生物標(biāo)志物組合物和方法
【專利摘要】可以評(píng)估生物標(biāo)志物用于診斷、治療相關(guān)或預(yù)后方法以鑒定表型，如病癥或疾病，或者疾病的階段或進(jìn)程，選擇用于疾病、病癥、疾病階段和病癥階段的候選治療方案，并且用于確定治療效果。來(lái)自體液的循環(huán)生物標(biāo)志物可以用于生理狀態(tài)的分型或確定表型。這些包括核酸、蛋白質(zhì)和循環(huán)結(jié)構(gòu)，如囊泡，以及核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
【專利說(shuō)明】生物標(biāo)志物組合物和方法
[0001]交叉參考
[0002]本申請(qǐng)要求2011年6月16日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/497，895 ;2011年6 月 20 日提交的 N0.61/499，138 ；2011 年 6 月 27 日提交的 N0.61/501,680 ；2011 年 7 月8 日提交的 N0.61/506,019 ；2011 年 7 月 11 日提交的 N0.61/506,606 ；2011 年 7 月 11 日提交的N0.61/506，598 ；2011年7月14日提交的N0.61/507,989 ；2011年7月25日提交的N0.61/511,455 ;2011年8月15日提交的N0.61/523，763 ;和2011年8月23日提交的N0.61/526，623的權(quán)益；將該申請(qǐng)全部按引用并入本文中作為參考。 [0003]本申請(qǐng)是2012年6月7日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2012/041387的部分繼續(xù)，該國(guó)際專利申請(qǐng)要求2011年6月7日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/494，196;2011年6月7日提交的N0.61/494,355 ;和2011年7月14日提交的N0.61/507，989的權(quán)益；將該申請(qǐng)全部按引用并入本文中作為參考。
[0004]本申請(qǐng)還是2012年2月17日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2012/025741的部分繼續(xù)，該國(guó)際專利申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)2011年2月24日提交的N0.61/446,313 ；2011年6月27日提交的N0.61/501,680 ；2011年4月4日提交的N0.61/471,417 ；2011年8月15日提交的N0.61/523，763 ;和2011年2月22日提交的N0.61/445，273的權(quán)益；將該申請(qǐng)全部按引用并入本文中作為參考。
[0005]本申請(qǐng)還是2011年8月18日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2011/048327的部分繼續(xù)，該國(guó)際專利申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)2010年8月18日提交的N0.61/374,951 ；2010年9月2日提交的N0.61/379，670 ;2010年9月9日提交的N0.61/381，305 ;2010年9月15 日提交的 N0.61/383,305 ；2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504 ；2010 年 10 月 15日提交的 N0.61/393，823 ；2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890 ；2010 年 11 月 17 日提交的 N0.61/414,870 ;2010 年 11 月 23 日提交的 N0.61/416，560 ;2010 年 12 月 10 日提交的 N0.61/421，851 ;2010 年 12 月 15 日提交的 N0.61/423，557 ;2010 年 12 月 29 日提交的N0.61/428，196的權(quán)益；將該申請(qǐng)全部按引用并入本文中作為參考。
[0006]本申請(qǐng)還是2011年3月I日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2011/026750的部分繼續(xù)，該申請(qǐng)聲稱是2009年11月12日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列N0.12/591,226的部分繼續(xù)申請(qǐng)，其要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)2008年11月12日提交的N0.61/114,045 ;2008年11月12 日提交的 N0.61/114，058 ；2008 年 11 月 13 日提交的 N0.61/114，065 ；2009 年 2 月 9 日提交的 N0.61/151,183 ；2009 年 10 月 2 日提交的 N0.61/278,049 ；2009 年 10 月 9 日提交的N0.61/250, 454 ;和2009年10月19日提交的N0.61/253，027的權(quán)益；并且該申請(qǐng)還要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)2010年3月I日提交的N0.61/274，124 ;2010年6月22日提交的N0.61/357,517 ;2010年7月15日提交的N0.61/364，785的權(quán)益；將所有申請(qǐng)全部按引用并入本文中作為參考。
[0007]本申請(qǐng)還是2011年4月6日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2011/031479的部分繼續(xù)，該國(guó)際專利申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)2010年4月6日提交的N0.61/321,392 ；2010 年 4 月 6 日提交的 N0.61/321，407 ;2010 年 5 月 6 日提交的 N0.61/332，174 ；2010年 5 月 25 日提交的 N0.61/348，214 ;2010 年 5 月 26 日提交的 N0.61/348，685 ;2010 年6 月 11 日提交的 N0.61/354，125 ；2010 年 6 月 16 日提交的 N0.61/355，387 ；2010 年 6月 21 日提交的 N0.61/356，974 ;2010 年 6 月 22 日提交的 N0.61/357，517 ;2010 年 7 月8 日提交的 N0.61/362，674 ；2010 年 11 月 12 日提交的 N0.61/413，377 ；2010 年 4 月 9日提交的 N0.61/322，690 ;2010 年 5 月 13 日提交的 N0.61/334，547 ;2010 年 7 月 15 日提交的 N0.61/364，785 ；2010 年 8 月 2 日提交的 N0.61/370, 088 ；2010 年 9 月 2 日提交的 N0.61/379，670 ；2010 年 9 月 9 日提交的 N0.61/381，305 ；2010 年 9 月 15 日提交的 N0.61/383，305 ;2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504 ;2010 年 10 月 15 日提交的N0.61/393, 823 ;2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890 和 2010 年 11 月 23 日提交的N0.61/416，560的權(quán)益；將所有申請(qǐng)全部按引用并入本文中作為參考。
[0008]發(fā)明背景
[0009]用于諸如癌癥的狀況和疾病的生物標(biāo)志物包括生物分子，如蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、RNA、DNA和它們的變體及修飾。
[0010]特定生物標(biāo)志物(例如DNA、RNA和蛋白質(zhì))的鑒定可以提供用于診斷、預(yù)后或治療診斷(theranosis)狀況或疾病的生物印記。生物標(biāo)志物可在體液中檢測(cè)，包括循環(huán)DNA、RNA、蛋白質(zhì)和囊泡。循環(huán)生物標(biāo)志物包括蛋白質(zhì)(諸如PSA和CA125)以及核酸(諸如SEPT9DNA和PCA3信使RNA (mRNA))。循環(huán)生物標(biāo)志物可以與循環(huán)囊泡相關(guān)。囊泡是從細(xì)胞上脫落的膜包封的結(jié)構(gòu)，并且可見(jiàn)于多種體液中，包括血液、血漿、血清、乳汁、腹水、支氣管肺泡灌洗液和尿液。囊泡可作為蛋白質(zhì)、RNA、DNA、病毒和朊病毒的運(yùn)送載體而參與細(xì)胞之間的通訊。微RNA是調(diào)控信使RNA轉(zhuǎn)錄和降解的短RNA。微RNA已經(jīng)在體液中發(fā)現(xiàn)并且已經(jīng)觀察到其作為從腫瘤細(xì)胞上脫落的囊泡內(nèi)的組分。對(duì)與疾病相關(guān)的循環(huán)生物標(biāo)志物(包括囊泡和/或微RNA)的分析可有助于檢測(cè)疾病或其嚴(yán)重程度、確定疾病的易感性以及進(jìn)行治療決策?！?br> [0011]生物樣品中存在的囊泡提供了生物標(biāo)志物的來(lái)源，例如，所述標(biāo)志物存在于囊泡內(nèi)(囊泡有效負(fù)載)或存在于囊泡的表面上。囊泡的特征(例如尺寸、表面抗原、細(xì)胞源的確定、有效負(fù)載)還可提供診斷、預(yù)后或治療診斷的結(jié)果輸出。仍然存在對(duì)可用于檢測(cè)和治療疾病的生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定的需求。與囊泡相關(guān)的微RNA、蛋白質(zhì)和其它生物標(biāo)志物以及囊泡的特征可提供診斷、預(yù)后或治療診斷。
[0012]本發(fā)明提供了用于通過(guò)檢測(cè)作為疾病或疾病進(jìn)展的指征的生物標(biāo)志物而表征表型的方法和系統(tǒng)。所述生物標(biāo)志物可以是循環(huán)生物標(biāo)志物，包括但不限于囊泡標(biāo)志物、蛋白質(zhì)、核酸、mRNA或/和微RNA。生物標(biāo)志物可以是核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本文公開(kāi)了用于通過(guò)分析循環(huán)生物標(biāo)志物(諸如生物樣品中存在的囊泡、微RNA或蛋白質(zhì))來(lái)表征表型的方法和組合物。表征受試者或個(gè)體的表型可以包括但不限于疾病或狀況的診斷、疾病或狀況的預(yù)后、疾病階段或狀況階段的確定、藥物效力、生理狀況、器官危困或器官排斥、疾病或狀況進(jìn)展、與疾病或狀況的治療相關(guān)關(guān)聯(lián)性或者特定的生理或生物狀態(tài)。
[0015]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了鑒定生物印記的方法，其包括:(a)測(cè)定生物樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包含選自表5的一種或多種生物標(biāo)志物；和(b)鑒定包括所述一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平的生物印記。該方法可以進(jìn)一步包括將所述生物印記與參照生物印記相比較，其中將該比較用于表征癌癥。所述參照生物印記可以來(lái)自未患癌癥的受試者。參照生物印記可以來(lái)自該受試者。例如，參照生物印記可以來(lái)自受試者的非惡性樣品，如正常的鄰近組織，或在一段時(shí)間過(guò)程中取自受試者的不同樣品。表征可以包括鑒定受試者中癌癥的存在或風(fēng)險(xiǎn)，或鑒定受試者中的癌癥是轉(zhuǎn)移性的或侵襲性的。所述比較步驟可以包括確定生物印記是否相對(duì)于參照生物印記有所改變，由此提供癌癥的預(yù)后、診斷或治療診斷確定。
[0016]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物選自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a_5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517木、miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、miR-542-5p、miR_30b*、miR-1179及其組合。例如，所述一種或多種生物標(biāo)志物可以選自miR-22、let7a、miR_141、miR-920、miR-450a及其組合。所述生物印記可以用于表征前列腺癌。
[0017]在其他實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自由表20-24任一中的基因組成的組的信使RNA(mRNA)及其組合。例如，所述一種或多種生物標(biāo)志物可以包括選自A2ML1、BAX、C10orf47、Clortl62、CSDA, EIFC3、ETFB, GABARAPL2、GUKU GZMH、HIST1H3B、HLA-A、HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA、RABACl、RABAGAP1L、RPL22、SAP 18、SEPWl、SOXl 及其組合的mRNA。所述一種或多種生物標(biāo)志物還可以選自A2ML1、GABARAPL2、PTMA、RABAC1、S0X1、EFTB及其組合。所述生物印記可以用于表征前列腺癌。
[0018]所述一種或多種生物標(biāo)志物可以選自04-125、0么19-9、(3-反應(yīng)蛋白、^95、？4?-1、EGFR、EGFRvII1、阿樸脂蛋白Al、阿樸脂蛋白CII1、肌紅蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封閉蛋白(claudin)-3、封閉蛋白 _4、小窩蛋白-1、凝血因子 II1、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rabl3、橋粒芯膠蛋白(Desmocollin)-1、EMP-2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜聯(lián)蛋白 V、MFG-E8、HLA_DR、miR200 微 RNA、miR_200c 及其組合。例如，所述一種或多種生物標(biāo)志物選自CA-125、CA19-9、c-反應(yīng)蛋白、⑶95、FAP-1及其組合。所述生物印記可以用于表征卵巢癌。
[0019]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物選自hsa-miR-574_3p、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-107、hsa_miR-301a、hsa-miR-484、hsa-miR-625*及其組合。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于檢測(cè)前列腺癌的存在。所述一種或多種生物標(biāo)志物還可以選自hsa-miR-582_3p、hsa_miR-20a*、hsa-miR-375、hsa_miR-200b、hsa-miR-379、hsa-miR-572、hsa-miR-513a_5p、 hsa-miR-577、 hsa_miR-23a*、 hsa-miR-1236、 hsa-miR-609、hsa-miR-l7*、hsa_miR-l30b、hsa-miR-619、hsa-miR-624*、hsa-miR-198 及其組合。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性前列腺癌。
[0020]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括miR-497及其組合。所述生物印記可以用于表征肺癌。
[0021]所述一種或多種生物標(biāo)志物可以是選自由AQP2、BMP5、C16orf86、CXCT13、DST、ERCC1、GNAO1、KIHL5、MA P4K1、NELL2、PENK、PGF、P0U3F1、PRSS21、SCML1、SEMGG1、SMAKCD3、SNAI2, TAF1C、TNNT3及其組合組成的組的信使RNA (mRNA)。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分前列腺癌與非癌樣品。
[0022]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自由ADRB2、ARG2、C22orf32、CYorf 14, EIFlAY, FEV, KLK2、KLK4、LRRC26、MAOA、NLGN4Y、PNPLA7、PVRL3、SIM2,SLC30A4、SLC45A3、STX19、TRIM36, TRPM8及其組合組成的組的信使RNA(mRNA)。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分前列腺癌與非前列腺癌樣品，如乳腺癌樣品。
[0023]在其他實(shí)施方案中，一種或多種生物標(biāo)志物包括選自由ADRB2、BAIAP2L2、C19orf33、CDX1、CEACAM6、EEF1A2、ERN2、FAMl 10B、F0XA2、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MIPOLl、SLC45A3、SPDEF、TRM31、TRM36、ZNF613 及其組合組成的組的信使 RNA (mRNA)。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分前列腺癌與非前列腺癌樣品，如結(jié)腸直腸癌樣品。
[0024]在再其他的實(shí)施方案中，一種或多種生物標(biāo)志物包括選自由ASTN2、CAB39L、CRIP1、FAMlIOB、FEV、GSTP1、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MUC1、PNPLA7、S頂2、SLC45A3、SPDEF, TRIM36, TRPV6, ZNF613及其組合組成的組的信使RNA (mRNA)。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分前列腺癌與非前列腺癌樣品，如肺癌樣品。
[0025]所述一種或多種生物標(biāo)志物還可以是識(shí)別以上mRNA之一的微RNA。例如，微RNA可以選自 miRs-26a + b、miR-15、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424、miR-206、miR-342-5p、miR-186、miR-1271、miR-600、miR_216b、miR-519 家族、miR-203 及其組合。
[0026]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種方法，其包括:(a)從生物樣品分離一種或多種核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物；(b)用所述一種或多種核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物測(cè)定一種或多種核酸生物標(biāo)志物的存在或水平；和(C)鑒定包括所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物的存在或水平的生物印記。所述方法可以進(jìn)一步包括將所述生物印記與參照生物印記相比較，其中所述比較用于表征癌癥。參照生物印記可以來(lái)自未患癌癥的受試者。參照生物印記可以來(lái)自該受試者。例如，所述參照生物印記可以來(lái)自受試者的非惡性樣品，如正常的鄰近組織，或在一段時(shí)間過(guò)程中取自受試者的不同樣品。所述表征可以包括鑒定受試者中癌癥的存在或風(fēng)險(xiǎn)，或鑒定受試者中的癌癥是 轉(zhuǎn)移性的或侵襲性的。所述比較步驟可以包括確定生物印記相對(duì)于參照生物印記是否有所改變，由此提供用于癌癥的預(yù)后、診斷或治療診斷確定。
[0027]所述核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物可以包含選自一種或多種Argonaute家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB, ILF2、NCL (核仁素)、NPMl (核磷蛋白)、RPLlOA、RPL5、RPLPl、RPS12、RPS19、SNRPG, TR0VE2、阿樸脂蛋白、阿樸脂蛋白 A、apo A-1> apo A-1I> apo A-1V、apo A-V、阿樸脂蛋白 B、apo B48、apo B100、阿樸脂蛋白C、apo C-1> apo C-11、apoC-1I1、apo C-1V、阿樸脂蛋白D(ApoD)、阿樸脂蛋白E(ApoE)、阿樸脂蛋白 H(ApoH)、阿樸脂蛋白 L、AP0L1、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6、AP0LD1及其組合的一種或多種蛋白質(zhì)。例如，所述一種或多種蛋白質(zhì)可以選自一種或多種Argonaute 家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)及其組合。一種或多種蛋白質(zhì)還可以選自Ago2、阿樸脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其組合。
[0028]所述核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物可以包含一種或多種微RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種微RNA可以是表5中的一種或多種微RNA。例如，所述一種或多種微RNA可以選自miR-22、miR-16、miR_148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物包含一種或多種選自Ago2、阿樸脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其組合的蛋白質(zhì)；并且所述一種或多種微RNA包括選自miR-16和miR_92a及其組合的一種或多種微RNA。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分前列腺癌與非癌樣品。
[0029]在再另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括:(a)檢測(cè)來(lái)自生物樣品的微囊泡群體中的一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物；(b)確定與所檢測(cè)的微囊泡群體相關(guān)的一種或多種核酸生物標(biāo)志物的存在或水平；和(C)鑒定包括所述一種或多種核酸的存在或水平的生物印記。例如，所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物的水平可以相對(duì)于所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的水平標(biāo)準(zhǔn)化。所述方法可以進(jìn)一步包括將所述生物印記與參照生物印記相比較，其中所述比較用于表征癌癥。所述參照生物印記可以來(lái)自未患癌癥的受試者。所述參照生物印記可以來(lái)自該受試者。例如，所述參照生物印記可以來(lái)自受試者的非惡性樣品，如正常的鄰近組織，或在一段時(shí)間過(guò)程中取自受試者的不同樣品。所述表征可以包括鑒定受試者中癌癥的存在或風(fēng)險(xiǎn)，或鑒定受試者中癌癥是轉(zhuǎn)移性的或侵襲性的。所述比較步驟可以包括確定生物印記是否相對(duì)于參照生物印記有改變，由此提供用于癌癥的預(yù)后、診斷或治療診斷確定。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物包括選自PCSA、Ago2、⑶9及其組合的一種或多種蛋白質(zhì)。所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物可以是選自miR-22、miR-16、miR_148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其組合的一種或多種微 RNA。例如，所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物可以包括PCSA和Ago2 ;并且所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物可以包括miR-22。作為另一個(gè)實(shí)例，所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物可以包括PCSA和/或⑶9 ;并且所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物可以包括miR-22。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物包括PCSA ;并且所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物包括選自表22-24的信使RNA(mRNA)。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分前列腺癌與非癌樣品。
[0031]所述生物印記可以包括從一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物和一種或多種核酸生物標(biāo)志物的水平的比例計(jì)算的評(píng)分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物包括PCSA和PSMA，并且一種或多種核酸生物標(biāo)志物包括miR-22和let7a。在這種情況中，計(jì)算評(píng)分可以包括取以下的總和:(a)微囊泡亞群中的miR-22有效負(fù)載的水平除以與微囊泡亞群相關(guān)的PCSA蛋白的水平的第一倍數(shù)；(b)微囊泡亞群中l(wèi)et7a有效負(fù)載的水平除以與微囊泡亞群相關(guān)的PCSA蛋白的水平的第二倍數(shù)；和(c)與微囊泡亞群相關(guān)的PSMA蛋白的水平的第三倍數(shù)。可以選擇所述第一、第二和第三倍數(shù)來(lái)優(yōu)化確定生物印記。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一倍數(shù)和第二倍數(shù)可以都是10。第三倍數(shù)可以是I。
[0032]在所述系統(tǒng)的方法的實(shí)施方案中，所述生物樣品包括體液。合適的體液不限于外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper’ s fluid)或預(yù)射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛發(fā)、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、經(jīng)血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。例如，生物樣品可以包括尿液、血液或血液衍生物。
[0033]在所述系統(tǒng)的方法的一些實(shí)施方案中，所述生物樣品包括組織樣品、來(lái)自組織樣品的細(xì)胞或從這些細(xì)胞釋放的循環(huán)生 物標(biāo)志物。例如，可以進(jìn)行本發(fā)明的方法來(lái)鑒定針對(duì)組織樣品的生物印記。所述生物樣品可以包括細(xì)胞培養(yǎng)物樣品，例如，所述樣品可以包括培養(yǎng)的細(xì)胞和/或包含從這些培養(yǎng)的細(xì)胞釋放的循環(huán)生物標(biāo)志物的培養(yǎng)基。所述組織樣品或培養(yǎng)物樣品可以是癌樣品，或可以包括腫瘤樣品或腫瘤細(xì)胞。
[0034]在本發(fā)明的方法中，生物樣品可以含有一種或多種微囊泡。在一些實(shí)施方案中，一種或多種生物標(biāo)志物與一種或多種微囊泡相關(guān)。一種或多種微囊泡可以具有IOnm至2000nm 的直徑,例如，20nm 至 1500nm, 20nm 至 1000nm, 20nm 至 500nm,或 20nm 至 200nm。
[0035]可以使用本文中公開(kāi)的或本領(lǐng)域已知的方法從樣品中分離一種或多種微囊泡。在實(shí)施方案中，一種或多種微囊泡經(jīng)受尺寸排阻色譜、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、親和捕獲、親和選擇、免疫分析、ELISA、微流體分離、流式細(xì)胞分析或其組合。
[0036]可以將一種或多種微囊泡接觸一種或多種結(jié)合劑。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種結(jié)合劑包含核酸、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、凝集素、肽、枝狀物、膜蛋白標(biāo)記劑、化學(xué)化合物或其組合。例如，結(jié)合劑可以是抗體或適體。一種或多種結(jié)合劑可以用于捕獲和/或檢測(cè)一種或多種微囊泡。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種結(jié)合劑結(jié)合一種或多種微囊泡上的一種或多種表面抗原。一種或多種表面抗原可以包含一種或多種蛋白質(zhì)。
[0037]該一種或多種蛋白質(zhì)可以是目標(biāo)囊泡上的任何有用的生物標(biāo)志物，如本文中公開(kāi)的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種蛋白質(zhì)包括一種或多種細(xì)胞特異性或癌癥特異性的囊泡標(biāo)志物，例如，CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam或者表4或5中的蛋白質(zhì)。一種或多種蛋白質(zhì)還可以包括一般囊泡標(biāo)志物，例如，四跨膜蛋白(tetraspanin)、⑶9、⑶63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD52、Rab-5b、膜聯(lián)蛋白 V、MFG_E8 或表 3 的蛋白質(zhì)中的一種或多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種蛋白質(zhì)包括表3-5任一中的一種或多種蛋白質(zhì)。
[0038]一種或多種結(jié)合劑可以用于捕獲一種或多種微囊泡。捕獲的微囊泡可以用于進(jìn)一步的評(píng)估。例如，可以評(píng)價(jià)微囊泡內(nèi)的有效負(fù)載。微囊泡有效負(fù)載包括一種或多種核酸、肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。所述核酸可包含一種或多種DNA、mRNA、微 RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA 或 shRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種生物標(biāo)志物包括一種或多種捕獲的微囊泡內(nèi)的有效負(fù)載。例如，一種或多種生物標(biāo)志物可以包括mRNA有效負(fù)載。一種或多種生物標(biāo)志物還可以包括微RNA有效負(fù)載。一種或多種生物標(biāo)志物還可以包括蛋白質(zhì)有效負(fù)載，例如，內(nèi)膜蛋白質(zhì)或可溶性蛋白質(zhì)。
[0039]本發(fā)明的方法可以在體外進(jìn)行，例如，使用體外生物樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物樣品。
[0040]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所分 析的癌癥可以是肺癌，包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌(包括小細(xì)胞癌(燕麥細(xì)胞癌)、混合小細(xì)胞/大細(xì)胞癌和復(fù)合性小細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰癌(pancreascancer)、腦癌、腎癌、卵巢癌、胃癌(stomachcancer)、皮膚癌、骨癌、胃癌(gastric cancer)、乳腺癌、胰腺癌(pancreatic cancer)、膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、乳頭狀腎癌、頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或?qū)嶓w腫瘤。
[0041]在實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法表征的癌癥包括急性成淋巴細(xì)胞性白血??；急性骨髓性白血??；腎上腺皮質(zhì)癌；AIDS相關(guān)癌癥；AIDS相關(guān)淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細(xì)胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細(xì)胞癌；膀胱癌；腦干膠質(zhì)瘤；腦腫瘤(包括腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性瘤、星形細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和成松果體細(xì)胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發(fā)部位不明的癌癥；類癌瘤；原發(fā)部位不明的癌瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌癥；脊索瘤；慢性淋巴細(xì)胞性白血?。宦怨撬栊园籽。宦怨撬柙鲋澄蓙y；結(jié)腸癌；結(jié)直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細(xì)胞淋巴瘤；內(nèi)分泌胰島細(xì)胞瘤；子宮內(nèi)膜癌；成室管膜母細(xì)胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤；頡外生殖細(xì)胞瘤；性腺外生殖細(xì)胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤；胃腸道間質(zhì)瘤(GIST);妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；毛細(xì)胞白血?。活^頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內(nèi)黑色素瘤；胰島細(xì)胞瘤；卡波濟(jì)氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細(xì)胞瘤骨癌；髓母細(xì)胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細(xì)胞癌；Merkel細(xì)胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發(fā)性的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征；多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發(fā)育異常綜合征；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細(xì)胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽因癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細(xì)胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤??；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤；成松果體細(xì)胞瘤；垂體瘤；漿細(xì)胞腫瘤/多發(fā)性骨髓瘤；胸膜肺母細(xì)胞瘤；原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤；原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細(xì)胞(腎)癌；腎細(xì)胞癌；呼吸道癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌癥；S6zary綜合征；小細(xì)胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細(xì)胞癌；鱗狀頸癌?’胃(胃的)癌；幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤；T細(xì)胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細(xì)胞癌；腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌；滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstrom巨球蛋白血癥；*Wilm’s腫瘤。例如，所述癌癥可以是前列腺癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌或卵巢癌。
[0042]本發(fā)明的方法可以在體外進(jìn)行，例如，使用體外生物樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物樣品。
·[0043]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了進(jìn)行本發(fā)明任一方法的試劑。在一個(gè)相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含進(jìn)行本發(fā)明任一方法的試劑。試劑可以是結(jié)合劑，包括但不限于一種或多種生物標(biāo)志物的抗體或適體。例如，試劑可以是能夠結(jié)合表3-5、9-11、16-27、29或31-32任一個(gè)中的至少一種生物標(biāo)志物的結(jié)合劑。在一些實(shí)施方案中，將結(jié)合劑直接標(biāo)記或配置成進(jìn)行間接標(biāo)記。
[0044]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了分離的PCSA+囊泡。該囊泡可以含有有效負(fù)載，其包含一種或多種選自 miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a-5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517*、miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、miR-542_5p、miR_30b*、miR-1179 及其組合的微RNA。該囊泡還可以含有有效負(fù)載，其包含選自表20-24任一個(gè)的一種或多種信使RNA(mRNA)。
[0045]在再另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含:(a)寡核苷酸，其包含栓系于基質(zhì)上的第一部分、與目標(biāo)微RNA序列至少75%互補(bǔ)的第二部分和包含標(biāo)記的第三部分，其中第二部分位于第一部分和第三部分之間；和(b)微RNA?；|(zhì)可以是本文中公開(kāi)的基質(zhì)，例如，平面基質(zhì)、柱或珠。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸的第二部分與目標(biāo)微RNA序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補(bǔ)。寡核苷酸的第二部分可以與(b)中的微 RNA 至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%互補(bǔ)。
[0046]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸的第三部分是直接標(biāo)記的。在其他實(shí)施方案中，寡核苷酸的第三部分是間接標(biāo)記的。寡核苷酸的第三部分可以生物素化，例如，以促進(jìn)包含抗生蛋白鏈菌素的標(biāo)記(如抗生蛋白鏈菌素-phycoerytherin(PE) (SAPE))的結(jié)合?？梢允褂萌魏斡杏玫臉?biāo)記。例如，寡核苷酸的第三部分可以包含熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記。 [0047]在一個(gè)實(shí)施方案中，(b)中的微RNA是處于與蛋白質(zhì)的復(fù)合物中。所述蛋白質(zhì)可以選自 Argonaute 家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPMl (核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLPl、RPS12、RPS19、SNRPG、TR0VE2、阿樸脂蛋白、阿樸脂蛋白 A、apo A-1、apoA_I1、apo A-1V,apo A-V、阿樸脂蛋白 B、apo B48、apo B100、阿樸脂蛋白 C、apo C-1>apo C-1I>apo C_II1、apo C-1V、阿樸脂蛋白D(ApoD)、阿樸脂蛋白E(ApoE)、阿樸脂蛋白H(ApoH)、阿樸脂蛋白L、AP0L1、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6 和 AP0LD1。例如，微 RNA 可以被 Agol、Ago2、Ago3 和 Ago4 中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合。蛋白質(zhì)可以呈現(xiàn)出核溶解活性(nucleolytic activity)。蛋白質(zhì)可以包含重組蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)例，蛋白質(zhì)可以包含重組Ago2(rAgo2)。
[0048]在一些實(shí)施方案中，組合物包含生物樣品。微RNA也可以從生物樣品分離。分離的微RNA可以處于與蛋白質(zhì)(如以上那些，包括Agol、Ago2、Ago3和Ago4)的核蛋白復(fù)合物中。生物樣品可以包括體液。有用的體液的非限制性實(shí)例包括外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或預(yù)射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛發(fā)、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、經(jīng)血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。例如，生物樣品可以包括尿液、血液或血液衍生物。
[0049]在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了一種方法，其包括:(i)提供如以上教導(dǎo)的組合物；
(ii)在允許微RNA結(jié)合寡核苷酸的條件下孵育所述組合物；和(iii)檢測(cè)標(biāo)記從基質(zhì)切割的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記從基質(zhì)切割的量包括檢測(cè)在步驟(ii)之前和之后與基質(zhì)接觸的標(biāo)記的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記從基質(zhì)切割表示與微RNA復(fù)合的蛋白質(zhì)的存在。蛋白質(zhì)可以是如以上所述的那些的蛋白質(zhì)，包括Agol、Ago2、Ago3和Ago4?？梢栽谇懈罘磻?yīng)發(fā)生之前和之后觀察標(biāo)記從基質(zhì)切割的量?；蛘撸梢詫?shí)時(shí)觀察標(biāo)記從基質(zhì)切割的量。
[0050]通過(guò)引用并入
[0051]本說(shuō)明書中提及的所有公開(kāi)、專利和專利申請(qǐng)均以引用方式并入本文，其引用的程度如同各單個(gè)公開(kāi)、專利或?qū)＠暾?qǐng)均特定地且單獨(dú)地表明以引用的方式并入一般。
[0052]附圖簡(jiǎn)述
[0053]圖1A描述了鑒定包含核酸的生物印記以表征表型的方法。圖1B描述了鑒定囊泡或囊泡群體的生物印記以表征表型的方法。[0054]圖2詳細(xì)描述了通過(guò)評(píng)估囊泡生物印記而表征表型的方法。圖2A為涂敷有捕獲抗體的平面基底的簡(jiǎn)圖，所述的捕獲抗體捕獲表達(dá)該蛋白質(zhì)的囊泡。所述捕獲抗體是針對(duì)囊泡蛋白質(zhì)(其對(duì)源自病變細(xì)胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特異性)的。所述檢測(cè)抗體與捕獲的囊泡結(jié)合并提供熒光信號(hào)。所述檢測(cè)抗體可檢測(cè)通常與囊泡相關(guān)的抗原，或檢測(cè)與細(xì)胞源或疾病(如癌癥)相關(guān)的抗原。圖2B為涂敷有捕獲抗體的珠的簡(jiǎn)圖，所述捕獲抗體捕獲表達(dá)該蛋白質(zhì)的囊泡。所述的捕獲抗體是針對(duì)囊泡蛋白質(zhì)(其對(duì)于源自病變細(xì)胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特異性)的。所述檢測(cè)抗體與捕獲的囊泡結(jié)合并提供熒光信號(hào)。所述檢測(cè)抗體可檢測(cè)通常與囊泡相關(guān)的抗原，或檢測(cè)與細(xì)胞源或疾病(如癌癥)相關(guān)的抗原。圖2C為篩選方案的實(shí)例，其可以通過(guò)使用如圖2B中所示的珠以多重方式實(shí)施。圖2D示出了捕獲或檢測(cè)囊泡以表征表型的說(shuō)明性示意圖。圖2E示出了用于評(píng)估囊泡有效負(fù)載以表征表型的說(shuō)明性方案。
[0055]圖3詳細(xì)說(shuō)明了可以在本發(fā)明的一些示例性實(shí)施方案中使用的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。
[0056]圖4詳細(xì)說(shuō)明了使用檢測(cè)來(lái)自受試者的囊泡的基于珠的方法描述結(jié)果的方法。在給定強(qiáng)度下捕獲的珠的數(shù)量為囊泡以怎樣的頻率在所述強(qiáng)度下表達(dá)檢測(cè)蛋白質(zhì)的指示。對(duì)于給定的珠而言，信號(hào)的強(qiáng)度越強(qiáng)，則檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)越多。該圖顯示了通過(guò)將正常的患者組合到一條曲線中而將癌癥患者組合到另一條曲線中，并使用生物統(tǒng)計(jì)分析區(qū)分所述曲線而得到的歸一化的圖。對(duì)由各個(gè)個(gè)體得到的數(shù)據(jù)歸一化以考慮由檢測(cè)儀器所讀取的珠的數(shù)量的差異，將這些數(shù)據(jù)加和，然后再次歸一化以考慮各群體中的不同樣品數(shù)。
[0057]圖5說(shuō)明了通過(guò)評(píng)估TMPRSS2-ERG表達(dá)使用EpCam對(duì)來(lái)自血漿的前列腺癌細(xì)胞源囊泡的捕獲。將VcaP純化的囊泡摻入到正常血漿中，然后與涂敷有EpCam或同種型對(duì)照抗體的Dynal磁珠一起孵育。由Dynal珠上直接分離RNA。使用來(lái)自各樣品的等體積RNA來(lái)進(jìn)行RT-PCR以及隨后的Taqman分析。
[0058]圖6描述了使用⑶9珠捕獲的miR-21或miR-141表達(dá)的柱狀圖。將得自前列腺癌患者的Iml血漿、250ng/ml的LNCaP或正常的純化囊泡與⑶9涂敷的Dynal珠孵育。由所述的珠和珠上清液中分離 RNA。此外，對(duì)一個(gè)樣品(#6)不進(jìn)行捕獲以用于比較。使用qRT-PCR測(cè)量微RNA的表達(dá)，并比較各樣品的平均CT值。CD9捕獲改善了前列腺癌樣品中miR-21 和 miR-141 的檢測(cè)。
[0059]圖7詳細(xì)說(shuō)明了使用MoFlo XDP進(jìn)行的囊泡分離和鑒定。
[0060]圖8是檢測(cè)樣品中囊泡的示意圖，其中使用微球平臺(tái)評(píng)估所希望的囊泡的存在或水平。圖8A是使用基于柱的過(guò)濾方法從血漿中分離囊泡的示意圖，其中所述分離的囊泡隨后使用微球平臺(tái)進(jìn)行評(píng)估。圖8B是由于諸如超離心這樣的高速離心而導(dǎo)致囊泡膜壓縮的示意圖。圖8C是使用激光檢測(cè)對(duì)結(jié)合于微球的囊泡進(jìn)行檢測(cè)的示意圖。
[0061]圖9A詳細(xì)說(shuō)明了囊泡生物印記區(qū)分正常前列腺和PCa樣品的能力。癌癥標(biāo)志物包括EpCam和B7H3。一般囊泡標(biāo)志物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特異性標(biāo)志物包括PCSA。PSMA可以與PCSA—樣使用。據(jù)發(fā)現(xiàn)所述測(cè)試對(duì)于PCa對(duì)比正常樣品具有96%的靈敏度和95%的特異性。圖9B在Y軸上示出了正常和前列腺癌患者中圖9A的囊泡標(biāo)志物的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
[0062]圖10是用于囊泡前列腺癌分析的決策樹(shù)的示意圖，以用于確定樣品對(duì)于前列腺癌是否為陽(yáng)性。[0063]圖11顯示了根據(jù)所述決策樹(shù)針對(duì)前列腺癌的囊泡檢測(cè)分析相對(duì)于使用提高的PSA水平進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。
[0064]圖12說(shuō)明了從對(duì)照和PCa樣品分離的囊泡中的miR-145的水平。
[0065]圖13A-13B詳細(xì)說(shuō)明了使用微RNA確認(rèn)來(lái)自基于囊泡的前列腺癌診斷分析的假陰性。圖13A詳細(xì)說(shuō)明了使用囊泡中的miR分析以將假陰性轉(zhuǎn)換成真陽(yáng)性的示意圖，由此改善了靈敏度。圖13B詳細(xì)說(shuō)明了使用囊泡中的miR分析以將假陽(yáng)性轉(zhuǎn)換成為真陰性的示意圖，由此改善特異性。miR-107(圖13C)和miR-141 (圖13D)的歸一化水平在Y軸上針對(duì)所述囊泡診斷分析所得的真陽(yáng)性(TP)、所述囊泡診斷分析所得的真陰性(TN)、所述囊泡診斷分析所得的假陽(yáng)性(FP)和所述囊泡診斷分析所得的假陰性(FN)示出。miR-107和miR-141可以用于圖13A和圖13B中所示的方案中。
[0066]圖14說(shuō)明了結(jié)腸直腸癌(CRC)細(xì)胞系和患者樣品中的KRAS測(cè)序。樣品包括從細(xì)胞系(圖14B)或從患者的組織樣品(圖14D)獲得的基因組DNA，或從細(xì)胞系(圖14A)或患者的血漿樣品(圖14C)脫落的囊泡內(nèi)的RNA有效負(fù)載獲得的cDNA。
[0067]圖15說(shuō)明了來(lái)自人血漿的微RNA的免疫沉淀。圖1SA顯示了人血漿的各種部分中檢測(cè)到的平均miR-16量?！?Beads) ”是使用針對(duì)Argonaute2 (Ago2)、阿樸脂蛋白Al (ApoAl)、GW182和IgG對(duì)照的抗體共同免疫沉淀的miR-16的含量?！癉yna”是指使用Dynabea d蛋白G的免疫沉淀，而“Magna”是指Magnabind蛋白G珠。“supernt”是免疫沉淀反應(yīng)的上清液中檢測(cè)的miR-16的量。對(duì)于詳細(xì)內(nèi)容，參見(jiàn)實(shí)施例。圖15B與圖15A相同，除了檢測(cè)了 miR-92a。
[0068]圖16說(shuō)明了用PE標(biāo)記的抗-PCSA抗體和FITC標(biāo)記的抗_Ago2抗體染色的復(fù)合物的流式分選。
[0069]圖17說(shuō)明了人血漿樣品中PCSA/Ago2陽(yáng)性復(fù)合物中微RNA的檢測(cè)。血漿樣品來(lái)自患有前列腺癌(PrC)的受試者或正常對(duì)照(正常)。圖17A顯示了來(lái)自人血漿的總循環(huán)微囊泡群體中的miR-22拷貝數(shù)。圖17B顯示了使用針對(duì)PCSA和Argonaute2(Ago2)的抗體來(lái)分選血漿源的復(fù)合物。分離RNA且miR-22的拷貝數(shù)在PCSA/Ago2雙陽(yáng)性事件的群體中測(cè)定。圖17C顯示了對(duì)于每個(gè)血漿樣品通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)的PCSA/Ago2雙陽(yáng)性事件的數(shù)目。圖17D對(duì)于每個(gè)血漿樣品顯示miR-22拷貝數(shù)除以PCSA/Ago2陽(yáng)性事件總數(shù)的結(jié)果。這獲得了每個(gè)PCSA/Ago2雙陽(yáng)性復(fù)合物的miR-22拷貝數(shù)。
[0070]圖18說(shuō)明了用抗-⑶9和/或抗-PCSA染色的循環(huán)微囊泡(cMV)的流式細(xì)胞分析。圖18A說(shuō)明了使用⑶9和PCSA的標(biāo)記抗體分析血漿源的cMV。圖18B說(shuō)明了使用抗-⑶9和抗-PCSA的雙重免疫沉淀后雙陽(yáng)性⑶9/PCSA cMV的富集。比較圖18A和圖18B之間區(qū)域R7中的雙陽(yáng)性群體。圖18C說(shuō)明了使用針對(duì)PCSA的標(biāo)記抗體分析血漿源的cMV。圖18D說(shuō)明了使用抗PCSA的抗體的單一免疫沉淀后PCSA陽(yáng)性事件的富集。比較圖18C和圖18D之間區(qū)域R4中的群體。
[0071]圖19說(shuō)明了各種不同血漿部分中miR-22的水平。圖19A說(shuō)明了如通過(guò)ABITaqman檢測(cè)試劑盒(Assay ID#000398)測(cè)定的未改變血漿中的miR-22拷貝數(shù)。圖19B說(shuō)明了如通過(guò)ABI Taqman檢測(cè)試劑盒測(cè)定的從患者血衆(zhòng)濃縮的總循環(huán)微囊泡群體中的miR-22拷貝數(shù)。圖19C說(shuō)明了使用從抗-CD9柱釋放的起始材料在抗-PCSA柱上保留的miR-22拷貝數(shù)。圖19D說(shuō)明了如使用基于珠的分析測(cè)定的相對(duì)于樣品匹配PCSAMFI的miR-22拷貝數(shù)。用于雙重免疫沉淀的癌癥和正常輸入血漿的平均PCSA MFI信號(hào)分別是161.67和729.17。圖19E說(shuō)明了輸入血漿中的miR-22拷貝數(shù)。圖19F說(shuō)明了來(lái)自圖19E的輸入血漿的保留在抗-PCSA柱上的cMV的miR-22拷貝數(shù)。圖19G說(shuō)明了如使用基于珠的分析測(cè)定的相對(duì)于樣品匹配PCSA MFI的miR-22拷貝數(shù)。用于單一 IP的癌癥和正常血漿的平均PCSA MFI信號(hào)分別是69.17和526.5。
[0072]圖20A-C說(shuō)明了使用源自PCSA和PSMA蛋白的水平以及與分離自血漿的cMV相關(guān)的miR-22和let7a微RNA的評(píng)分來(lái)區(qū)分PCa和正常(非PCa)樣品。圖20A顯示了對(duì)于正常和癌癥樣品計(jì)算的評(píng)分的曲線圖。圖20B顯示了圖20A的數(shù)據(jù)，其中將正常分成正常組(無(wú)前列腺病癥)、非典型組、炎癥組和高等級(jí)前列腺上皮內(nèi)瘤組(高等級(jí)PIN，或HGPIN)，并且將癌癥分成確定為觀察等待(WW)或癌癥的組。圖20C顯示了用該數(shù)據(jù)產(chǎn)生的ROC曲線。AUC 為 0.77。
[0073]圖21顯示了用于不同樣品群體中miR-920 (圖21A)和miR_450a(圖21B)的差異表達(dá)的曲線圖。樣品包含從血漿分離的PCSA表達(dá)cMV中的微RNA。與前列腺癌(“癌癥”)和正常(“正常”)相比，miR-920在混雜疾病(即，高等級(jí)PIN( “hgpin”)和炎性疾病(“炎癥”))中過(guò)表達(dá)。與其他相比，miR-450在癌癥中下調(diào)。
[0074]圖22說(shuō)明了來(lái)自囊泡mRNA有效負(fù)載水平的微陣列譜分析的選定mRNA的減去原始背景的熒光值的點(diǎn)圖。在每個(gè)圖中，Y軸顯示了減去原始背景的熒光值(原始BGsub熒光)。X軸顯示了四個(gè)正常對(duì)照血漿和四個(gè)來(lái)自前列腺癌患者的血漿的點(diǎn)圖。所示的mRNA為 A2ML1 (圖 22A)、GABARAPL2(圖 22B)、PTMA(圖 22C)、RABACl (圖 22D)、S0X1 (圖 22E)和ETFB (圖 22F)。
[0075]圖23A-23B說(shuō)明了從非復(fù)發(fā)前列腺癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌樣品分離的囊泡中miR-141 (圖23A)和miR-375 (圖23B)的水平，如X軸上所示。使用Taqman分析檢測(cè)了從囊泡分離的miR。P值顯示于·曲線下方。Y軸顯示了檢測(cè)的miR的拷貝數(shù)。
[0076]圖24A和24B說(shuō)明了使用患者血樣來(lái)區(qū)分肺癌和正常(非肺癌)的微RNAmiR-497 ο Y-軸顯示了 0.1ml樣品中的miR-497拷貝數(shù)。在圖24A中，水平線表示1154個(gè)拷貝的拷貝數(shù)。在圖24B中，水平線表示1356的拷貝數(shù)。圖24C是用于通過(guò)檢驗(yàn)循環(huán)微囊泡(cMV)中的miR-497水平區(qū)分非-小細(xì)胞肺癌和正常血漿樣品的受試者工作特征(ROC)曲線。數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于圖24B。
[0077]圖25A是結(jié)合于載玻片的Vcap-衍生微囊泡的電子顯微照片。圖25B是Vcap-衍生的微囊泡的掃描電子顯微照片，而圖25C是結(jié)合于用聚-L-賴氨酸涂覆的聚苯乙烯珠的Vcap微囊泡的掃描電子顯微照片。圖2?說(shuō)明了按照樣品收集實(shí)驗(yàn)方案中詳細(xì)說(shuō)明的處理成血漿的血液。
[0078]圖26說(shuō)明了微RNA功能分析。圖26A顯示了標(biāo)記的合成RNA分子261-266和含有感興趣的目標(biāo)微RNA267的核蛋白復(fù)合物。圖26B證明了在被核蛋白復(fù)合物267識(shí)別時(shí)，在目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)263處的合成RNA分子的切割，由此釋放標(biāo)記265-266。圖26C-E說(shuō)明了來(lái)自各種來(lái)源的輸入核蛋白復(fù)合物。
[0079]發(fā)明詳述
[0080]本文公開(kāi)了用于表征生物樣品(如，來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物、生物體或受試者的樣品)的表型的方法和系統(tǒng)?？赏ㄟ^(guò)評(píng)估一種或多種生物標(biāo)志物表征所述表型。所述生物標(biāo)志物可與囊泡或囊泡群體關(guān)聯(lián)，其為存在的囊泡表面抗原或囊泡有效負(fù)載。如本文所使用的，囊泡有效負(fù)載包含封裝于囊泡內(nèi)的實(shí)體。囊泡相關(guān)的生物標(biāo)志物可包含膜結(jié)合的和可溶的生物標(biāo)志物。所述生物標(biāo)志物還可以是循環(huán)生物標(biāo)志物，諸如在體液中評(píng)估的核酸(例如，微RNA)或蛋白質(zhì)/多肽，或其功能性片段。除非另行說(shuō)明，本文中提及囊泡或生物標(biāo)志物組分而使用的術(shù)語(yǔ)“純化的”或“分離的”指的是這些組分從細(xì)胞或生物體中部分或完全地純化和分離。此外，除非另行說(shuō)明，所稱的使用結(jié)合劑進(jìn)行的囊泡分離包括將囊泡與所述結(jié)合劑結(jié)合，無(wú)論該結(jié)合是否使得所述囊泡與起始材料中的其它生物實(shí)體完全分離。
[0081]通過(guò)分析循環(huán)生物標(biāo)志物(如核酸生物標(biāo)志物)而表征表型的方法描述于圖1A的方案6100A中，其為非限制性說(shuō)明實(shí)例。在第一步驟6101中獲得生物樣品，如體液、組織樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物。從所述樣品中分離核酸6103。所述核酸可以是DNA或RNA，如微RNA。對(duì)這些核酸的評(píng)估可提供該表型的生物印記。通過(guò)對(duì)與目標(biāo)表型(如疾病對(duì)比健康、治療前和治療后)相關(guān)的核酸取樣，可測(cè)定作為表型的指示的一種或多種核酸標(biāo)志物。本發(fā)明的各個(gè)方面涉及通過(guò)評(píng)估在所述樣品中存在的一種或多種核酸分子(如微RNA)而確定生物印記6105，其中所述生物印記對(duì)應(yīng)于預(yù)定的表型6107。圖1B詳細(xì)說(shuō)明了使用囊泡分離所述核酸分子的方案6100B。在一個(gè)實(shí)施例中，獲得了生物樣品6102，并且從所述樣品中分離一種或多種囊泡6104，如來(lái)自特定細(xì)胞源的囊泡和/或與特定疾病狀態(tài)相關(guān)的囊泡。通過(guò)表征與所述囊泡關(guān)聯(lián)的表面抗原和/或測(cè)定所述囊泡中存在的組分(“有效負(fù)載”)的存在或水平而分析所述囊泡6106。除非另行說(shuō)明，本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”通常指的是可被結(jié)合劑結(jié)合的生物標(biāo)志物，無(wú)論所述結(jié)合劑是抗體、適體、凝集素或用于所述生物標(biāo)志物的其它結(jié)合劑，并且無(wú)論這些生物標(biāo)志物是否在宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答。囊泡有效負(fù)載可以是蛋白質(zhì)(包括肽和多肽)和/或核酸(如DNA和RNA)。RNA有效負(fù)載包括信使RNA (mRNA)和微RNA (本文中亦稱為miRNA或miR)。根據(jù)所述囊泡的生物印記表征表型6108。在本發(fā)明的另一個(gè)說(shuō)明性方法中，方案6100A和6100B —起實(shí)施以表征表型。在這樣的方案中，評(píng)估了囊泡和核酸(如微RNA)，從而表征所述表型。
[0082]在一個(gè)相關(guān)的方面，本文提供了用于發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的方法，其包括評(píng)估一個(gè)樣品中的囊泡表面標(biāo)志物或有效負(fù)載標(biāo)志物以及將所述標(biāo)志物與另一樣品進(jìn)行比較。在所述樣品之間區(qū)分的標(biāo)志物可用作本發(fā)明的生物標(biāo)志物。這些樣品可以來(lái)自受試者或受試者組。例如，所述組可以是，例如，對(duì)于給定疾病或失調(diào)的給定治療的已知反應(yīng)者和非反應(yīng)者。發(fā)現(xiàn)區(qū)分所述已知反應(yīng)者和非反應(yīng)者的生物標(biāo)志物提供了關(guān)于患者是否可能對(duì)治療(諸如治療劑，如藥物或生物制品)有反應(yīng)的生物印記。
[0083]表型
[0084]本文公開(kāi)了通過(guò)分析囊泡(諸如膜囊泡)來(lái)表征個(gè)體的表型的產(chǎn)品和方法。表型可以為患者的任何可觀察的特征或性狀，例如疾病或狀況、疾病階段或狀況階段、疾病或狀況的易感性、疾病階段或狀況的預(yù)后、生理狀態(tài)或?qū)χ委煹姆磻?yīng)。表型可以由受試者的基因表達(dá)及環(huán)境因素的影響以及這二者之間的相互作用引起，以及由對(duì)核酸序列的外遺傳修飾引起。
[0085]受試者中的表型可以通過(guò)從受試者獲得生物樣品并分析所述樣品中的一種或多種囊泡來(lái)表征。例如，表征受試者或個(gè)體的表型可以包括檢測(cè)疾病或狀況(包括癥狀前的早期階段檢測(cè))，確定疾病或狀況的預(yù)后、診斷或治療診斷，或者確定疾病或狀況的階段或進(jìn)程。表征表型還可以包括鑒定針對(duì)特定疾病、狀況、疾病階段或狀況階段的適當(dāng)治療或治療效力、疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)和可能性分析，特別是疾病重新發(fā)生、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散或疾病復(fù)發(fā)。表型還可以為狀況或疾病(例如癌癥或腫瘤)的臨床上獨(dú)特的類型或亞型。表型的確定還可以為生理狀況的確定、器官危境或器官排斥(例如移植后)的評(píng)估。本文所述的產(chǎn)品和方法允許在個(gè)體的基礎(chǔ)上評(píng)估受試者，其可以提供在治療中的更有效和更經(jīng)濟(jì)的決策的益處。
[0086]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及生物樣品的分析以鑒定生物印記，從而預(yù)測(cè)受試者是否可能對(duì)疾病或失調(diào)的治療有反應(yīng)。表征表型包括預(yù)測(cè)所述受試者的響應(yīng)者/無(wú)響應(yīng)者狀態(tài)，其中響應(yīng)者對(duì)疾病的治療有反應(yīng)而無(wú)響應(yīng)者對(duì)所述治療無(wú)反應(yīng)?？稍谒鍪茉囌咧蟹治瞿遗莶⑴c已知對(duì)治療有反應(yīng)或沒(méi)有反應(yīng)的先前受試者的囊泡分析進(jìn)行比較。如果所述受試者中的囊泡生物印記與已知對(duì)所述治療有反應(yīng)的先前受試者更為接近，則所述受試者可表征或預(yù)測(cè)為所述治療的響應(yīng)者。類似地，如果所述受試者中的囊泡生物印記與對(duì)所述治療無(wú)反應(yīng)的此前受試者更為接近，則所述受試者可表征或預(yù)測(cè)為所述治療的無(wú)響應(yīng)者。所述治療可以針對(duì)任意適當(dāng)?shù)募膊?、失調(diào)或其它狀況。在與響應(yīng)者/無(wú)響應(yīng)者狀態(tài)相關(guān)的囊泡生物印記已知的情況下，所述方法可用于任意疾病情況中。
[0087]本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“表型”可以指貢獻(xiàn)于囊泡生物印記的任何性狀或特征，該生物印記使用本發(fā)明的方法而鑒定。例如，表型可以是患者可能對(duì)治療有反應(yīng)的標(biāo)識(shí)，或更廣義地其可為基于針對(duì)獲自受試者的樣品鑒定的生物印記的診斷、預(yù)后或治療診斷確定。
[0088]在一些實(shí)施方案中，所述的表型包括疾病或狀況，如表1中所列的那些。例如，所述的表型可包括腫瘤、贅生物或癌癥的存在或發(fā)生腫瘤、贅生物或癌癥的可能性。通過(guò)本文所述的產(chǎn)品或方法檢測(cè)或評(píng)估的癌癥包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、增生性息肉、腺瘤、結(jié)腸直腸癌、高度異型增生(high grade dysplasia)、低度異型增生(1Wgradedysplasia)、前列腺增生、前列腺 癌、黑色素瘤、胰腺癌、腦癌(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、血液惡性腫瘤、肝細(xì)胞癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、頭頸癌、食管癌、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、腎細(xì)胞癌(RCC)或胃癌。所述的結(jié)腸直腸癌可以為CRC Dukes B或CRC Dukes C-D。所述的血液惡性腫瘤可以為B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤-DLBCL、B細(xì)胞淋巴瘤-DLBCL-生發(fā)中心樣、B細(xì)胞淋巴瘤-DLBCL-活化B細(xì)胞樣以及伯基特氏淋巴瘤。
[0089]所述表型可以是惡變前狀況，諸如光化性角化病、萎縮性胃炎、白斑病、增殖性紅斑、淋巴瘤樣肉芽腫病、白血病前期、纖維癥、宮頸非典型增生、子宮頸非典型增生、著色性干皮病、巴雷特食管、結(jié)腸直腸息肉或有可能發(fā)展成為惡性腫瘤的其它異常組織生長(zhǎng)或病灶。諸如HIV和HPV的轉(zhuǎn)化型病毒感染也提供了可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行評(píng)估的表型。
[0090]通過(guò)本發(fā)明的方法表征的癌癥可包括但不限于，癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖細(xì)胞瘤、胚細(xì)胞瘤或其它癌癥。癌瘤包括但不限于，上皮腫瘤、鱗狀細(xì)胞腫瘤鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞腫瘤基底細(xì)胞癌、移行細(xì)胞乳頭狀瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺體)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰島瘤(linitisplastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性腸肽瘤、膽管癌、肝細(xì)胞癌、囊性腺樣癌、闌尾類癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒細(xì)胞瘤、許特萊氏細(xì)胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、腎細(xì)胞癌、格拉維茨瘤(grawitztumor)、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤、子宮內(nèi)膜腺瘤、附件和皮膚附件腫瘤、粘液表皮樣腫瘤、囊性、粘液性和漿液性腫瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、導(dǎo)管、小葉和髓質(zhì)腫瘤、腺泡細(xì)胞腫瘤、復(fù)合上皮腫瘤、沃辛腫瘤(warthin' s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺腫瘤、性索間質(zhì)瘤、泡膜細(xì)胞瘤、粒膜細(xì)胞瘤、卵巢含睪丸母細(xì)胞瘤、支持細(xì)胞睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤、血管球瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、血管神經(jīng)肌瘤、痣與黑色素瘤、黑素細(xì)胞痣、惡性黑色素瘤、黑色素瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、發(fā)育不良痣、惡性痣性黑色素瘤、淺表擴(kuò)散性黑色素瘤以及惡性肢端著色斑性黑色素瘤。肉瘤包括但不限于，Askin’ s腫瘤、葡萄狀肉瘤(botryodies)、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤，其包括:腺泡狀軟組織肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤、促結(jié)締組織增生性小圓形細(xì)胞瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管肉瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限于，慢性淋巴細(xì)胞性白血病/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴衆(zhòng)細(xì)胞性淋巴瘤(Iymphoplasmacyticlymphoma)(諸如
Waldenstrom巨球蛋白血癥)、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、衆(zhòng)細(xì)胞骨髓瘤、衆(zhòng)細(xì)胞瘤、單克隆免疫球蛋白沉積病、重鏈病、亦稱為malt淋巴瘤的結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(nmzl)、濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細(xì)胞淋巴瘤、血管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、T細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞白血病、侵襲性NK細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞性白血病/淋巴瘤、結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤、肝脾T細(xì)胞淋巴瘤、母細(xì)胞性NK細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣霉菌病/塞澤里綜合征(sezary syndrome)、原發(fā)性皮膚⑶30陽(yáng)性T細(xì)胞淋巴組織增生性疾病、原發(fā)性皮膚間變性大細(xì)胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、非指定、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤(結(jié)節(jié)性硬化、混合細(xì)胞性、富淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞耗盡或非耗盡)以及結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤。生殖細(xì)胞腫瘤包括但不限于，生殖細(xì)胞瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、非生殖細(xì)胞瘤性生殖細(xì)胞瘤、胚胎癌、內(nèi)胚竇腫瘤、絨毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺細(xì)胞瘤。胚細(xì)胞瘤包括但不限于，腎母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。其它癌癥包括但不限于，唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲狀腺癌(延髓和乳頭狀甲狀腺癌)、腎癌、腎實(shí)質(zhì)癌、子宮頸癌、子宮體癌、子宮內(nèi)膜癌、絨毛膜癌、睪丸癌、泌尿系癌、黑色素瘤、腦腫瘤(·如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、腦膜瘤、髓母細(xì)胞瘤和外周神經(jīng)外胚層腫瘤)、膽囊癌、支氣管癌、多發(fā)性骨髓瘤、基底細(xì)胞癌、畸胎瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、脈絡(luò)膜黑色素瘤、精原細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、盧頁(yè)咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、尤文氏肉瘤和漿細(xì)胞瘤。
[0091]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，進(jìn)行分析的癌癥可以是肺癌，其包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌(包括小細(xì)胞癌(燕麥細(xì)胞癌)、小細(xì)胞/大細(xì)胞混合癌以及復(fù)合性小細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、腦癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、乳頭狀癌腎癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或?qū)嶓w腫瘤。
[0092]在實(shí)施方案中，所述癌癥包括急性成淋巴細(xì)胞性白血?。患毙怨撬栊园籽?’腎上腺皮質(zhì)癌；AIDS相關(guān)癌癥；AIDS相關(guān)淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細(xì)胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細(xì)胞癌；膀胱癌；腦干膠質(zhì)瘤；腦腫瘤(包括腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎樣瘤、星形細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和成松果體細(xì)胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發(fā)部位不明癌；類癌瘤；原發(fā)部位不明腫瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌癥；脊索瘤；慢性淋巴細(xì)胞性白血病；慢性骨髓性白血?。宦怨撬柙鲋澄蓙y；結(jié)腸癌；結(jié)腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細(xì)胞淋巴瘤；內(nèi)分泌胰島細(xì)胞瘤；子宮內(nèi)膜癌；成室管膜母細(xì)胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞瘤；尤文氏肉瘤；顱外生殖細(xì)胞瘤；性腺外生殖細(xì)胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤；胃腸道間質(zhì)瘤(GIST);妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；毛細(xì)胞白血??；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內(nèi)黑色素瘤；胰島細(xì)胞瘤；卡波濟(jì)氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細(xì)胞瘤骨癌；髓母細(xì)胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細(xì)胞癌；Merkel細(xì)胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發(fā)性的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征；多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發(fā)育異常綜合征；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細(xì)胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細(xì)胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤??；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤；成松果體細(xì)胞瘤；垂體瘤；漿細(xì)胞腫瘤/多發(fā)性骨髓瘤；胸膜肺母細(xì)胞瘤；原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤；原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細(xì)胞(腎)癌；腎細(xì)胞癌；呼吸道癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌癥；S6zary綜合征；小細(xì)胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細(xì)胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤；T細(xì)胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細(xì)胞癌；腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌；滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstrom巨球蛋白血癥或腎母細(xì)胞瘤。本發(fā)明的方法可用于表征這些及其它癌癥。因此，對(duì)表型的表征可提供本文公開(kāi)的癌癥之一的診斷、預(yù)后和治療診斷。
[0093]所述的表型還可以為炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如，所述的疾病可以為炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(⑶)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、盆腔炎癥、脈管炎、銀屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無(wú)力、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、強(qiáng)直性脊柱炎、Sjogrens病、CREST綜合征、硬皮病、風(fēng)濕病、器官排 斥反應(yīng)、原發(fā)性硬化性膽管炎或膿毒癥。
[0094]所述的表型還可以包括心血管疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、易損斑塊、中風(fēng)或局部缺血。所述的心血管疾病或狀況可以為高血壓、狹窄癥、血管阻塞或血栓形成事件。
[0095]所述的表型還可以包括神經(jīng)疾病，例如多發(fā)性硬化癥(MS)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、精神分裂癥、雙相型障礙、抑郁癥、孤獨(dú)癥、朊病毒病、皮克病、癡呆、亨廷頓病(HD)、唐氏綜合征、腦血管疾病、Rasmussen腦炎、病毒性腦膜炎、神經(jīng)精神性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(NPSLE)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、傳染性海綿狀腦病、缺血再灌注損傷(例如中風(fēng))、腦外傷、微生物感染或慢性疲勞綜合征。所述的表型還可以為諸如纖維肌痛、慢性神經(jīng)病理性疼痛或周圍神經(jīng)病理性疼痛的狀況。
[0096]所述的表型還可以包括感染性疾病，例如細(xì)菌、病毒或酵母菌感染。例如，所述的疾病或狀況可以為惠普爾氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、腦膜炎、瘧疾、結(jié)核病或流行性感冒?？梢栽u(píng)估囊泡中的病毒蛋白質(zhì)(例如HIV或HCV樣顆粒)從而表征病毒狀況。
[0097]所述的表型還可以包括圍產(chǎn)期或妊娠相關(guān)的狀況(例如先兆性子癇或早產(chǎn))、代謝疾病或狀況(例如與鐵代謝有關(guān)的代謝疾病或狀況)。例如，可以測(cè)定在囊泡中的鐵調(diào)素(hepcidin)從而表征鐵缺乏。所述的代謝疾病或狀況還可以為糖尿病、炎癥或圍產(chǎn)期狀況。
[0098]本發(fā)明的方法可以用于表征這些疾病和失調(diào)和表征可通過(guò)包含一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的候選生物印記評(píng)價(jià)的其他疾病和失調(diào)。因此，表征表型可以提供本文中公開(kāi)的疾病和失調(diào)之一的診斷、預(yù)后或治療診斷。
[0099]在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案中，用于本文中公開(kāi)的任何病癥或疾病的生物印記可以包含幾個(gè)不同的標(biāo)志物類別之一中的一種或多種生物標(biāo)志物，其中所述類別包括以下的一種或多種:1)疾病特異性標(biāo)志物；2)細(xì)胞-或組織-特異性生物標(biāo)志物；3)囊泡-特異性標(biāo)志物(例如，一般囊泡生物標(biāo)志物)；4.血管生成-特異性生物標(biāo)志物；和5)免疫調(diào)節(jié)生物標(biāo)志物。本文中公開(kāi)了所有這些標(biāo)志物的實(shí)例，并且它們是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。此外，鑒定為在特定疾病或病癥中具有作用的本領(lǐng)域已知的生物標(biāo)志物適于用作本發(fā)明的組合物和方法中的靶標(biāo)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這樣的生物標(biāo)志物可以全部是所有囊泡表面標(biāo)志物，或囊泡表面標(biāo)志物和囊泡有效負(fù)載標(biāo)志物(即，囊泡包裹的分子)的組合。此外，如本文中所述，所評(píng)估的生物樣品可以是任何生物流體，或可以包含這樣的生物流體內(nèi)存在的單個(gè)組分(例如，囊泡、核酸、蛋白質(zhì)或其復(fù)合物)。
[0100]受試者
[0101]可通過(guò)分析從受試者獲得的生物樣品中的一種或多種囊泡(如多種囊泡)來(lái)確定受試者的一種或多種表型。`受試者或患者可以包括但不限于哺乳動(dòng)物，例如牛、鳥(niǎo)、犬、馬、貓、綿羊、豬或靈長(zhǎng)動(dòng)物(包括人及非人靈長(zhǎng)動(dòng)物)。受試者還可以包括:由于瀕危而變得重要的哺乳動(dòng)物，例如西伯利亞虎；或者具有經(jīng)濟(jì)意義的動(dòng)物(例如用于人消費(fèi)的農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)動(dòng)物)，或?qū)θ祟惗跃哂猩鐣?huì)意義的動(dòng)物(例如作為寵物或在動(dòng)物園中飼養(yǎng)的動(dòng)物)。此類動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于:食肉動(dòng)物，例如貓和狗；豬，包括畜養(yǎng)豬、食用豬和野豬；反芻動(dòng)物或有蹄類動(dòng)物，例如牛、公牛、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、鹿、山羊、野牛、駱駝或馬。此外，還包括瀕危的或在動(dòng)物園中飼養(yǎng)的鳥(niǎo)；以及禽類，和更特別的是家養(yǎng)的禽類，即，家禽，例如火雞和雞、鴨、鵝、珍珠雞。還包括家養(yǎng)的豬和馬(包括賽馬)。此外，與商業(yè)活動(dòng)有關(guān)的任何動(dòng)物種類也都被包括在內(nèi)，例如與農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)業(yè)和其它活動(dòng)有關(guān)的動(dòng)物，所述行業(yè)中為了經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)率和/或食物鏈的安全而常規(guī)實(shí)施疾病監(jiān)測(cè)、診斷和療法的選擇。
[0102]所述的受試者可以患有先前存在的疾病或狀況，例如癌癥?；蛘撸龅氖茉囌呖梢圆⑽椿既魏我阎南惹按嬖诘臓顩r。所述的受試者還可以對(duì)現(xiàn)有或過(guò)去的治療是非反應(yīng)性的，例如對(duì)癌癥的治療是非反應(yīng)性的。
[0103]樣品
[0104]得自所述受試者的生物樣品可以為任何體液或生物流體。例如，所述的生物樣品可以為任何生物流體包括但不限于外周血、血清、血漿、腹水、尿、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或預(yù)射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛發(fā)、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、經(jīng)血、膿液、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管肺抽吸液或其它灌洗液。生物樣品還可以包括囊胚腔、臍帶血或母體循環(huán)血(其可以為胎兒來(lái)源或母體來(lái)源的)。所述的生物樣品還可以為組織樣品或組織活檢樣品，從中可獲得囊泡和其它循環(huán)生物標(biāo)志物。例如，可以培養(yǎng)得自樣品的細(xì)胞，并且從所述培養(yǎng)物中分離囊泡(例如參見(jiàn)實(shí)施例1)。在各個(gè)實(shí)施方案中，可由這些生物樣品直接評(píng)估本發(fā)明公開(kāi)的生物標(biāo)志物和/或生物印記(如，對(duì)核酸或者多肽生物標(biāo)志物或其功能性片段的存在或水平的鑒定)，其使用各種方法，諸如，從血液、血漿、血清或任意前述生物樣品中提取核酸分子，使用蛋白質(zhì)或抗體陣列鑒定多肽(或功能性片段)生物標(biāo)志物，以及本領(lǐng)域中已知用于鑒定和評(píng)估核酸和多肽分子的其它陣列、測(cè)序、PCR和蛋白質(zhì)組技術(shù)。此外，可以首先分離或富集這些樣品中存在的一種或多種成分，并且進(jìn)一步處理以評(píng)估選定生物標(biāo)志物的存在或水平，例如，評(píng)估給定的生物印記。例如，可以在針對(duì)蛋白質(zhì)和/或核酸生物標(biāo)志物對(duì)微囊泡進(jìn)行分型之前，從樣品分離微囊泡。
[0105]表1列出了疾病、狀況或生物學(xué)狀態(tài)的說(shuō)明性實(shí)例，以及可以對(duì)其中的囊泡進(jìn)行分析的生物樣品的相應(yīng)列表。
[0106]表1:針對(duì)各種疾病、狀況或生物學(xué)狀態(tài)，用于囊泡分析的生物樣品的實(shí)例
[0107]
[0108]
【權(quán)利要求】
1.一種方法，其包括: (a)測(cè)定生物樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括一種或多種選自表5的生物標(biāo)志物；和 (b)鑒定包括所述一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平的生物印記。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a_5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517木、miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、miR-542-5p、miR-30b*、miR-1179 及其組合。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自miR-22、let7a、miR-141、miR-920、miR-450a 及其組合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自表20-24任一個(gè)中的基因組成的組的信使RNA (mRNA)及其組合。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自A2ML1、ΒΑΧ、C10orf47、Clorfl62, CSDA, EIFC3、ETFB, GABARAPL2、GUKU GZMH、HIST1H3B、HLA-A,HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA, RABACl、RABAGAP1L、RPL22、SAP18、SEPffU SOXl 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自A2ML1、GABARAPL2、PTMA, RABACl、SOXl、EFTB 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自CA-125、CA19-9、c-反應(yīng)蛋白、CD95、FAP-1、EGFR、EGFRvII1、阿樸脂蛋白Al、阿樸脂蛋白CII1、肌紅蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封閉蛋白-3、封閉蛋白-4、小窩蛋白-1、凝血因子II1、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rabl3、橋粒芯膠蛋白-1、EMP_2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜聯(lián)蛋白 V、MFG-E8、HLA-DR、miR200 微 RNA、miR_200c 及其組合。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自CA-125、CA19-9, c_反應(yīng)蛋白、CD95、FAP-1及其組合。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自hsa-miR-574-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-107、hsa_miR-301a、hsa-miR-484、hsa-miR-625* 及其組合。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自hsa-miR-582-3p、hsa-miR_20a*、 hsa-miR-375、 hsa_miR-200b、 hsa-miR-379、 hsa-miR-572、hsa-miR-513a_5p、 hsa-miR-577、 hsa_miR-23a*、 hsa-miR-1236、 hsa-miR-609、hsa-miR-17*、hsa_miR-130b、hsa-miR-619、hsa-miR-624*、hsa-miR-198 及其組合。
11.權(quán)利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括miR-497。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自AQP2、BMP5、C16orf86、CXCLl3、DST、ERCC1、GNA01、KLHL5、MAP4KU NELL2、PENK、PGF、P0U3F1、PRSS21、SCMLl、SEMGl、SMARCD3、SNAI2, TAF1C、TNNT3 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自ADRB2、ARG2、C22orf32、CYorf 14, EIFlAY, FEV, KLK2、KLK4、LRRC26、MAOA、NLGN4Y、PNPLA7、PVRL3、SIM2,SLC30A4、SLC45A3、STX19 、TR頂36、TRPM8 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自ADRB2、BAIAP2L2、C19orf33、CDX1、CEACAM6、EEF1A2、ERN2、FAMl 10B、F0XA2、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MIPOLl、SLC45A3、SPDEF, TRIM3U TRIM36, ZNF613 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自ASTN2、CAB39L、CRIP1、FAMlIOB、FEV、GSTP1、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MUC1、PNPLA7、S頂2、SLC45A3、SPDEF, TRIM36, TRPV6、ZNF613 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自miRs-26a+b、miR-15、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424、miR-206、miR-342_5p、miR-186、miR-1271、miR-600、miR-216b、miR-519 家族、miR-203 及其組合的微 RNA。
17.—種方法,其包括: (a)從生物樣品分離一種或多種核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物； (b)用所述一種或多種核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物確定一種或多種核酸生物標(biāo)志物的存在或水平；和 (C)鑒定包括所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物的存在或水平的生物印記。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物包含括選自一種或多種Argonaute 家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPM1 (核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLP1、RPS12、RPS19、SNRPG、TR0VE2、阿樸脂蛋白、阿樸脂蛋白A、apo A_1、apo A_I1、apo A_IV、apo A_V、阿樸脂蛋白B、apo B48、apo B100、阿樸脂蛋白 C、apo C-1、 apo C_I1、apo C-III、 apo C_IV、阿樸脂蛋白D (ApoD)、阿樸脂蛋白E (ApoE)、阿樸脂蛋白H(ApoH)、阿樸脂蛋白L、APOLl、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6、APOLDl及其組合的一種或多種蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物包含選自一種或多種Argonaute家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)及其組合的一種或多種蛋白質(zhì)。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物包含一種或多種選自Ago2、阿樸脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其組合的蛋白質(zhì)。
21.權(quán)利要求17的方法,其中所述一種或多種核酸包括一種或多種微RNA。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述一種或多種微RNA包括表5中的微RNA。
23.權(quán)利要求21的方法,其中所述一種或多種微RNA包括一種或多種選自miR-22、miR-16、miR-148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其組合的微 RNA。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物包含一種或多種選自Ago2、阿樸脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其組合的蛋白質(zhì)；并且所述一種或多種微RNA包括一種或多種選自miR-16和miR-92a及其組合的微RNA。
25.—種方法,其包括: (a)檢測(cè)來(lái)自生物樣品的微囊泡群體中的一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物； (b)確定與所檢測(cè)的微囊泡群體相關(guān)的一種或多種核酸生物標(biāo)志物的存在或水平；和 (C)鑒定包括所述一種或多種核酸的存在或水平的生物印記。
26.權(quán)利要求25的方法，其中將所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物的水平相對(duì)于所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的水平標(biāo)準(zhǔn)化。
27.權(quán)利要求25的方法,其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括一種或多種選自PCSA、Ago2、⑶9及其組合的蛋白質(zhì)。
28.權(quán)利要求25的方法,其中所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物包括一種或多種選自miR-22、miR-16、miR-148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其組合的微 RNA。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物包括PCSA和Ago2;并且所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物包括miR-22。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物包括PCSA和/或⑶9；并且所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物包括miR-22。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物包括PCSA;并且所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物包括選自表22-24任一個(gè)中的信使RNA (mRNA)。
32.權(quán)利要求25的方法，其中所述生物印記包括從所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物和一種或多種核酸生物標(biāo)志物的水平的比率計(jì)算的評(píng)分。
33.權(quán)利 要求32的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物包括PCSA和PSMA，并且所述一種或多種核酸生物標(biāo)志物包括miR-22和let7a。
34.權(quán)利要求32的方法，其中計(jì)算評(píng)分包括取以下的總和: (a)微囊泡亞群體中miR-22有效負(fù)載的水平除以與微囊泡亞群體相關(guān)的PCSA蛋白質(zhì)的水平的第一倍數(shù)； (b)微囊泡亞群體中l(wèi)et7a有效負(fù)載的水平除以與微囊泡亞群體相關(guān)的PCSA蛋白質(zhì)的水平的第二倍數(shù)；和 (c)與微囊泡亞群體相關(guān)的PSMA蛋白的水平的第三倍數(shù)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中計(jì)算評(píng)分包括所述總和的單調(diào)變換。
36.權(quán)利要求34的方法，其中第一倍數(shù)是10。
37.權(quán)利要求34的方法，其中第二倍數(shù)是10。
38.權(quán)利要求34的方法，其中第三倍數(shù)是I。
39.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，進(jìn)一步包括將所述生物印記與參照生物印記進(jìn)行比較，其中所述比較用于表征癌癥。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述參照生物印記來(lái)自未患癌癥的受試者。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述表征包括鑒定受試者中癌癥的存在或風(fēng)險(xiǎn)，或鑒定受試者中癌癥是轉(zhuǎn)移性的或侵襲性的。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述比較步驟包括確定生物印記是否相對(duì)于參照生物印記有改變，由此提供癌癥的預(yù)后、診斷或治療診斷確定。
43.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述生物樣品包括體液。
44.權(quán)利要求43的方法，其中體液包括外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或預(yù)射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛發(fā)、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、經(jīng)血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。
45.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述生物樣品包括尿液、血液或血液衍生物。
46.權(quán)利要求1-43任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品包括細(xì)胞培養(yǎng)物。
47.權(quán)利要求1-43任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品包括組織樣品。
48.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述生物樣品含有一種或多種微囊泡。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物與所述一種或多種微囊泡相關(guān)。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述一種或多種微囊泡具有20nm至2000nm的直徑。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述一種或多種微囊泡具有20nm至200nm的直徑。
52.權(quán)利要求48的方法，其中所述一種或多種微囊泡經(jīng)受尺寸排阻色譜、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、親和捕獲、免疫分析、微流體分離、流式細(xì)胞分析或其組合。
53.權(quán)利要求48的方法，其中將所述一種或多種微囊泡接觸一種或多種結(jié)合劑。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述一種或多種結(jié)合劑包括核酸、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PM)、鎖核酸(LNA)、凝集素、肽、枝狀物、膜蛋白標(biāo)記劑、化學(xué)化合物或其組合。
55.權(quán)利要求53的方法,其中所述一種或多種結(jié)合劑用于捕獲和/或檢測(cè)一種或多種微囊泡。
56.權(quán)利要求53的方法，其中所述一種或多種結(jié)合劑結(jié)合一種或多種微囊泡上的一種或多種表面抗原。
57.權(quán)利要求56的方法,`其中所述一種或多種表面抗原包括一種或多種蛋白質(zhì)。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)包括⑶9、⑶63、⑶81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam中的一種或多種。
59.權(quán)利要求57的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)包括四跨膜蛋白、⑶9、⑶63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD52、Rab-5b、膜聯(lián)蛋白 V、MFG_E8 或表 3 中的蛋白質(zhì)中的一種或多種。
60.權(quán)利要求57的方法,其中所述一種或多種蛋白質(zhì)包括表3-5任一個(gè)中的一種或多種蛋白質(zhì)。
61.權(quán)利要求53的方法,其中所述一種或多種結(jié)合劑用于捕獲所述一種或多種微囊泡。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括所述一種或多種捕獲的微囊泡內(nèi)的有效負(fù)載。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述有效負(fù)載包含一種或多種核酸、肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述核酸包括一種或多種DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、si RNA、hnRNA 或 shRNA。
65.權(quán)利要求62的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括mRNA。
66.權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥包括急性成淋巴細(xì)胞性白血??；急性骨髓性白血病；腎上腺皮質(zhì)癌；AIDS相關(guān)癌癥；AIDS相關(guān)淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細(xì)胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細(xì)胞癌；膀胱癌；腦干膠質(zhì)瘤；腦腫瘤(包括腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性瘤、星形細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和成松果體細(xì)胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發(fā)部位不明的癌癥；類癌瘤；原發(fā)部位不明的癌瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌癥；脊索瘤；慢性淋巴細(xì)胞性白血??；慢性骨髓性白血?。宦怨撬柙鲋澄蓙y；結(jié)腸癌；結(jié)腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細(xì)胞淋巴瘤；內(nèi)分泌胰島細(xì)胞瘤；子宮內(nèi)膜癌；成室管膜母細(xì)胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞瘤；尤文氏肉瘤；顱外生殖細(xì)胞瘤；性腺外生殖細(xì)胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤；胃腸道間質(zhì)瘤(GIST);妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；毛細(xì)胞白血病；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內(nèi)黑色素瘤；胰島細(xì)胞瘤；卡波濟(jì)氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細(xì)胞瘤骨癌；髓母細(xì)胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細(xì)胞癌；Merkel細(xì)胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發(fā)性的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征；多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發(fā)育異常綜合征；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細(xì)胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細(xì)胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤??；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤；成松果體細(xì)胞瘤；垂體瘤；漿細(xì)胞腫瘤/多發(fā)性骨髓瘤；胸膜肺母細(xì)胞瘤；原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤；原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細(xì)胞(腎)癌；腎細(xì)胞癌；呼吸道癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌癥；S6zary綜合征；小細(xì)胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細(xì)胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤；T細(xì)胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細(xì)胞癌；腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌；滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstr6m巨球蛋白血癥jwilm’ s腫瘤。
67.從屬于權(quán)利要求1-6、9-10或12-38任一項(xiàng)的權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥包括前列腺癌。
68.從屬于權(quán)利要求1、11、15、17-22、25或26任一項(xiàng)的權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥包括肺癌。`
69.從屬于權(quán)利要求1、13、17-22、25或26任一項(xiàng)的權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥包括乳腺癌。
70.從屬于權(quán)利要求1、14、17-22,25或26任一項(xiàng)的權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥包括結(jié)腸直腸癌。
71.從屬于權(quán)利要求1、7-8、17-22、25或26任一項(xiàng)的權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥包括卵巢癌。
72.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述方法在體外進(jìn)行。
73.用于實(shí)施前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法的試劑的用途。
74.—種包含配置為實(shí)施權(quán)利要求1-72任一項(xiàng)的方法的試劑的試劑盒。
75.權(quán)利要求74的試劑盒，其中所述試劑是能夠結(jié)合表3-5、9-11、16-27、29或31-32任一個(gè)中的至少一種生物標(biāo)志物的結(jié)合劑。
76.分離的PCSA+囊泡。
77.權(quán)利要求76的囊泡，包含一種或多種選自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a_5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517*、miR_450a、miR-920、hsa_miR-619、miR_1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR-376a、miR-542_5p、miR-30b*、miR-1179 及其組合的微 RNA。
78.權(quán)利要求76的囊泡，包含一種或多種選自表20-24任一個(gè)中的信使RNA(mRNA)。
79.一種組合物，其包含: (a)寡核苷酸，其包含栓系于基底的第一部分，與目標(biāo)微RNA序列至少75%互補(bǔ)的第二部分，和包含標(biāo)記的第三部分，其中第二部分位于第一和第三部分之間；和
(b)微RNA。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述基底包括平面基底、柱或珠。
81.權(quán)利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第二部分與(b)中的微RNA至少75%、80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 互補(bǔ)。
82.權(quán)利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第二部分與目標(biāo)微RNA序列至少80%、85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 互補(bǔ)。
83.權(quán)利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是間接標(biāo)記的。
84.權(quán)利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是生物素化的。
85.權(quán)利要求83的方法，其中所述標(biāo)記包括抗生蛋白鏈菌素。
86.權(quán)利要求79的方法,其中所述寡核苷酸的第三部分的標(biāo)記包括突光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記。
87.權(quán)利要求79的方法，其中所述標(biāo)記包括藻紅蛋白(PE)。
88.權(quán)利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是間接標(biāo)記的。
89.權(quán)利要求79的方法，其中(b)中的所述微RNA處于與蛋白質(zhì)的復(fù)合物中。
90.權(quán)利要求89的方法,其中所述蛋白質(zhì)選自Argonaute家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB, ILF2、NCL (核仁素)、NPMl (核磷蛋白)、RPLlOA、RPL5、RPLPl、RPS12、RPS19、SNRPG, TR0VE2、阿樸脂蛋白、阿樸脂蛋白 A、apo A-1> apo A-1I> apo A-1V、apo A-V、阿樸脂蛋白 B、apo B48、apo B100、阿樸脂蛋白 C、apo C-1、apo C-11、apoC-1I1、apo C-1V、阿樸脂蛋白 D(ApoD)、阿樸脂蛋白 E(ApoE)、阿樸脂蛋白 H(ApoH)、阿樸脂蛋白 L、AP0L1、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6 和 AP0LD1。
91.權(quán)利要求89的方法,其中所述蛋白質(zhì)選自Agol、Ago2、Ago3和Ago4。
92.權(quán)利要求89的方法，其中所述蛋白質(zhì)包括重組蛋白質(zhì)。
93.權(quán)利要求92的方法，其中所述蛋白質(zhì)包括Ago2。
94.權(quán)利要求79的方法，其中所述組合物包括生物樣品。
95.權(quán)利要求79的方法，其中所述微RNA從生物樣品分離。
96.權(quán)利要求94或95的方法，其中所述生物樣品包括體液。
97.權(quán)利要求96的方法，其中所述體液包括外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或預(yù)射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛發(fā)、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、經(jīng)血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。
98.權(quán)利要求96的方法，其中所述體液包括尿液、血液或血液衍生物。
99.權(quán)利要求95的方法，其中所述微RNA在與蛋白質(zhì)的復(fù)合物中分離。
100.—種方法，其包括: (i)提供權(quán)利要求79-99任一項(xiàng)的組合物； (?)在允許所述微RNA結(jié)合所述寡核苷酸的條件下孵育所述組合物；和 (iii)檢測(cè)標(biāo)記從基底切割的量。
101.權(quán)利要求100的方法，其中檢測(cè)標(biāo)記從基底切割的量包括檢測(cè)在步驟(ii)之前和之后接觸基底的標(biāo)記的量。
102.權(quán)利要求100的方法，其中標(biāo)記從基底切割指示與微RNA復(fù)合的蛋白質(zhì)的存在。
103.權(quán)利要求102的方法,其中所述蛋白質(zhì)選自Agol、Ago2、Ago3和Ago4。
104.權(quán) 利要求100的方法，其中實(shí)時(shí)觀察標(biāo)記從基底切割的量。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103797131SQ201280039945
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月16日
【發(fā)明者】K·布朗, T·保羅斯基, D·斯佩特茨勒 申請(qǐng)人:卡里斯生命科學(xué)盧森堡控股有限責(zé)任公司