。將運一過程總計重復(fù)6次。稀釋的系列為1、4、16、 64、256、1024、4096倍。
[0206] (2-5)抗原抗體反應(yīng)
[0207] 分別準(zhǔn)備對49〇6、49〇41八3、7^、因子山〇-2-1進(jìn)行測定的分析用96孔過濾板和對 C4進(jìn)行測定的分析用96孔過濾板，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。
[0208] 在分析用96孔過濾板中加入200μ1的洗涂緩沖液，使用平板振蕩器(Μ · BR-022, TAITEC公司），W1，2(K)rpm在室溫下攬拌10分鐘。然后，使用歧管，抽濾除去洗涂緩沖液。在 所使用的全部孔中加入25μ1的分析緩沖液，再加入25μ1的珠稀釋液。接下來，在分析樣品用 孔、標(biāo)準(zhǔn)樣品用孔、QC樣品用孔、背景測定用孔中加入25μ1的各樣品。在背景測定用孔中加 入分析緩沖液。將板密封后，用平板振蕩器進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。ΑροΕ、ΑροΑ1、C3、TTR、因子Η、 α-2-Μ測定用板在室溫下進(jìn)行2小時抗原抗體反應(yīng)。C4測定用板在4 °C下進(jìn)行16小時抗原抗 體反應(yīng)。
[0209] (2-6)清洗W及測定
[0210] 抗原抗體反應(yīng)后，抽濾除去溶液，再加入20化1的洗涂緩沖液，將抽濾除去重復(fù)3 次，進(jìn)行珠的清洗。清洗后，在所使用的全部孔中加入25μ1的檢測抗體，將板密封，用平板振 蕩器在室溫下攬拌1小時，進(jìn)行二次抗體反應(yīng)。反應(yīng)后，加入25μ1的鏈霉親和素-藻紅蛋白， 進(jìn)行密封，用平板振蕩器在室溫下攬拌30分鐘。反應(yīng)后，抽濾除去溶液，再加入20化1的洗涂 緩沖液，將抽濾除去重復(fù)3次，進(jìn)行珠的清洗。在各孔中加入10化1的銷液，在室溫下攬拌5分 鐘后，通過Luminex 200?化皿inex Corp. ,USA)進(jìn)行巧光測定。血清樣品中的標(biāo)記物的定量 解析是使用通過χΡΟΝΕΝΤ 3.1軟件化uminex Co巧.，USA)、由標(biāo)準(zhǔn)樣品求出的標(biāo)準(zhǔn)曲線的計 算式進(jìn)行定量。
[0211] (3)結(jié)果
[0212] 對所檢測的標(biāo)記物蛋白質(zhì)在NDC群、MCI群、AD群間血清中的存在量是否存在差異 進(jìn)行差異解析。表1是通過2對t檢定對各癥例群進(jìn)行檢定，給出顯著水平為p<0.05時的P值。 補體C3(C3)在NDC和MCI的對比、NDC和AD的對比、MCI和AD的對比中均有顯著差異，可知對將 認(rèn)知功能障礙疾病(MCI、AD)患者與非認(rèn)知功能障礙(NDC)患者相區(qū)分是有用的。另外，可知 載脂蛋白Al(ApoAl)、甲狀腺素運載蛋白（TTR)對將AD患者區(qū)分于NDC是有用的。載脂蛋白E (ApoE)、補體因子Η(因子H)、α-2-巨球蛋白（α-2-Μ)、補體C4(C4)在任一疾病組都不顯示顯 著差異。
[0213] 為了對所檢測的標(biāo)記物蛋白質(zhì)的有用性達(dá)到何種程度進(jìn)行評價，通過受試者操作 特性曲線（receiver operating characteristic curve,R0C曲線）進(jìn)行分析。R0C曲線的下 部的面積值(R0C的AUCKW下稱為AUC)越接近1，作為生物標(biāo)記物的有用性越高。制作MC巧口 NDC、AD和NDC的比較中的R0C曲線，對顯示AUC在0.6 W上的標(biāo)記物蛋白質(zhì)進(jìn)行解析，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)C3、ApoAl、TTR顯示AUC在0.6 W 上。表2 中給出 C3、ApoAl、TTR 的 NDC 和MCI、NDC 和AD 的 AUC。 [0214]圖1、圖2、圖3給出C3、ApoAl、TTR運3個標(biāo)記物蛋白質(zhì)的差異解析和R0C曲線。圖1的 A)是差異解析圖，通過NDC和MCI進(jìn)行比較時，MCI中C3顯著減少(t檢定、P值0.034)，通過NDC 和AD進(jìn)行比較時，AD中C3顯著減少（t檢定、p值1.668E-4)。進(jìn)而，通過MCI和AD進(jìn)行比較時， AD中C3顯著減少(t檢定、P值0.01)。圖1的B似及C)是通過NDC和MCI、NDC和AD進(jìn)行比較時的 ROC曲線。通過NDC和MCI進(jìn)行比較時的AUC為0.663，通過NDC和AD進(jìn)行比較時的AUC為0.834。 圖2的A)是ApoAl的差異解析圖，通過NDC和AD進(jìn)行比較時，AD中C3顯著減少（t檢定、P值 0.049)。圖2的B)W及C)是通過NDC和MCI、NDC和AD進(jìn)行比較時的R0C曲線。通過NDC和MCI進(jìn) 行比較時的AUC為0.649，通過NDC和AD進(jìn)行比較時的AUC為0.673。圖3的A)是TTR的差異解析 圖，通過NDC和AD進(jìn)行比較時，AD中C3顯著減少(t檢定、P值5.81化-4)。圖3的8)^及〇是通 過NDC和MCI、NDC和AD進(jìn)行比較時的R0C曲線。通過NDC和MCI進(jìn)行比較時的AUC為0.677，通過 NDC和AD進(jìn)行比較時的AUC為0.730。
[0215]針對C3、ApoAl、TTR運3個標(biāo)記物蛋白質(zhì)，為了就相對于NDC，精度更良好地區(qū)分 MCI、AD的組合進(jìn)行解析，進(jìn)行了試驗例2。
[0216] [表 1]
[0217]
[0220] [1]來自載脂蛋白A1的膚(ApoAlK序列號1)
[0221] 〔完整蛋白質(zhì)/膚）
[0222] 0001 MKAAVLTI.AV LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDR￥KDLAT VYVDVLKDSG 0051 RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE Oi〇] KHTFGI.RQEM SKDLE巨VKAK VQPYLDBFQK KWQEEMELYR QKVEPL民八EL 0151 UEGAROKLHE LUEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAFY SDELRQRLAA 020! RLFALKHNGG ARLAFYHAKA TEHLSTLSFK AKPALFDLR〇 GLLPVLESFK 0251 V S F L S ALEE Y TKKLNTQ
[0223] [2]來自甲狀腺素運載蛋白的膚(TTRK序列號2)
[0224] 〔完整蛋白質(zhì)/膚）
[0225] 0001 MASH民LLLLC LAGLVFVSEA GPTGTGESKC PLMVKVLDAV 民GSPMNVAV 0051 HVFRKAADDT WEPFASGKTS ESGELHGLTT EEEFVEGIYK YEIDTKSYWK 0101 AT.GTSPnir.TI AEVVFTANDS GPRRYTTAAL LSPySYSTTA VVTNPKE
[0226] [3]來自補體C3的膚(C3)(序列號3)
[0227] 〔完整蛋白質(zhì)/膚）
[022引 0001 MGPTSGPSLL LLLLniLPLA LGSPMYSHT 腳正民 LCSEC TMVLRAHDAO 0051 GDVPVTVTVH DFPGKKXVLS S丘腳VLTPAT NHM娜VTFTI PANREFKSEK 0101 G民NKFV]VU\ TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL F巧ΤΟΚΠΥΤ PGSTVLYRIF 0151 TVNHKLLPVG RTVMVNTENP FX：iTPVK〇DSL SS〇NQLC.VLP LSWDIPELVN 肥01 MGQWKJRAYY ENSPQQVKT EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG
[0229] 0251 LEVTITARFL YGICKVEOTAF V 圧煙 QDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV 0301 VLSRKVLLDG VQNPRAEDLY GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AE 民SGIPIVT 0351 SPYQIHFTKT PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPm VQGnOTVQSL 0401 TQGDGVAKLS INTHPSQKPL SITV 民 TKKQE LSEAEQAT 民T MOAI.PYSTVG 0451 NSNNYLHLSV LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKTRYY TYLIMNKGRI. 0501 LKAGRUVREP GQDLVVXPLS ITTD 打 PSF 及 LVAYYTLIGA SGQREVVADS 0551 VWVDVKDSCV GSLVVKSGQS [mQPVPGQQ MILKmCDUG ARVVLVAVDK ()601 GVrVLNKKNK LTQS"\W)VV E齡扣好CTPG SC;[y)YA(rW^ DAGLTFTSSS 0651 (乂)QTM;)RAnL QCPQPAARRR RSVQLTHKRM DKVGKYmTL KKCCEDGMRE 0701 NPiviRFSCQ 民民 TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELR 民 QHA 民 ASHLGLARSN 0751 LDEDIIAEEN IVSRSEFFES WLWNVEDLiCE PPKNGISTKX MNIFLKDSrr 0801 TWHLAVSMS DKKGICVADF FEVTVMQDFF IDL 民 LPYSVV 反NEQVEI 民 AV 085 I LYNY民QNQEL ICVRVELLHNP AFCSLATTK及氏HQQTVTIPP KSSLSVPYVT 0901 VPLKTGLQEV EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPF 0951 RLG 民 EGVUKE DIPPADLSL)。VPDTESETRl LLUGTi，VA(：)M TEDAVDAE民L 1001 KHLIVTPSGC GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGL及
[0230] ICROGALELIIC 1051 KGYTUULAFR yPSSAFAAFV KRAPSTVVLTA YVVKV巧LAV NLIAmSOVL nui CGAViaV.ULE WKWWFQE DAPVIWEMl GULRNNNEKD MALTAFVLiS 1151 L〇EAI(DICEE QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA lAGYALAQMG 1201 民LKGPLLNKF LTTAKDKN民W EDPGKULYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP 1251 f'VVRW說EQ及 YYUGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQiOMPD島Q ELNLDVSLQL 1301 PS 民 SSKITHR IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG π SVVTMYHA 1351 KAKDQLTCNIC FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEiCT 艮 Y 艮GDQDATM 1401 SILDISMMTG FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK 1451 VSHSEDDCLA FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT 民 FYHPEKEDG 1501 KLMCLCRDEL C及CAEENC巧 QKSDDKVTLE ERLDKLAC邸G VDYVYIO瓜 LV !55l KVQLSNDFDE YiMAiCQTHC SGSDEVQVGQ QRTFlSPiKC RE八LKLEEKK 1601 IIYLMWGLSSD rWGCKPNLSY IIGKDTWVE打 W陽