專利名稱：一種免疫毒素及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學領域，具體的說，涉及一種免疫毒素，以及含有這種免疫毒素的 載體、轉(zhuǎn)化的菌株和用途。
背景技術：
器官移植是20世紀醫(yī)學的重大成就之一，是多種臟器終末性疾病目前唯一的治 療手段。僅我國每年新增的肝、腎及心臟功能衰竭患者就達數(shù)百萬，其中大部分可通過器官 移植延長生命。從供體器官來源來分，器官移植可分為同種同基因移植(如自體移植、孿生 子之間的移植)、同種異基因移植、以及異種移植。目前絕大多數(shù)臟器移植均為同種異基因 移植。由于人體主要組織相容抗原(MHC抗原)的高度多樣性，不可避免地造成供體臟器抗 原與受體免疫系統(tǒng)不相容，手術后產(chǎn)生嚴重排斥反應。急性排斥反應是最常見的一種移植排斥反應，屬于遲發(fā)型變態(tài)反應的細胞免疫現(xiàn) 象，是移植物的HLA抗原刺激受者T淋巴細胞使之分化增殖，產(chǎn)生大量具有特異性的致敏淋 巴細胞，可直接殺傷或通過釋放各種淋巴因子殺傷靶細胞，排斥移植物?，F(xiàn)認為體液免疫也 參與急性排斥反應。組織病理學改變?yōu)檠軆?nèi)膜損傷和纖維素樣壞死伴單核細胞浸潤。急 性排斥反應經(jīng)過及時正確的處理，80-90%能被逆轉(zhuǎn)。T淋巴細胞是特異性免疫應答反應最重要的功能細胞，在免疫識別、免疫反應啟 動、效應階段，以及免疫調(diào)節(jié)的過程中，無不起著重要的作用。器官移植排斥反應基本上屬 于特異性免疫應答反應，移植免疫學研究表明，T細胞是急性移植排斥的主要效應細胞。環(huán) 孢霉素A、0KT3等現(xiàn)代免疫移植劑及通過廣泛作用于T細胞而發(fā)揮抗移植排斥作用。但是， 由于這些藥物作用不具有特異性，因而增加了感染和惡性腫瘤發(fā)生的幾率，在一定程度上 抵消了移植的治療效果。雖然免疫耐受是移植研究的終極目標，但是開發(fā)特異性作用于活 化T細胞的免疫抑制劑成為移植研究的更現(xiàn)實目標。研究發(fā)現(xiàn)，IL-2是免疫系統(tǒng)中重要的信號分子，其受體表達是同種抗原反應性T 細胞活化的關鍵步驟。⑶25是IL-2受體的alpha鏈。一般情況下，靜止T細胞和B細胞不 表達⑶25。但是在發(fā)生排斥的病人，外周血T細胞和移植物局部浸潤T細胞表達⑶25明 顯增加，排斥前和排斥過程中活化的T細胞分泌的游離的IL-2Ra在血清中增加；而且，抗 ⑶25抗體體外可以抑制MHC不匹配淋巴細胞的混合反應及CTL產(chǎn)生。⑶25抗體能夠干擾 IL-2結合到其高親和受體上，有效地與IL-2競爭，抑制IL-2啟動的T細胞增殖反應，從而 選擇性地抑制了免疫應答，防止了同種異體排斥反應。因此，CD25抗體是一種可用于預防 器官移植排斥反應的抗體。然而，單獨使用單抗的治療效果并不理想，人們很快開發(fā)出了以單抗或細胞因子 為導向部分，與經(jīng)修飾的毒蛋白相連，對靶細胞進行殺傷作用的免疫毒素。第一代免疫毒素是通過化學偶聯(lián)，以二硫鍵將完整的單抗與經(jīng)過修飾的毒蛋白相連而合成。經(jīng)化學偶聯(lián)的 免疫毒素需要單獨制備抗體和毒素，異源性高，毒性強，并且分子量很大( 200kDa)，導致 其穿透實體腫瘤的能力很差，從而大大影響了其在腫瘤治療中的應用。第二代的免疫毒素 是由完整的單抗與經(jīng)修飾的或不完整的毒素組成。由于毒素蛋白經(jīng)修飾毒性降低，動物較 容易耐受，但缺陷依然存在。隨著分子生物學技術的發(fā)展，重組免疫毒素應用而生，利用DNA 重組技術，將異源的scFv基因與經(jīng)削減的毒素基因融合并克隆到合適的載體上，在大腸桿 菌中翻譯出單鏈嵌合蛋白，因此又稱為基因工程免疫毒素。將免疫毒素克隆到適當?shù)谋磉_ 載體中，在大腸桿菌中得到高效轉(zhuǎn)錄和翻譯，而且表達周期短，具有操作簡便、成本低廉、易 于控制和大規(guī)模生產(chǎn)的特點?？贵w攜帶毒素導向具有特異抗原的腫瘤組織，與靶細胞上的 抗原結合，毒素內(nèi)化，催化性地使核糖體失活，抑制蛋白合成，殺死細胞。因此，本領域仍需 要提供一種高效低毒的免疫毒素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的第一個技術問題是提供一種分離的多肽，包含抗人單克隆抗體 ⑶25的單鏈抗體ScFv，以及與所述單鏈抗體ScFv偶聯(lián)的免疫毒素PE38KDEL，以彌補現(xiàn)有技 術的不足。本發(fā)明需要解決的第二個技術問題是提供一種編碼上述多肽的DNA分子。本發(fā)明需要解決的第三個技術問題是提供一種表達上述DNA分子的載體。本發(fā)明需要解決的第四個技術問題是提供一種被上述表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明需要解決的第五個技術問題是提供一種預防和/或治療T細胞介導的疾病 的藥物組合物。本發(fā)明需要解決的第六個技術問題是提供一種多肽在制備預防和/或治療T細胞 介導的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明第一方面提供了一種分離的多肽，該多肽包含抗人單克隆抗體CD25的單 鏈抗體ScFv，以及與所述單鏈抗體ScFv偶聯(lián)的免疫毒素PE38KDEL，所述單鏈抗體ScFv具 有重鏈可變區(qū)-接頭-輕鏈可變區(qū)的結構，其中所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :1所示的氨 基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列；所述免疫毒素PE38KDEL 具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。單克隆抗體可用本領域技術人員熟知的各種方法來制得。例如，單克隆抗體可 用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature, 256 =495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方 法(美國專利No. 4，816，567)制得。單克隆抗體也可用例如Clackson等，Nature, 352 624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991)所述的技術從噬菌體抗體庫 中分離獲得。本發(fā)明所用的術語“單鏈Fv”或〃 ScFv"或“sFv”抗體包括抗體的VH和VL區(qū)， 其中這些區(qū)在一條多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽還包括VH和VL區(qū)間的多肽接頭，該接頭可 使ScFv形成結合抗原所需的結構。關于ScFv綜述可見Pluckthim在《單克隆抗體藥理 學》(The Pharmacology of Monoclonal antibodies), 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編輯， Springer-Verlag, New York，269—315 頁(1994)。
本發(fā)明中的綠膿桿菌外毒素(PE)，是66KD的單鏈蛋白，氨基末端構成Ia區(qū)，為細 胞結合結構區(qū)域，Ib (365-404)，是介于II與III區(qū)之間的小分子，功能不清楚，但去除后不 影響毒素的活性。第253-364氨基酸組成II區(qū)，負責毒素的轉(zhuǎn)位。III區(qū)，405-613，具有 ADP核糖基化活性。PE及衍生物到達細胞，在受體或抗體受體介導下內(nèi)吞，在胞內(nèi)蛋白水解 酶的作用下I、II區(qū)被去除，III區(qū)轉(zhuǎn)移入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，再轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)。將PE的I區(qū)去除，再將 PE分子的羧基REDLK突變?yōu)镵DEL，即PE38KDEL，其細胞毒生物學活性可提高6_10倍。本發(fā)明提供了一種多肽，該多肽是由單鏈抗體ScFv和免疫毒素PE38KDEL通過共 價鍵或接頭來連接。它們的前后次序或位置可以互換。本發(fā)明還提供了編碼上述多肽的DNA分子，含有該DNA分子以及與所述序列操作 性相連的表達調(diào)控序列的表達載體，以及被所述表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明另一方面還提供了制備上述多肽的方法，該方法包括a)提供表達載體， 該表達載體含有上述DNA分子序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列；b)用步驟a) 所述的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；c)在適合所述多肽表達的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主 細胞；和d)分離純化獲得所述多肽。本發(fā)明的多肽可由本領域技術人員根據(jù)常規(guī)手段來獲得。首先，可根據(jù)本發(fā)明提 供的序列信息用化學合成或PCR等常規(guī)獲得上述DNA分子。然后，用本領域熟知的各種方法 通過選擇合適的酶切位點將該DNA分子插入表達載體中使其與表達調(diào)控序列操作性相連。 “表達調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達的序列，其包括與目標核苷酸序列操作性 相連的啟動子和終止信號，通常還包括核苷酸序列適當翻譯所需的序列?！安僮餍韵噙B”是 指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。本發(fā)明中所用的表達載體是本領域技術人員已知的各種市售的表達載體。隨后， 用上述獲得的表達載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞。“宿主細胞” 一般包括原核細胞和真核細胞。 常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細 胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳的哺乳動物細胞是許多可購得的無限增殖細胞系。這 些無限增殖細胞系包括但不局限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、Vero細胞、海拉細胞、幼倉 鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(如H印G2)和其它許多細胞系。用表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法有很多種，所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿 主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞中的方法是本領域所知的，其包括葡聚糖介導的轉(zhuǎn) 染、磷酸鈣沉淀、Polybrene (1,5- 二甲基-1，5- 二氮i^一亞甲基聚甲溴化物)介導轉(zhuǎn)染、原 生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。然后，在適合多肽表達的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細胞。然后用常規(guī)的免疫球 蛋白純化步驟，如蛋白A-S印harose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水 層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明 的多肽。本發(fā)明另一方面還提供了一種預防和/或治療T細胞介導的疾病的藥物組合物， 該組合物藥學上有效量的上述多肽以及藥學上可接受的載體。在較佳的實施方案中，該藥 物組合物中還可含有與本發(fā)明的多肽聯(lián)用的其它化療藥物和放療藥物。本文所用的術語 “藥學上可接受的”是指當分子本體和組合物適當?shù)亟o予動物或人時，它們不會產(chǎn)生不利 的、過敏的或其它不良反應。本文所用的“藥學上可接受的載體”應當與本發(fā)明的多肽相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低單克隆抗體或藥物組合物的藥效?？勺鳛樗?學上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉， 如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維 素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油， 如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘 露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween ；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑； 壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。本發(fā)明的藥物組合物可用于治療T細胞介導的疾病，包括移植排斥，移植物抗機 體或機體抗移植物。


圖1 :CD25(sFv)引物設計圖，CD25-1、_2、_3、_4 引物擴增 ScFv ；圖 2 :PE38KDEL 引物設計圖，PE38-1、_2、_3、_4 引物擴增 PE38KDEL ；圖 3 :CD25-PE38KDEL 引物設計圖，用引物 CD25-1、PE38-4over_lapping PCR 擴增 CD25-PE38KDEL ；圖4 重組表達載體構建圖。圖5 :CD25-PE38KDEL免疫毒素對HUT-102細胞的殺傷活性結果。圖6 ⑶25-PE38KDEL免疫毒素對混合淋巴細胞反應的抑制作用結果。圖7 :CD25-PE38KDEL治療組與PBS對照組分別清除CD25+T細胞的對比結果。
具體實施例方式下面將結合實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。然而應當理解，列舉這些實施例只 是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。實施例1⑶25單鏈抗體及其免疫毒素基因的克隆1.實驗材料1. 1 菌株大腸桿菌 TGl 和 BL21 (DE3)。1. 2序列抗CD25單抗的重鏈和輕鏈，按照文獻Design of humanizedantibodies :from anti-Tac to Zenapax. Methods. 2005May ；36(1) :69_83 艮 的序列合成。1. 3工具酶及試劑盒限制性內(nèi)切酶購自Promega公司。Taq DNApolymerase購自 上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司和華舜公司，DNA回收試劑 盒購自華舜公司，PCR擴增試劑盒購自生工公司。pGEM-T vector購自美國Promega公司。1. 4DNA分子量標準2000bpMarker為華美公司產(chǎn)品。1. 5PCR引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。1. 6細菌培養(yǎng)試劑胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉為英國0X0ID公司產(chǎn)品。1. 7主要實驗儀器PCR 儀德國 Mastercycler gradient, Nethller-HinZ GmbH 產(chǎn)品；復日 FR-980 生 物電泳圖像分析系統(tǒng)上海復日生物實驗技術研制所產(chǎn)品；UV-2401PC紫外分光光度計(上 海分析儀器總廠，UV755B型)；_80°C低溫冰箱美國REVCO, Asheville, N, C產(chǎn)品；細菌培
6養(yǎng)搖床上海離心機械研究所產(chǎn)品2.實驗方法2. 1引物設計選擇抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的適當位置，分別設計4條特異性引 物，用來克隆單鏈抗體和免疫毒素的抗體部分；選擇PE40毒素的適當位置分別設計4條引 物，用來克隆PE38KDEL毒素和免疫毒素的毒素部分。引物序列如下
引物
CD25引物 輕鏈引物
1:5’ ACGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCACCCTGT(SEQ ID NO 5) 2 5‘ACCAGAGCCACCACCGCCAGAGCCACCACCACCTTTGACCTCCACCTT (SEQ ID NO 6)重鏈
3:5’ -TCTGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGTTCTCAGGTGCAGCTG(SEQ ID NO 7) 4:5’ -CAGCGCGGCCAGGCTGCCGCC AGAGGAGACGGTGACCAGGGT(SEQ ID NO 8) PE38引物
1:5’ -CCCTGGTCACCGTCTCCTCTGGCGGCAGCCTGGCCGC GCT G_3’ (SEQ ID NO 9)
2:5’ -GTCGCCGCTGTCCGCCGGGCCGTTGGCCGCGCCGGCCTC-3，(SEQ ID NO 10) 3:5’ -GAGGCCGGCGCGGCCAACGGCCCGGCGGACAGCGGCGAC-3，(SEQ ID NO 11) 4 :5’ -GTCGCCGCTGTCCGCCGGGCCGTTGGCCGCGCCGGCCTC-3，(SEQ ID NO 12) 引物所處的位置如圖1、2和3所示。
2.2重疊PCR PCR均采用熱啟動，⑶25重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的擴增條件是 940C 5min，94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，72°C 5min，30 個循環(huán)。PE 毒素序列中由于 GC 含量高達70%以上，用普通的PCR很難擴增，因此選用Takara公司專門用來擴增GC含量高 的 DNA 聚合酶，其 PCR 條件是 94°C lmin，94°C 30s, 60°C 50s, 72°C lmin，72°C 5min，30 個循環(huán)。2.3質(zhì)粒的構建2. 3. 1連接反應1)分別取適量以DNA回收試劑盒回收DNA片段、經(jīng)匹配末端限制 性內(nèi)切酶線性化的載體DNA(兩者末端濃度比為1 1-1 2) ；2)加連接緩沖液1.0 μ 1、 T4DNA連接酶1 μ 1，加水至10 μ 1 ；3) 16°C連接過夜；4)鋪板，形成具有相應抗生素抗性的
單克??；2. 3. 2感受態(tài)細菌的制備1)挑取單一菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 過夜，制備過夜菌；2)按1 100將過夜菌接種到LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)約3h，OD值 為0. 3-0. 6時停止培養(yǎng)；3)菌液加入1. 5ml Ependorf管，1. 5ml/管，離心，lkrpm, Imin,沉 淀細菌，棄上清；4)加入冰預冷的IOOmM CaCl2溶液，200μ 1/管，冰浴30min ；5)離心沉淀 細菌，lkrpm, Imin,棄上清，加入冰預冷的IOOmM CaCl2溶液，100 μ 1/管；6)冰浴Ih以上， 備用。2. 3. 3轉(zhuǎn)化1)取一個Ependorf管，加入DNA連接物2 μ 1、感受態(tài)細菌100μ 1，冰 浴Ih ；2)42°C熱休克3min，冰浴2min ；3)加液體LB培養(yǎng)基200 μ 1，37°C振蕩培養(yǎng)45min ；4) 取100 μ 1涂布于含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，晾干；5) 37°C倒置培養(yǎng)過夜；2. 3. 4重組質(zhì)粒的提取1)挑取數(shù)個轉(zhuǎn)化的單菌落，每個菌落分別接種于5ml含 50 μ g/ml的抗生素LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；2)離心收獲細菌，IOkrpm, Imin ；3)質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒；4)電泳檢測質(zhì)粒質(zhì)量，測0D260/0D280決定質(zhì)粒含量。2. 3. 5重組質(zhì)粒的酶切鑒定1)取Ependorf管，依次加入約5 μ 1 IOX酶切緩沖 液、2yg質(zhì)粒、Ιμ 酶1、1μ1酶2，以滅菌去離子水補充至50 μ 1 ；2)置37°C，lh;3)瓊脂 糖凝膠電泳檢測；3.實驗結果3. IDNA 的擴增采用常規(guī)PCR技術順利擴增了 CD25的單鏈抗體及用來構建免疫毒素的抗體部分。 PCR擴增結果與預期吻合。同時擴增PE38序列。擴增序列大小與預期吻合。將上述PCR 產(chǎn)物膠回收，取CD25-l-linker和linker_PE38KDEL膠回收產(chǎn)物進行重疊(over-lapping) PCR。3. 2序列測定和分析將上述PCR擴增產(chǎn)物克隆到pGEM -T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，用藍白斑篩選陽 性克隆測序。將測序結果正確的克隆保存，用于表達載體的構建。另外，CD25重鏈可變區(qū) 序列顯示在SEQ ID NO :1中，CD25輕鏈可變區(qū)序列顯示在SEQ IDNO 2中，PE38KDEL毒素 序列顯示在SEQ ID NO :3中。單鏈抗體(ScFv)基因結構是由抗體基因的VH和VL通過非共價鍵或二硫鍵連接 而成，保留原有的抗原結合能力[King DJ 等.Biochem J，1993，290 (Pt3) =723-728 ；Huston JS 等.Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85 :5879_5884]，鼠源性抗體的 VH 和 VL 的基因分 別是由4個相對保守的骨架區(qū)(FR)和3個抗原互補決定區(qū)(CDR)組成，CDR區(qū)編碼的氨 基酸相互作用共同構成抗原結合位點，也決定了每種抗體的特異性。FR區(qū)呈β片層排 列，堿基組成和排列順序比較穩(wěn)定，因此可以根據(jù)FRl和FR4的堿基組成和排列順序擴增 VH和VL基因的寡核苷酸引物，用編碼易折疊的寡核苷酸接頭將二者連接成VH-Iinker-VL 即 ScFv [ColcherD 等.Ann N Y Acid Sci, 1999,880 263-280 ；Zu Putlitz J 等· Biochem BiophysRes Commun, 1999, 24 (255) :785_791]，將此基因克隆入原核或真核表達載體中并 在原核或真核細胞系統(tǒng)中表達，其產(chǎn)物即為ScFv。通用的連接肽有很多，連接肽必須能使 輕、重鏈可變區(qū)自由折疊，使抗原結合位點處于適當?shù)臉嬓汀Ｍ瑫rLinker盡可能減少蛋白 酶的攻擊，并防止單鏈抗體的聚集。Linker長度以14-25個氨基酸殘基為適，目前最常用 的連接肽是由Huston根據(jù)X線晶體衍射分析抗體可變區(qū)結構和計算機輔助分析結果設計 的具有剛性結構的 15肽序列(G4S) 3 [Mansfield E 等.Blood，1997，90 (5) =2020-2027], Glockshuber等單鏈抗體在大腸桿菌中表達，并能自發(fā)折疊成天然構象，而其抗原的親和力 幾乎和原來的完整抗體一樣，其穩(wěn)定性比通過二硫鍵相連的Fv片段提高近60倍。ScFv的 研究為進一步制備鼠_人嵌合基因工程抗體和人源化重構抗體奠定了基礎。將ScFv與毒 素連接構成融合蛋白的研究意義重大，是近幾年研究的熱門課題。由于ScFv分子量小，免疫原性小，特異性強，親和力較高，組織穿透力強等優(yōu)點 [Niv R等.Int J Cancer，2001，94 :864-872]，在其基因3，端接上與毒素、酶、細胞因子，構 成重組免疫毒素，可以作為良好的導彈，對腫瘤細胞發(fā)揮殺傷作用[Van der Poel HG等.J Urol, 2002,168 :266_272 ；Matsumoto H等.Anticancer Res, 2002, 22 :2001_2007]。對于一 個特定的scFv，其穩(wěn)定性主要是由VH-VL間相互作用的性質(zhì)和強度以及連接肽的類型決定 的。柔性的連接肽使各個scFv中的VL和VH與附近抗體分子的VH和VL或其它的粘性表面之間不斷的結合和解離，因而易于發(fā)生聚合和沉淀等現(xiàn)象[Reiter Y等ProteinEng. 1995， 12 1323-1331]。制備免疫毒素的抗體最好屬于IgG類，因為IgM類抗體難于毒素偶聯(lián)，偶 聯(lián)后的免疫毒素產(chǎn)量和活性均低。⑶25的抗原是理想的靶點，因此將抗⑶25抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過 連接肽(G4S) 3連接起來，構建⑶25的單鏈抗體，然后又用連接肽將⑶25的單鏈抗體與 PE38KDEL毒素連接，構建天然的新的免疫毒素CD25-PE38KDEL，為下一步研究腫瘤的靶向
治療奠定基礎。發(fā)明人采用常見的over-lapPCR技術將兩個DNA片段連在一起。由于PE38KDEL DNA中GC含量很高，這給PCR擴增帶來很大困難，用常用的DNA聚合酶和PCR常規(guī)條件很難 擴增出對應的片段，于是選用專門用來擴增GC含量高的DNA序列的DNA聚合酶，成功地擴 增了 PE38KDEL和CD25-PE38KDEL。DNA基因重組技術的使用，使制備單鏈抗體和單鏈抗體 免疫毒素在二周內(nèi)即可實現(xiàn)，大大縮短了導向藥物的制備時間，成本較低，操作方便，改善 培養(yǎng)條件，大腸桿菌能表達并裝配和折疊具有高生物活性的免疫毒素。實施例2 免疫毒素CD25-PE38KDEL的表達純化免疫毒素原核表達載體構建成功后，轉(zhuǎn)化BL21，挑選高表達陽性克隆，原核表達， 收集細菌，用His-Ni++和分子篩純化，用蛋白電泳和Iowry酚法鑒定純化效果。1.實驗材料1. 1 菌株大腸桿菌 TGl 和 BL21 (DE3)。1. 2細菌培養(yǎng)試劑LB培養(yǎng)基氯化鈉、胰蛋白胨、酵母提取物購自英國OXOID公
司ο1. 3IPTG購自上海華舜生物有限公司。1. 4Chelating sepharose Fast Flow and Superdex75resin 購 自 AmershamPharmacia Biotech(USA)01. 5主要儀器設備AKTA FPLC (Amersham pharmacia biotech) ；Vertical electrophoresissystem(Pharmacia Hoefer Biotech Inc,San Francisco CA,U. S. A,mini VE 型)Electrophoresis Power Supply (amersham Pharmacia biotech, EPS601 型)；Mini Trans-Blot Cell (BI0-RAD 公司)；UV-2401PC 紫外分光光度計(SHIMADZU)2.實驗方法2. 1免疫毒素CD25-PE38KDEL的誘導表達當發(fā)明人成功構建了免疫毒素⑶25-PE38KDEL的原核表達載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌BL21，在LB培養(yǎng)基中表達，37°C擴增，待0D600在0. 6 0. 8之間時，用IPTG誘導(終 濃度為lmmol) 4小時，分別在誘導前后取樣。4000轉(zhuǎn)/min離心30min，棄上清收集細菌菌 體。-20°C保存，進行下一步的純化工作。2. 2 免疫毒素 CD25-PE38KDEL 的純化1)將收集的細菌菌體用50mmol Tris (pH7. 5) (lg菌體用20液體重懸)重懸， 4°C超生破碎菌體，高速離心(10000轉(zhuǎn)/min) 30min收集可溶性上清和包涵體，取小樣進 行SDS-PAGE蛋白電泳；2)將高速離心得到的包涵體用8M尿素、0. IMNaH2PO4^O. OlTris (pH 8. 0)室溫變性2小時，10000轉(zhuǎn)/min離心30min,收集上清；3)將收集的上清用0. 45um的濾膜過濾準備用His-Ni++金屬鏊合柱純化；4)裝IOml的His-Ni++金屬鏊合柱，用5個柱 體積的水沖洗后，用5柱體積的平衡液(8M尿素、0. 1M0. IM NaH2P04、0. OlTrisUOmmol咪唑 PH 8.0)平衡，上樣(流速為2ml/min) ；5)上樣完備后，再用5柱體積的平衡液(8M尿素、 0. IM NaH2P04、0. OlTrisUOmmol咪唑pH 8. 0)平衡，然后用5小時將8M尿素的平衡液逐步 減為OM尿素的平衡液，此為蛋白的柱上復性過程；6)蛋白柱上復性完成后，用5柱體積的 洗脫液(0.02M PB，0.5M咪唑)洗脫，收集蛋白峰。蛋白電泳檢測其純化情況；7)將洗脫收 集的蛋白再進行分子篩(20mmolPB)純化，收集蛋白峰，進行電泳，確定對應的目的蛋白。
2. 3免疫毒素CD25-PE38KDEL的濃度測定和純度鑒定 對純化的蛋白采用SDS-PAGE蛋白電泳和280nm紫外讀數(shù)法和Iowry酚法檢測純 度和濃度。2. 3. 1蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)1)15%凝膠電泳，制膠后按預定順序加樣，每孔加15μ 1，在甘氨酸電泳緩沖液中 初始以60V電壓進行電泳；2)當樣品進入分離膠時將電壓改為150V，直至溴酚藍跑出膠的 底部。取出凝膠在染色液中室溫染色4小時；3)在脫色液中脫色，每隔1小時換脫色液一 次，充分脫色后，干膠。2. 3. 2蛋白濃度測定1)根據(jù)紫外測定值，稀釋樣品至合適濃度，用Lowry酚法測免疫毒素蛋白濃度，配 置標準蛋白質(zhì)溶液(lmg/ml)，從1000 μ g/ml開始稀釋為1000,500,250,125,62. 5 ；2)樣品 也大概從1000 μ g/ml開始稀釋5個濃度。3)以標準蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，光密度(OD75tl) 值為縱坐標，繪制標準曲線。3.實驗結果3. 1免疫毒素CD25-PE38KDEL的誘導表達將構建好的免疫毒素表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，待0D600在0. 6 0. 8之間 時，加入IPTG，37°C誘導表達4小時，4°C離心收集細菌，將誘導前后的細菌裂解，取樣進行 SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)誘導后有明顯的誘導條帶，而且蛋白分子量大小與預期蛋白分子量一 致。將收集的菌體重懸后在冰水中超聲碎菌，高速離心收集上清和包涵體，蛋白電泳顯示其 表達形式以包涵體為主。3. 2 免疫毒素 CD25-PE38KDEL 的純化根據(jù)蛋白電泳顯示免疫毒素主要是以包涵體形式表達。對于包涵體變性，常用的 變性劑主要有尿素(8M)、鹽酸胍(GdnHCl 6-8M)，通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白 間的氫鍵而增溶蛋白。采用8M尿素變性包涵體(室溫2小時)，離心收集上清，過濾后用 His-Ni++金屬鏊合柱純化，將目的蛋白結合到親和柱上，緩慢地去除平衡液中的尿素，即為 柱上復性的過程，最后用洗脫液洗脫收集蛋白峰，將收集的蛋白在用分子篩純化，最后將純 化的免疫毒素⑶25-PE38KDEL及其突變體蛋白進行SDS-PAGE電泳。3. 3免疫毒素CD25-PE38KDEL及其突變體的純度和濃度測定將收集的蛋白洗脫峰進行SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)其純度大于90%，可以滿足實驗要 求。結合蛋白電泳、280nm紫外讀數(shù)法和Iowry酚法定量蛋白濃度，它們濃度在0. 24-0. 5mg/ ml之間。本實施例成功地構建了免疫毒素⑶25-PE38KDEL的原核表達載體，并進行了表達純化。使用的表達載體是pET32a，得到的蛋白是融合蛋白，其主要是以包涵體為主。包涵體 變性、復性是本部分的難點。目前，對于包涵體變性，常用的變性劑主要有尿素(8M)、鹽酸胍(GdnHC16-8M)，通 過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。去垢劑如強的陰離子去垢劑 SDS，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問題是由于SDS無法徹底的去 除而不允許在制藥過程中使用。極端pH:可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白。如有人在 pH> 9.0溶解牛生長激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這 些方法只適合于少部分蛋白的增溶。變性劑的使用濃度和作用時間一般在偏堿性的環(huán)境 中，如pH8. 0-9. 0，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，一般不要超過pHl. 0。有些蛋白只能用鹽酸胍 如IL-4。增溶時一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。復性通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復到正常的折疊 結構，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復性過程開始，到2M 左右時結束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M時復性過程已經(jīng)結束。復性中常 采用的方法有稀釋復性直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑 稀釋速度太快，不易控制。透析復性好處是不增加體積，逐漸降低外透液濃度來控制變性 劑去除速度，易形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無法應用到生產(chǎn)規(guī)模。超濾復性在生產(chǎn) 中較多的使用，規(guī)模較大，易于對透析速度進行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且 有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。柱上復性是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中 應用的一種復性方法，如華北制藥的G-CSF復性是通過柱上復性進行的。常用于復性的層 析方法有SEC、HIC等。復性是一個非常復雜的過程，除與蛋白質(zhì)復性的過程控制相關外， 還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關，有些蛋白非常容易復性，如牛胰RNA酶有12對二 硫鍵，在較寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)?其進行復性的方法如IL-11，很多蛋白的復性效率只有百分之零點幾。一般說來，蛋白質(zhì)的 復性效率在20%左右。影響復性效率的因素有蛋白質(zhì)的復性濃度，變性劑的起始濃度和去 除速度、溫度、PH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等[Giovane， C.等.J.Mol.Recognit. 1999，12 :141-152 ;Ben Khal ifa 等，J. Mol. Recognit. 2000，13 127-139 ；Christensen, L. L. Anal.Biochem. 1997，249 153-164 ；Lilie, H.等·Curr. Opin. Biotechnol. 1998,9 :497_501]。復性效果的檢測根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等 方面對蛋白質(zhì)的復性效率進行檢測。1、凝膠電泳一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠 電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的 蛋白復性后二硫鍵的配對情況。2、光譜學方法可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性 光譜(CD)等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用于復性研 究中的過程檢測。3、色譜方法如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不 同，4、生物學活性及比活測定一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性 蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體 內(nèi)活性。5、黏度和濁度測定復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露， 一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。6、免疫學方法如ELISA、TOSTERN等，特別 是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)[Fischer，B.等，.Arzneimittelforschung. 1992,42 1512—1515 ；Buchner, J.等.Anal. Biochem. 1992,205 263-270 ；Rogl, H.等，F(xiàn)EBS Lett. 1998,423 21-26 ；Mihic, S. J.等· BioTechniques. 1996， 20 804-808 ；Werner, Μ. H.等· FEBS Lett. 1994，345 125-130 ；Batas, B.等· Biotechnol. Bioeng. 1996,50 16-23]。根據(jù)目前包涵體變性、復性存在的問題，本發(fā)明者選擇價格便宜的尿素為變性 劑，復性方法采用柱上復性[Colangeli R.等.J. Chromatography B 1998,714:223-235; Rapid and efficient purification and refolding of a(His)6-tagged recombinant protein produced in E. coli as inclusion bodies,18-1134-37, Amersham Pharmacia Biotech]。根據(jù)純化結果和下一部分的活性檢測結果，該方法是成功的。這樣，僅用二步純 化法和His-Ni++柱上復性得到了目的蛋白，既節(jié)省了時間又減少了目的蛋白的損失。實施例3 HUT-102細胞殺傷試驗1.材料和試劑臺式離心機Eppendorf公司產(chǎn)品生物安全柜臺灣造鑫公司產(chǎn)品細胞培養(yǎng)箱美國Revco，Asheville, N, C產(chǎn)品培養(yǎng)瓶、離心管、移液管、移液器、無菌吸嘴細胞培養(yǎng)試劑小牛血清為杭州四季青生物工程研究所產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基和 DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品。磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)及含小牛血清的PBS(PBSS)。測活細胞株HUT-102細胞(ATCC TIB162)，含10 %新生小牛血清(NBS)的 RPMI-1640/DMEM(1 1)培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)于25_75cm2方瓶中。培養(yǎng)條件37°C，5% CO2，飽和濕度。2.方法⑶25-PE38KDEL用無酚紅培養(yǎng)液稀釋至2 μ g/mL,并連續(xù)2倍比稀釋。對數(shù)生長期的HUT-102細胞，離心棄上清，無酚紅培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至2X IO5/ ml，然后將細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，0. Iml/孔。CD25-PE38KDEL的序列稀釋液加入上步96孔培養(yǎng)板中，0. Iml/孔，每一濃度設2 復孔，培養(yǎng)液為空白對照，細胞培養(yǎng)箱反應4-6小時。取各孔上清50 μ 1/孔，轉(zhuǎn)入另一 96孔板相應孔中，加入細胞殺傷檢測試劑，細胞 培養(yǎng)箱反應30分鐘，酶標儀讀取0D490nm。3.結果分析采用分析軟件Select2. 2擬合標準曲線橫坐標為工作參考品或待測樣品的濃 度，縱坐標為OD值的平均數(shù)，曲線為“S”形，因此選用4參數(shù)方程回歸模型。該軟件給出的回歸方程為Y= (A-B)/[1+(X/C)D]+B根據(jù)該方程，X = +①時，Y = B，即最高限；當X = O時，Y = A，即最低限；而當X =C時，Y = (A+B)/2,即半數(shù)有效。因此C的數(shù)值即為半數(shù)有效濃度(EC50)。4.實驗結果我們用HUT-102細胞檢測了 CD25-PE38KDEL免疫毒素的殺傷活性，EC50為30ng/ml，如圖5所示。實施例4⑶25-PE38KDEL免疫毒素對混合淋巴細胞反應的抑制作用1.檢測原理混合淋巴細胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte culture，MLC)或稱混合淋巴細胞反應 (mixed lymphocyte reaction, MLR)是來源于兩個個體的淋巴細胞在體外混合培養(yǎng)時，由 于細胞表面HLA-II類抗原中的D和DP抗原不同，可相互刺激對方淋巴細胞轉(zhuǎn)化(稱為雙 向MLC)，并產(chǎn)生多種淋巴因子，促進NK、CTL、LAK等殺傷細胞活性。若將刺激的一方淋巴細 胞先用絲裂霉素COiiitomycine C)或放射線照射處理，使該細胞失去增殖能力，但仍保持刺 激對方淋巴細胞增殖能力的試驗稱為單向MLC ；如不加上述處理，則雙方互相刺激，稱為雙 向MLC。MLC反應可通過3H-TdR摻入率或形態(tài)學檢測法以及MTT法檢測反應細胞的增殖能 力。在淋巴細胞相互刺激轉(zhuǎn)化的過程中，若以CD25免疫毒素殺傷IL-2受體陽性細胞，則能 夠抑制MLR。2.材料和試劑2. 1玻璃纖維濾膜及負壓抽濾裝置，閃爍液及液閃計數(shù)儀。2. 2 3H-TdR 中科院上海原子核研究所產(chǎn)品，比放射活性30Ci/mmol，放射性濃度 lmCi/mL。2. 3其余材料和試劑與體外刺激活化的人外周血單個核細胞競爭結合試驗相同3.實驗方法3.1分別取三位健康志愿者(A、B及C)肝素抗凝靜脈血10mL，用淋巴細胞分層 液密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，經(jīng)無血清的RPMI-1640洗3次，每次 1000r/min 離心 IOmin03. 2用含20% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2. OX 105/mL。3. 3 含 20 % FCS 的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)液稀釋 CD25-PE38KDEL 至 1000pg/mL，并繼 續(xù)稀釋至濃度分別為100、10及l(fā)pg/ml。3. 4三個不同個體的淋巴細胞懸液，每兩種(AB、BC及AC)分為一組，檢測雙向 MLR，于96孔細胞培養(yǎng)板中各孔加入每組兩種細胞懸液各50yL，最弱反應對照(min)加入 同一個體的單個核細胞100 μ 1。3. 5將樣品的稀釋液加入上述96孔細胞培養(yǎng)板，100 μ 1/孔，最強反應對照(max) 孔(分別為含每組兩種不同的淋巴細胞的孔)加入含20% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液， 100 μ 1/孔，最弱反應對照也加入含20% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，100 μ 1/孔，設置3 個復孔，37°C，5% 0)2溫箱培養(yǎng)6d。3. 6終止培養(yǎng)前20h每孔加入0. 5 μ Ci3H-TdR03. 7用細胞收集器將細胞吸附在玻璃纖維濾紙片上，用生理鹽水充分洗滌，洗去游 離的3H-TdR ；將濾紙片烘干后，用鑷子按其順序分別依次放入盛有閃爍液的塑料管內(nèi)；β 閃爍儀自動測定樣品lmin。4.試驗結果試驗結果表明，本發(fā)明所提供的CD25-PE38KDEL免疫毒素在0. 01ng/ml表現(xiàn)出抑 制作用，有效抑制混合淋巴細胞反應，如圖6所示。實施例5 CD25-PE38KDEL免疫毒素對同種異體移植動物模型排斥反應的抑制作
13用l.hu-SPL-SCID 小鼠的建立4-6周齡的SCID小鼠用、射線照射(200rad)后腹腔注射人新鮮脾細胞(108/ 只)，在接種后的數(shù)天內(nèi)小鼠眼眶采血以測定人脾細胞在小鼠PBMCs中的比例。選擇人脾細 胞(Spleens)與鼠PBMCs的比例在5% -20%之間的小鼠選使用。這樣的人化SCID小鼠命 名為hu-SPL-SCID小鼠。2.皮膚移植實驗 將皮膚組織移植到接種了人脾細胞1 Id后的hu-SPL-SCID小鼠的胸腔背側，每塊 皮膚均分別移植到不同的實驗組。在進行了皮膚移植后當天給予各實驗組動物腹腔注射50 u g/d的CD25-PE38KDEL 或PBS對照(持續(xù)5天)。移植實施7d后每天用盲法評價各實驗組移植皮膚的存活狀態(tài)， 連續(xù)觀察30d，然后每星期觀察一次，80d后處死小鼠。移植皮膚的狀態(tài)可分為0-4級。0 級移植皮片完整柔軟有光澤；1級皮片柔軟但有小面積的色素沉著；2級皮片柔軟但有 大面積的褪色；3級皮片變硬；4級皮片變硬皺縮失去光澤。當移植皮片的狀態(tài)被評定為 3級以上時判為移植排斥。3. CD25-PE38KDEL 清除 CD25+T 細胞的能力⑶25-PE38KDEL發(fā)揮其免疫抑制作用的最重要機制是控制、清除參與排斥反應 的CD25+T細胞，為了考察各人源化抗體在人化SCID小鼠體內(nèi)的免疫抑制作用，我們按 給小鼠注射⑶25-PE38KDEL，每日眼眶采血，檢測外周血中人⑶25+T細胞的數(shù)量，檢測 CD25-PE38KDEL對CD25+T細胞的清除能力。4.結果表1移植物存活時間
存活時間
受試動物編號-
PBS對照組CD25-PE38KDEL治療組
#18d37d#210d51dm8d28d#49d80d#5lid63d CD25-PE38KDEL治療組與PBS對照組分別清除CD25+T細胞的對比結果如圖7所
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1權利要求
免疫毒素CD25 PE38KDEL的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟，(A)將抗CD25抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過連接肽(G4S)3連接起來，構建CD25單鏈抗體ScFv，然后用連接肽將CD25單鏈抗體ScFv與PE38KDEL毒素連接，獲得新的免疫毒素CD25 PE38KDEL序列；(B)構建表達含有步驟A中所述免疫毒素CD25 PE38KDEL序列的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21；(C)將步驟B中的大腸桿菌BL21誘導表達、菌體破壁、離心收集，獲得免疫毒素CD25 PE38KDEL包涵體；(D)將步驟C中獲得的免疫毒素CD25 PE38KDEL包涵體于室溫使用8mol/l尿素溶液變性2小時，離心變性液，將收集的離心上清使用濾膜過濾備用；(E)His Ni++金屬螯合柱用平衡液平衡，將步驟D中過濾備用的離心上清上樣至His Ni++金屬螯合柱，上樣完備后再用平衡液平衡，然后將平衡液中的尿素含量緩慢降至0mol/l；和(F)使用洗脫液洗脫步驟E中的His Ni++金屬螯合柱，將洗脫收集的蛋白再進行分子篩純化，最終獲得免疫毒素CD25 PE38KDEL蛋白。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟A中所述CD25單鏈抗體ScFv具有 重鏈可變區(qū)-接頭-輕鏈可變區(qū)的結構，其中所述重鏈可變區(qū)具有SEQID NO :1所示的氨基 酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，步驟A中所述PE38KDEL毒 素具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟D中使用的8mol/l尿素溶液的配 方為 8mol/l 尿素、0. lmol/lNaH2P04、0· 01mol/l Tris, ρΗ8· 0。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟E中使用的平衡液配方為8mol/l 尿素、0. lmol/lNaH2P04、0. 01mol/l Tris、10mmol/l 咪唑，pH 8. 0。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟F中使用的洗脫液包含0.02mol/l PB和0. 5mol/l咪唑溶液。
6.使用如權利要求1-5中任一項所述的制備方法獲得的免疫毒素CD25-PE38KDEL。
7.一種預防和/或治療T細胞介導的疾病的藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有 權利要求6所述的免疫毒素⑶25-PE38KDEL以及藥學上可接受的載體。
8.權利要求6所述的免疫毒素CD25-PE38KDEL或權利要求7所述的藥物組合物在制備 預防和/或治療T細胞介導的疾病的藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，其中所述的T細胞介導疾病為移植排斥反應。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的多肽，包含抗人單克隆抗體CD25的單鏈抗體ScFv，以及與所述單鏈抗體ScFv偶聯(lián)的免疫毒素PE38KDEL。本發(fā)明還提供了編碼上述多肽的DNA分子、含有該DNA分子的表達載體、宿主細胞和制備方法，并公開了該多肽在制備治療T細胞介導的疾病的藥物中的用途，以及含有該多肽的藥物組合物。
文檔編號C12N1/15GK101979593SQ20101024500
公開日2011年2月23日 申請日期2007年4月23日 優(yōu)先權日2006年4月26日
發(fā)明者候盛, 寇庚, 李晶, 郭亞軍 申請人:上海中信國健藥業(yè)股份有限公司