成(i)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分數據信號和噪聲；(ii)自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的數據信號；及(iii)量化表達在至少一細胞區(qū)室的每一細胞區(qū)室中的生物標志物的量；藉此，制作在載玻片上的組織試樣中的生物標志物表達可再現地量化。
25.根據權利要求M的系統(tǒng)，其中所述處理器模塊還配置成可選地自動分析源自圖像像素的一個或多個數據集以區(qū)分歸屬于用于至少一細胞區(qū)室中的每一細胞區(qū)室的至少一生物標志物的數據信號。
全文摘要
本發(fā)明方法涉及生物標志物表達的可再現量化，包括組織試樣中的生物標志物表達。本發(fā)明描述了方法和系統(tǒng)，其中生物標志物表達的可再現得分獨立于儀器、其位置或操作員獲得。
文檔編號G06T7/00GK102165489SQ200980137750
公開日2011年8月24日 申請日期2009年9月15日 優(yōu)先權日2008年9月16日
發(fā)明者B·伯克, C·威廉斯, D·M·賴利, D·王, G·R·特德斯奇, J·克里斯琴森, M·P·澤科夫斯基, M·古斯達夫遜, R·皮納德 申請人:赫斯托克斯公司